コットンボールワームでデンソウイルスのホストフィットネス上のホスト組織分布、伝送モード、および効果を調査するためのプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、デンソウイルスであるHaDV2がその宿主であるワタボロボウに及ぼす影響を研究することです。この方法は、ウイルスが宿主に対して経路を立っている影響など、ウイルスホストの相互作用フィールドにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。幼虫がウイルスの陽性株と陰性株を構築するために使用するこの技術の主な利点は、同じpar-ne-co-hostsに由来し、同じ遺伝的背景を確保します。

実験を開始するには、綿ガーゼで覆われたペアごとにプラスチックケージを使用して、新たに囲まれた蛾の8つのシングルペアの交配を行い、良好な換気を確保し、卵子位置の基質として機能します。ウイルスフリーのコロニーを得る可能性を高めるためには、少なくとも30組のシングルペアの交配を利用します。成虫の蛾に10%の砂糖と2%のビタミン溶液を染み込ませたコットンボールを与え、毎日溶液を補充します。

今日の交尾後、雌の成虫が綿ガーゼに卵を産むと、毎日ガーゼを交換し始めます。卵が孵化するまで、成虫の蛾と同じ成長室でガーゼを含む卵を集めて維持します。新たに孵化した幼虫を、ウェルごとに1個体ずつ新しい24ウェルプレートに直ちに移します。

最初の産卵日から5日後に、親蛾を集めて液体窒素で保存します。特定のプライマーを使用したPCRを使用して親のHaDV2を確認し、HaDV2フリーの個体をHaDV2フリーの非感染株として保持します。成虫の蛾を個別に収集し、すぐに液体窒素に保管します。

滅菌した乳鉢と乳棒を使用して、収集した個々の蛾を液体窒素で完全に粉砕します。約10マイクログラムの破片をきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、残りの破片を新しいチューブに移し、すぐに摂氏80度で保管します。

10マイクログラムの破片からDNAを、メーカーが提供するプロトコルに従って抽出します。蛾のDNAが単離されたら、プロトコルを使用してHaDV2を確認します。結果に応じて、残りの破片をHaDV2陽性とHaDV2陰性の2つのグループに分けます。

1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各個体に加えて、残りの幼虫の破片を完全に溶解します。遠心分離機を摂氏4度に予冷し、ホモジネートを回転させます。氷上で、0.22ミクロンのメンブレンフィルターで液体上清をろ過します。

ろ過した液体のチューブあたり200マイクロリットルを収集し、すぐに摂氏80度で保管します。HaDV2 を含む液体を希釈することにより、異なる濃度の HaDV2 感染ろ過液体による経口感染効率を決定すること。ヒュームフード内に、固形人工飼料の表面に各濃度のろ過された液体を含む200マイクロリットルのHaDV2を均等に広げます。

次に、孵化したばかりの100匹の幼虫を、シャーレ内の人工飼料を含むHaDV2に移し始めます。孵化したばかりの幼虫が入った綿ガーゼをそっとたたき、ガーゼから幼虫を白い紙に移します。幼虫が絹を回転させて紙から膨らむように、紙をそっとたたきます。

滅菌した鉗子を使用して絹に触れ、幼虫をペトリ皿に移します。48時間後、人工飼料のウェルごとに1匹の幼虫を24ウェルプレートに移します。HaDV2を接種した幼虫を、成虫期と同じ濃度で再投与します。

プロトコルを使用して、成人のHaDV2感染状態を確認します。HaDV2のマイクロリットルあたり10〜8番目のコピー数を接種した成人は、100%の感染をもたらし、HaDV2陽性株として維持されます。汚染を防ぐために、鉗子とハサミを75%エタノールで3回滅菌し、アルコールランプの炎で加熱します。

分析天びんを使用して、組織の保管に使用する空のチューブの重量を量ります。次に、感染した株の幼虫と成虫の蛾を氷の上に約5分間置きます。凍結した幼虫を膀胱腫に固定します 頭と最後の腹部セグメントの近くのセグメント間膜に挿入された2つの昆虫ピン。

次に、後腹部で、幼虫の前脚を切って血リンパ液が流れ出るようにします。ピペットを使用して、約10秒以内に約10マイクロリットルの幼虫の血リンパをピペットで動かし、血リンパの褐変と凝固を防ぎます。.はさみで、最後の分節間膜から頭までの範囲のキューティクルに切開を行います。

2つの鉗子を使用して、前腸、中腸、後腸、脂肪体、およびマルピーギ尿細管を解剖します。解剖中に残りの組織が血リンパで汚染されるのを防ぐために、解剖した組織をPBSバッファーで洗浄します。3人の組織サンプルを1つのレプリカントとして混合します。

すぐに各組織を液体窒素中のチューブに移します。PBS緩衝液を含む清潔なペトリ皿で、女性と男性の成人の組織を解剖し、すぐに各組織を液体窒素中のチューブに移します。チューブと上記の組織を別々に計量し、組織の質量を計算します。

これらの組織からDNAを抽出し、kPCRを実施して各組織のウイルス力価を定量化します。少なくとも100匹の蛹または非感染株に由来する新たに出現した成虫の蛾を、綿ガーゼで覆われた5リットルの金網ケージに入れます。2日後、交配した成体の雌は綿ガーゼに卵を産み始めます。

卵が入った綿ガーゼを集めて保管します。非感染株の新生児幼虫をHaDV2を含む人工飼料に移し、感染株を樹立することにより、新生児幼虫の接種を進める。同様に、新生児の幼虫をHaDV2を含まないろ過液で覆われた人工食に移し、対照群である非感染株を確立します。

各処理に少なくとも240匹の幼虫を含めます。.48時間後、ウェルごとに1匹の幼虫を24ウェルプレートに移します。各ウェルの各幼虫に順番に番号を付け、インスターステージと生存状態を毎日記録します。

約5日後、人工食が劣化したら、これらの個体を同時に新しい人工食を含む新しい24ウェルプレートに移します。分析天びんを使用して、7日目から11日目までの幼虫の体重を量ります。秤量後、幼虫を個別に24ウェルプレートに戻します。

孵化後約10日で5番目のインスターに脱皮したら、幼虫をガラス管に移します。毎日同時に個人をガラス管に移します。5番目の幼虫は、頭部嚢の幅によっても識別できます。

次に、塗料またはマーカーを使用して、ガラス管に各幼虫に元の参照番号をコード化します。幼虫の状態を毎日記録します。ガラス管に各個体の蛹と産卵日を記録し、3日齢の蛹の質量を記録します。

脱落後、10%のスクロースと2%のビタミン溶液を含む1つのケージに1人の女性と1人の男性を入れます。.スクロース溶液を毎日補充します。各蛾の死亡日を記録します。

卵を産むときは、綿ガーゼを毎日交換してください。すぐに卵の数を数えます。最後に、孵化したばかりの子孫を数えます。

実験で使用した試料の品質を確保するために、トライアルを実行しました。HaDV2フリーの雄と雌の両親からの子孫を非感染株として飼育しました。私たちは、同じDNAテンプレートを使用して、親と子孫のアクチン遺伝子を増幅することに成功し、DNAテンプレートが高品質であることを示唆しています。

無作為に選ばれた8つの子孫は、HaDV2、HaNPV、およびボルバキアも含んでいませんでした。出発物質の品質の対数と得られたCT値との関係を定義する標準曲線は、CT値とHaDV2の初期遺伝子コピー数の対数との間に強い線形相関を示しています。HaDV2のコピー数は、各組織のマイクログラムあたりに計算され、特定の組織の総HaDV2力価の割合は、HaDV2が主に脂肪体に分布していることを明らかにしました。

この手順を試みるときは、エンタイヤ手順中に孵化した後の最初の5日間は、繊細な幼虫を取り扱うことを忘れないでください。