ジーンと遺伝子ターゲティング
現代生物学で最も広く使用されるツールの 1 つは分子を一緒に結合することができる DNA のフラグメント間の互換性のある端を作成する制限酵素クローニングです。ただし、この手法には、大規模または複雑な DNA 構造生成のための適用を制限する特定の制限があります。これらの欠点のいくつかに対処する新しい手…
相同組換え、ジーン、クローニングとハイスループット遺伝子工学を実施する研究者の能力が大幅に向上します。古典の特に長い方のシーケンス、genomic DNA のストレッチなどから地域を特定する場合は常に一意に興味と地域内ではなく、シーケンスのどこかの地域の周りカット、制限酵素がクローニング ベクトルの消化を必要し「組み換え」互換性のある端を生成する同じ制限の酵素と挿入します。これらの制限のサイトの必要性を回避することでは、ジーンは遺伝子工学構造にするより効率的でコスト効果の高い方法を提供します。
このビデオでは、遺伝的組換えの原則を導入するして標的遺伝子のベクターでは、ジーンの一般的なプロトコルを提供し、これらの技術のいくつかのアプリケーションを議論します。
まず、どのような再結合は、それを適用する方法を説明しましょう。
遺伝子組換え DNA の分子の間で情報の交換が伴います。「相同組換え」では、類似または同一の DNA シーケンスの比較的大規模なストレッチが交換されます。セルは二重鎖切断の修復にこのプロセスを使用し、真核生物は有性生殖を行なうも遺伝的多様性を高めるための減数分裂時の相同染色体の間これを運ぶ。
相同組換えは、数のセルの特定の内因性遺伝子座の変更を含め、実験目的に利用されています —「遺伝子ターゲッティング」と呼ばれるそれはまた遺伝的構造の工学、生物のゲノムにターゲット DNA の大規模なストレッチに変更を加える場合に特に便利である「ジーン」と呼ばれるプロセスに適用されます。これを行うには、研究者は、各コンテナーの長い DNA を「ゲノム ライブラリ"またはベクトルのセットの使用の断片。様々 な種類の細菌のクローンで通常伝達容量が異なるライブラリは作成されているし、商業的または非営利のリポジトリから注文することができます。ゲノム ライブラリーの最も一般的に使用されるタイプの 1 つは細菌人工染色体または BAC 150 350 kilobases 間挿入サイズを運ぶことができると呼ばれます。
順番に recombineer、構成科学者必要性どの相同組換えにおける生物が発生します。酵母酵母は当然のことながら「再結合-有能」と容易にベクトルの一致する組み変えを遂行し、挿入できます。別の広く用いられているシステムは、細菌エシェリヒア属大腸菌の再構成のバクテリオファージ lambda から「赤」タンパク質を使用します。ベクトルは、recombineered 以前に確立された赤を表現する菌株、またはプラスミッドのエンコーディング赤システム コンポーネントは、細菌にジーン基板共同変換できますのいずれかをすることができます。
今、ジーンによって標的遺伝子のベクトルを作成するためのプロトコルを見てみましょう。
このプロトコルの目的は、対象の変更特定の遺伝子と遺伝子組み換えマウスを作成することです。簡潔に、興味の遺伝子に必要な変更は、BAC; で作られています変更されたシーケンスがターゲット ベクトルに「取得」、このベクターは遺伝子ターゲティングのための胚性幹細胞にトランスフェクションします。幹細胞は、遺伝子組み換え動物を生成する使用できます。この最後の手順については、ゼウスの科学教育を参照してくださいビデオ「遺伝子工学モデル生物の。」
まず、興味のゲノム シーケンスを含む BAC クローンは識別し、注文します。次に、相同の腕、または 30-50 basepair 相同領域を含むオリゴヌクレオチド設計されています。これらのオリゴヌクレオチドは、興味の遺伝子を変更するために使用「カセット」の DNA を生成する PCR 反応のプライマーとして使用されます。これらのカセット通常含まれます、たとえば、多くの公に利用可能なプラスミドから容易に増幅することができます選択のマーカーとして使用できる抗生物質耐性遺伝子。BAC の細菌のクローン、によって変換されます、たとえばエレクトロポレーション、プラスミドの相同性腕を含むカセットに続いて赤いシステム コンポーネントをエンコードします。細菌は、組換えを誘導するために適切な温度で培養しました。
BAC から変更されたシーケンスを回復するには、「検索」のベクトルが線形化されるとカバーに変更されたサイトの周りいくつかの kilobases ホモロジー腕を含むプライマーを用いて増幅します。このベクター バックボーンは BAC の細菌のクローンに変換され、ジーンは再度誘導されます。ベクトルは BAC から適切なシーケンスを「取得」には「ギャップ修復」なります。これは、結果、変更されたシーケンスを囲むゲノム DNA 相同性の高い領域と同様に、関心の変更されたシーケンスを含む標的遺伝子ベクトル。このベクター精製、線形およびできる胚性幹細胞内生的相同組換え機械、宿主ゲノムの変更により、対応する軌跡に変更されたシーケンスを対象に導入します。
再結合に基づく技術のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。
最初に、研究者は、迅速かつ簡単にたとえば細菌ゲノムをエンジニア リングする、タンパク質複合体を研究するジーンを使用できます。ここでは、カナマイシンの抵抗選択マーカーと同様に連続したペプチドのアフィニ ティー タグをエンコード カセットは興味の遺伝子の端に 3 ¢ recombineered をできるように設計されました。このベクトルは赤い「組換え有能」エシェリヒア属大腸菌に導入し成功 recombinants を選択培地を用いた分離しました。タグ付きタンパク質生化学的精製したタンパク質タグに強く結合し、分析を使用して興味の蛋白質の相互作用のパートナーを識別するために質量分析法による。
ジーンと遺伝子を義務づける細胞内寄生虫トキソ プラズマ症トキソ プラズマ症を引き起こすなどの寄生生物のゲノムを変更する使用もできます。本研究でターゲット ベクトルは興味の遺伝子の並ぶゲノムが配置されて、選択マーカーいます酵母、recombineered だった。ベクトルは線形化し、寄生虫に electroporated。限界希釈培地のめっきは、寄生虫の相同組換え機械が設計されたシーケンス、従って興味の遺伝子の削除にゲノム配列に置き換えられて成功の recombinants を分離する使用されました。対象となる地域の PCR は、肯定的な再結合イベントを確認しました。
最後に、どのギャップ修理やカセット挿入の工夫がされていますさらに挿入、または SPI、subcloning として知られているプロシージャ同時に発生するより簡単なより柔軟なジーン プロセスを作るします。このプロセスの成功にとって重要です適切な複数の相同性デザイン腕、最大 180 bp は、組み換え効率を高めるために従来のジーンより長く。Subcloning プラスミド、PCR による挿入カセットに相同性腕を組み込む後、彼らは一緒に赤を表現する BAC クローンに変身した、ジーンが誘導されました。正常に recombineered 構造 PCR または制限のダイジェストの分析によって識別されました。
ジーンにゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオでは、組換えと遺伝子工学、ジーン プロジェクト、およびこれらの技術の最終的にいくつかのアプリケーションのためのプロトコルでの使い方の原則について説明しました。いつも見てくれてありがとう!
相同組換え、ジーン、クローニングとハイスループット遺伝子工学を実施する研究者の能力が大幅に向上します。古典の特に長い方のシーケンス、genomic DNA のストレッチなどから地域を特定する場合は常に一意に興味と地域内ではなく、シーケンスのどこかの地域の周りカット、制限酵素がクローニング ベクトルの消化を必要し「組み換え」互換性のある端を生成する同じ制限の酵素と挿入します。これらの制限のサイトの必要性を回避することでは、ジーンは遺伝子工学構造にするより効率的でコスト効果の高い方法を提供します。
このビデオでは、遺伝的組換えの原則を導入するして標的遺伝子のベクターでは、ジーンの一般的なプロトコルを提供し、これらの技術のいくつかのアプリケーションを議論します。
まず、どのような再結合は、それを適用する方法を説明しましょう。
遺伝子組換え DNA の分子の間で情報の交換が伴います。「相同組換え」では、類似または同一の DNA シーケンスの比較的大規模なストレッチが交換されます。セルは二重鎖切断の修復にこのプロセスを使用し、真核生物は有性生殖を行なうも遺伝的多様性を高めるための減数分裂時の相同染色体の間これを運ぶ。
相同組換えは、数のセルの特定の内因性遺伝子座の変更を含め、実験目的に利用されています —「遺伝子ターゲッティング」と呼ばれるそれはまた遺伝的構造の工学、生物のゲノムにターゲット DNA の大規模なストレッチに変更を加える場合に特に便利である「ジーン」と呼ばれるプロセスに適用されます。これを行うには、研究者は、各コンテナーの長い DNA を「ゲノム ライブラリ"またはベクトルのセットの使用の断片。様々 な種類の細菌のクローンで通常伝達容量が異なるライブラリは作成されているし、商業的または非営利のリポジトリから注文することができます。ゲノム ライブラリーの最も一般的に使用されるタイプの 1 つは細菌人工染色体または BAC 150 350 kilobases 間挿入サイズを運ぶことができると呼ばれます。
順番に recombineer、構成科学者必要性どの相同組換えにおける生物が発生します。酵母酵母は当然のことながら「再結合-有能」と容易にベクトルの一致する組み変えを遂行し、挿入できます。別の広く用いられているシステムは、細菌エシェリヒア属大腸菌の再構成のバクテリオファージ lambda から「赤」タンパク質を使用します。ベクトルは、recombineered 以前に確立された赤を表現する菌株、またはプラスミッドのエンコーディング赤システム コンポーネントは、細菌にジーン基板共同変換できますのいずれかをすることができます。
今、ジーンによって標的遺伝子のベクトルを作成するためのプロトコルを見てみましょう。
このプロトコルの目的は、対象の変更特定の遺伝子と遺伝子組み換えマウスを作成することです。簡潔に、興味の遺伝子に必要な変更は、BAC; で作られています変更されたシーケンスがターゲット ベクトルに「取得」、このベクターは遺伝子ターゲティングのための胚性幹細胞にトランスフェクションします。幹細胞は、遺伝子組み換え動物を生成する使用できます。この最後の手順については、ゼウスの科学教育を参照してくださいビデオ「遺伝子工学モデル生物の。」
まず、興味のゲノム シーケンスを含む BAC クローンは識別し、注文します。次に、相同の腕、または 30-50 basepair 相同領域を含むオリゴヌクレオチド設計されています。これらのオリゴヌクレオチドは、興味の遺伝子を変更するために使用「カセット」の DNA を生成する PCR 反応のプライマーとして使用されます。これらのカセット通常含まれます、たとえば、多くの公に利用可能なプラスミドから容易に増幅することができます選択のマーカーとして使用できる抗生物質耐性遺伝子。BAC の細菌のクローン、によって変換されます、たとえばエレクトロポレーション、プラスミドの相同性腕を含むカセットに続いて赤いシステム コンポーネントをエンコードします。細菌は、組換えを誘導するために適切な温度で培養しました。
BAC から変更されたシーケンスを回復するには、「検索」のベクトルが線形化されるとカバーに変更されたサイトの周りいくつかの kilobases ホモロジー腕を含むプライマーを用いて増幅します。このベクター バックボーンは BAC の細菌のクローンに変換され、ジーンは再度誘導されます。ベクトルは BAC から適切なシーケンスを「取得」には「ギャップ修復」なります。これは、結果、変更されたシーケンスを囲むゲノム DNA 相同性の高い領域と同様に、関心の変更されたシーケンスを含む標的遺伝子ベクトル。このベクター精製、線形およびできる胚性幹細胞内生的相同組換え機械、宿主ゲノムの変更により、対応する軌跡に変更されたシーケンスを対象に導入します。
再結合に基づく技術のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。
最初に、研究者は、迅速かつ簡単にたとえば細菌ゲノムをエンジニア リングする、タンパク質複合体を研究するジーンを使用できます。ここでは、カナマイシンの抵抗選択マーカーと同様に連続したペプチドのアフィニ ティー タグをエンコード カセットは興味の遺伝子の端に 3 ¢ recombineered をできるように設計されました。このベクトルは赤い「組換え有能」エシェリヒア属大腸菌に導入し成功 recombinants を選択培地を用いた分離しました。タグ付きタンパク質生化学的精製したタンパク質タグに強く結合し、分析を使用して興味の蛋白質の相互作用のパートナーを識別するために質量分析法による。
ジーンと遺伝子を義務づける細胞内寄生虫トキソ プラズマ症トキソ プラズマ症を引き起こすなどの寄生生物のゲノムを変更する使用もできます。本研究でターゲット ベクトルは興味の遺伝子の並ぶゲノムが配置されて、選択マーカーいます酵母、recombineered だった。ベクトルは線形化し、寄生虫に electroporated。限界希釈培地のめっきは、寄生虫の相同組換え機械が設計されたシーケンス、従って興味の遺伝子の削除にゲノム配列に置き換えられて成功の recombinants を分離する使用されました。対象となる地域の PCR は、肯定的な再結合イベントを確認しました。
最後に、どのギャップ修理やカセット挿入の工夫がされていますさらに挿入、または SPI、subcloning として知られているプロシージャ同時に発生するより簡単なより柔軟なジーン プロセスを作るします。このプロセスの成功にとって重要です適切な複数の相同性デザイン腕、最大 180 bp は、組み換え効率を高めるために従来のジーンより長く。Subcloning プラスミド、PCR による挿入カセットに相同性腕を組み込む後、彼らは一緒に赤を表現する BAC クローンに変身した、ジーンが誘導されました。正常に recombineered 構造 PCR または制限のダイジェストの分析によって識別されました。
ジーンにゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオでは、組換えと遺伝子工学、ジーン プロジェクト、およびこれらの技術の最終的にいくつかのアプリケーションのためのプロトコルでの使い方の原則について説明しました。いつも見てくれてありがとう!
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Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.