Name: 後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ後根神経節インジェクションと後根損傷法により、成体ラットの感覚軸索再生と遺伝子治療を研究する。脊髄損傷を回避しつつ中枢神経系での軸索再生を評価できる動物福祉に配慮した手法である。

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この作品は、クリストファーとデイナ・リーブ財団、医学研究評議会、欧州研究評議会ECMneuro、ケンブリッジNHMRC生物医学研究センターからの助成金によってサポートされていました。私たちは、撮影時の彼らの技術支援のためのヘリーン・メレルバン「トンSpijkerとユスティナバラットに心から感謝の意を表したいと思います。私たちは、AAVの生産を支援するために博士エリザベス・モロニー教授ジョースト・バーハーゲン（神経科学のためのオランダ研究所）に感謝したいと思います。

以下のすべての動物の手順はイギリスの動物に従って行った（科学的処置）法1986これらの手続きに慣れていない場合は、全国/地域の規制にチェックして、プロトコルを開始する前に、獣医の助言を求めてください。 1.動物の適切ひずみを選びます注：感覚と足求心路遮断の損失の後根挫滅損傷の結果。前足の求心路遮断の一般的な副作用は、オーバーグルーミング、自傷、および足の自切を含めることができます。 <ol><li>手続きのために動物を取得します。 注：ラットの場合、そのようなリスター・フードおよびWistar系などのより活性な株は、このようなルイスとのSprague-Dawley系のような、より従順株と比較して、求心路遮断後の足自切の発生率が高いです。可能であれば、最も従順な歪み、ルイスは、常に最初に考慮しなければなりません。特に活性株は、遺伝mまでの実験のために必要でなければなりませんodificationまたは特定の行動評価の要件は、獣医学的治療が期待される悪影響に対処するための場所である必要があります。 </li></ol> 2.注射用ウイルスの準備注意：生物学的および実験室安全規定に従ってすべてのウイルスを処理します。 <ol><li>個々のウイルスパッケージングプロトコル9以下、2×10 12ゲノムコピー（GC）/ mLの力価にウイルスを希釈または濃縮します。 注記：ここでは、ウイルスは、5％のスクロースをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で希釈しました。力価は、ウイルスの種類に応じて最適化する必要がある、プロモーター、サイズを構築、および細胞型を標的にします。 </li><li>オプション：後で注入を簡単に可視化のためのウイルス液に1％着色染料（ 例えば、ファストグリーン）を追加します。非常に優しくソリューションを混ぜます。 </li><li> （4時間以内）すぐに使用氷上で溶液を維持または長期のために-80℃の冷凍庫で長期保存。 </li></ol> 3.動物の術前の準備を行います注：手術の極端な侵襲性のため、無菌技術を常に使用する必要があります。 <ol><li>手術を開始する前に、すべての手術器具および脊髄定位フレームを準備し、滅菌します。例えば、134℃のオートクレーブ中でツールを殺菌します。各動物のための滅菌のツールの新鮮なセットを使用してください。 </li><li>動物を麻酔。引っ込め反射またはまぶたの反射のために角膜に触れることによって、テストするために足をつまんで、適切な麻酔を確認してください。 <ol><li>例えば、イソフルランなどの吸入麻酔を用いて、成体ラットについて、2.0 Lの4％イソフルランを使用/誘導のための酸素の分。過剰または過少投与を避けるために、動物の呼吸パターンに従ってイソフルラン濃度を変える、1.5 L /酸素の分3％イソフルラン - 手術全体メンテナンスのため、2を使用します。 </li></ol></li><li>に動物が最初に麻酔し、CE、動物の術前体重を記録します。 </li><li>子宮頸部DRG注入のため、肩甲骨のすぐ遠位の耳の間から首に毛を剃り落とします。防腐剤製品と剃らエリアを消毒します。 </li><li>適切な鎮痛剤の投与量（ 例えば、5ミリグラム/ kgのカルプロフェン）および抗生物質（ 例えば、5ミリグラム/ kgのエンロフロキサシン）とともに、動物の脇腹に生理食塩水を皮下の2ミリリットルを注入します。 </li><li>手続きの際に角膜の乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。 </li><li>動物の下に配置された37℃での加熱パッド付き脊椎定位フレーム上の手術に進みます。 </li></ol> 4. DRGを注入し、後根のクラッシュ傷害の実行注：これは非常に繊細な手術です。動物の手術を生きることを進める前に、解剖学で理解するために、最初の数死んだ動物で練習することをお勧めします。 <ol><li> L肌の上に著名なC2およびT2棘突起をocate。皮膚が開かれると、白色の繊維状組織の中線は、筋肉の最初の層の上に表示されなければならない（10番のメスの刃でC2およびT2棘突起の間に皮膚切開を行い、筋肉の最初の層は、「有しますゼリー状」テクスチャ）。 </li><li>手術用メスの刃を用いた白色正中線に沿って筋肉の1層目と同様のサイズの切開を行います。そこの近くにある下行大動脈からの主要幹線の分岐があるとして、著名なT2棘突起を越えないでください。 注：重い出血以降、このステップからどこでも発生する可能性があります。必ず出血を停止し、すべての回で明確な可視化を可能にするために滅菌綿棒または外科吸収性スポンジを使用して血液を除去。手続きを進める「盲目的」後に動物に予期せぬ悪影響につながる、脊髄、DRG、または後根への不要な損傷をもたらすことができます。 </li><li>撤回2つの開創器、吻側に配置され1つずつ尾を使用して、筋肉の最初の層と筋の第2の層が、横紋外観と、表示されなければなりません。 </li><li> （二縦筋が薄く、膜状組織によって接続観察することができる）筋の第2の層の正中線を見つけます。二つの長手方向の筋肉を分離するmicroscissorsのペアを使用して膜状組織を切開。これは、不必要な筋肉の損傷や出血をもたらすことができるよう、可能な場合は手術用メスの刃を使用しないでください。 </li><li>脊椎を覆う薄い筋の第三の層を露出するために応じてリトラクターを調整します。棘突起を軽く筋の第三の層の上にピンセットで触れることによって感じることができます。 </li><li> microscissorsを使用して、筋肉の三層の上に小さな切開を行い、ゆっくりとはっきりと椎骨を露出するように横向き的にキューレットまたはメスを用いて骨から筋肉を削り取ります。必要な場合は、ラミを作るために離れて筋肉や腱の一部をカットnectomy容易になります。 </li><li>注意深く細かい骨鉗子のペアを使用して薄層と茎の一部を除去することにより、T1の椎骨 - 左C5を露出させる - C8のDRGを、C4の左半椎弓切除術を行います。 DRGは、椎骨の横孔の近くに位置しています。 注：C3 - C7椎骨が目立つ棘突起を持っていません。 C8 DRGはC7とT1椎骨の間であるC5 DRGは、C6 DRGのようにC5とC6の椎骨の間にある、そして、C4及びC5椎骨の間に配置されています。何C8の椎骨はC8 DRGの存在とC8脊髄セグメントにもかかわらず、ありません。 </li><li> DRGの十分な一回注入のために露出されている、定位シリンジホルダーにカスタムメイド、33ゲージ鈍針を取り付けたウイルスを充填したマイクロシリンジを配置することによって注射器を準備します。注射の前に、注射針の挿入を支援することを目的とDRGの各上の小さな表面的な開口部を作るために30ゲージベベル針を使用しています。 </li><li> 33-Gを挿入定位座標を調整するために穏やかにノブを回すことにより、DRGの中心部へのAuGe針。これは、流体がDRGの腹側から漏れるする原因となり、針を介して、挿入しないでください。 、発生漏洩すぐに針の位置を調整する必要があります。 注：数値の定位座標が使用されていません。しかし、注射用の針を保持するためのフレームを利用すると便利です。 </li><li>注入シリンジポンプを用いて0.2μL/分で各DRGへのウイルスの1μLを注入します。針を引き抜く前に、追加の3分間待ってください。ウイルス溶液が着色染料が含まれている場合は、注射時には、DRGはゆっくりと色が変わります。 </li><li>同時C5実行する - C8の後根圧潰損傷を、10秒間3回各完全鉗子の両端、先の細いピンセット（ボンマイクロ）のペアを使用して、各ルートをつぶします。組織内の白い線がクラッシュサイトで表示されます。 FORCで必要とされるよりも深く行ってはいけませんこのようEPSは、前根への損傷を引き起こす可能性があります。 </li><li>注入および/またはクラッシュの後、出血や動物を閉じる前に切開部位に残さ骨片の小片がないことを確認してください。好適な場合には、暴露脊髄およびDRGの上に手術用吸収性スポンジの小片を配置します。 </li><li>筋肉の第3層は縫合せずに脊椎に自然に戻って撤回することを許可します。緩く吸収6-0縫合材料と（≈3は、縫合糸を中断）は、第2の層の2つの長手方向の筋肉を縫合。筋肉の最初の層を縫合吸収6-0縫合材料と（≈5は、縫合糸を中断）。 </li><li>吸収5-0縫合材料（≈10縫合糸を中断）で皮膚を縫合。 注：縫合糸はあまりにもタイトではないことを確認してください。皮膚の膨らみは、過剰引き締めの兆候であると動物に不快感を引き起こす可能性があります。 </li><li>重い出血が手術中に発生した場合、皮下注射1 - 2地域の規制の下で許可された動物からの流体の損失を補充するための生理食塩水のミリリットル。 </li><li>食用水和ゲルを提供し、動物が麻酔から完全に回復することができ、バック保持領域に動物を戻す前に少なくとも1時間、定期的なモニタリングを行います。 </li><li>感覚軸索再生を評価するために、最適な導入遺伝子発現のために、少なくとも3週間は動物を保管してください。 </li></ol>動物の術後ケアを行う5. <ol><li>最初の一週間後に手術中の動物用食品のマッシュと柔らかい綿の寝具を提供します。必要であれば、全国/地域の規制や獣医の助言に従い、回復を支援するために鎮痛剤や抗生物質の追加的な用量を投与。 </li><li> 10日 - 7後に皮膚に縫合糸を外します。 注：手術の一般的な副作用は、切開部位に起因するかゆみのために皮膚に傷マークを血清腫や血腫の形成、内部吸収性縫合糸、微妙な感覚や運動不足、および後根挫滅損傷後の求心路遮断足に自傷の兆候。 、実質的に予想以上に深刻である任意の福祉の問題については、すぐに獣医の助言を求めます。 </li></ol> 6.軸索トレース用順行CTBの噴射を行います注：前の組織コレクションに週を追跡コレラ毒素Bサブユニット（CTB）軸索を実行することをお勧めします。 <ol><li>メーカーの指示に従って1％CTB溶液を調製します。 </li><li>オプション：後で注入を簡単に可視化するためのソリューションに1％着色染料を追加します。非常に優しくソリューションを混ぜます。 </li><li>動物を麻酔（ステップ3.2.1を参照）、テーブルに手足をテーピングすることにより、左前足を安定化させます。 </li><li>手動でゆっくりと皮下無毛フットパッドの中心に1％CTBの1μLを注入し、4桁の数字は、マイクロリットルシリンジ嵌合のWiを用いてカスタムメイド、33ゲージの短い針番目。 注：注射の前に、まず注射針の挿入を支援し、皮膚に小さな表面的な開口部を作るために30ゲージベベル針を使用することができます。 </li><li>動物が保持領域に動物を返す前に麻酔から完全に回復することを許可します。 </li></ol> 7.組織の収集<ol><li>免疫組織化学のためにウイルス注入DRGおよび脊髄を収集するために、麻酔薬の過剰投与を投与し、経冷4％パラホルムアルデヒドに続くリン酸緩衝生理食塩水で動物を灌流。慎重に、顕微鏡下で固定された組織を収集するために、背にフル椎弓切除術を行います。分析4、5、6の必要に応じて組織調製、切片、および処理を進めます。 注：Sの存在によって観察として回収切開部位は、明らかであるべきです車の組織。 </li><li>あるいは、in vitro培養のためにウイルス注入DRGを収集するために、そのような二酸化炭素の上昇する濃度として承認された方法を用いて人道的に動物を犠牲に。慎重に可能な限り無菌状態を確保すること、顕微鏡下でDRGを解剖。 4、5、6、10を所望のように組織培養を進めます。 </li></ol>

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ジェームズ・フォーセットは、アコルダ・セラピューティクスとノバルティスの有給コンサルタントです。

この記事では、我々は、成体ラットの下頸髄におけるDRG注射および後根挫滅損傷を実行するためのステップバイステップのガイドを提示します。これは非常に侵襲的で繊細な手術であるように、私たちは強く、すべての潜在的なユーザーは、動物の手術を生きるために進む前に、十分な訓練と実践を取得することをお勧めします。ユーザーは、脊髄の解剖学ではなく、周囲の筋肉組織、椎骨の構造、および血管系を持つだけでなく、理解しておく必要があります。理想的には、有能なユーザは、脊髄に損傷を引き起こすことなく、椎骨の一部を除去して清浄な椎弓切除術を行う、周囲組織に対して最小限の損傷に手順を実行することができなければなりません。脊髄損傷から明らかなように、脊髄の小さな病変は全体の神経系への広範な有害な影響を与える可能性があります。また、「クリーン」な手術を受けた動物は予想外の後に苦しむ可能性が低いです手術合併症や福祉の問題とは望ま実験の時点の前に犠牲にする必要があります可能性が低いです。 15静脈内、腹腔内16、髄腔内<s...

神経系損傷後の軸索再生を達成することは困難な作業である1。中枢神経系（CNS）における軸索再生の失敗を研究するために、研究者は神経損傷モデルの茄多を使用していました。 CNSの領域が異なるので、軸索再生を研究するために解剖学的に適切なモデルを使用することが重要です。適切なモデルを使用することにより、研究者は、「1対すべて」治療戦略とは反対に、傷害の重症度、関心の神経細胞の種類に基づいて特定の治療、および再生を評価するための必要な脊髄路を策定することができます。 脊髄損傷では、例えば、最も衰弱症状は感覚と運動の損失から生じます。運動の損失が下降運動経路への損傷によって引き起こされている間の感覚の喪失は、昇順感覚経路への損傷によって引き起こされます。これらTWの間の細胞および解剖学的な違いによるO経路、多くの標的に軸索再生の研究では、いずれか一方のみの成功回復が患者に多大な利益となることを根拠に、どちらか一方の経路に焦点を当てます。この記事では、ウイルスベクターおよび感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、成体ラットの下頸髄における同時後根挫滅損傷との直接の後根神経節（DRG）の注入を使用するプロトコルを提示します。 DRG感覚ニューロンは、周囲からCNSには、そのような触覚感覚や痛みなどの感覚情報を中継する責任があります。脊髄における感覚ニューロンの長い軸索投射は、長距離の軸索再生を研究するための良いモデルとなります。また、げっ歯類は、最小限の福祉合併症と後根挫滅損傷としての感覚経路の病変を生き残ることができるよう、研究者は完全に脊髄を病変部を必要とせずにCNSの軸索再生を学ぶことができます。四C5 - C8（頸部LEVEL 5から8）後根圧潰損傷は、前足の求心路遮断2のために有用なモデルであることが示されています。また、後根挫滅損傷は、それが、このようなグリア瘢痕形成など他の要因によって複雑ではないので、直接脊髄損傷よりも、軸索再生を研究する「クリーナー」モデルを提供します。 回生状態に神経細胞を再プログラムするウイルス遺伝子治療の使用は、ますます多くの神経学的状態3のための有望な治療戦略と考えられてきました。研究は、行動回復4、5、6とロバスト軸索再生を達成することができる成長促進タンパク質の導入遺伝子を担持するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの適用を示しています。免疫応答およびニューロンなどの非分裂細胞を形質導入する能力を誘発におけるAAVの見かけの低病原性は、作成しますその遺伝子治療のための最適のベクター。また、組換えAAV形態は、治療のために使用されます。この形態では、それは、宿主ゲノム7にそのウイルスゲノムを統合するようなレンチウイルスのような他のウイルスベクターに比べて挿入突然変異誘発のリスクを低減することができません。これは、AAV遺伝子治療用途のための安全な選択肢となります。 DRGは、感覚ニューロンの細胞体が含まれているとして、勉強および/または感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療用ウイルスの投与のための最も適切な解剖学的な目標です。異なるAAV血清型およびレンチウイルスを比較した研究では、AAV血清型5（AAV5）がDRG 8に直接注射したとき、少なくとも12週間の時間経過にわたってDRGニューロンを形質導入において最も効率的であることが示されました。さらに、AAVは、大径ニューロフィラメント200 kDaのような全てのDRGニューロンのサブタイプを、形質導入、40％以上の形質導入効率を達成することができます（NF200）陽性ニューロンと小径カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP） -またはイソレクチンB4（IB4）陽性ニューロン4,8。 DRG注射および後根挫滅損傷の手術手順としては非常に侵襲的で繊細で、我々はこの記事では、新しいユーザーは非常に効率的な方法で手順を学ぶために役立つと信じています。 C8後根挫滅損傷 - 同時C5とC7のDRGに - 本稿では、成人の4週間C6に対照ウイルスAAV5-GFP（緑色蛍光タンパク質）の注射後のラットからの代表的な結果を示しました。このモデルは、感覚軸索再生を促進するためのウイルス遺伝子療法の使用を調査している研究者のために特に適しています。

<table><tbody><tr><td>ファストグリーンFCF染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>無色の溶液を視覚化します。推奨濃度:1%</td></tr><tr><td>コレラ毒素Bサブユニット</td><td>リスト 生物学研究所</td><td>104</td><td>前向性軸索追跡用。推奨濃度:1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>吸入麻酔薬(有効成分:イソフルラン)</td></tr><tr><td>バイトリル2.5%注射用</td><td>バイエル</td><td>05032756093017</td><td>抗生物質(有効成分:エンロフロキサシン)。メーカー推奨用量:10 mg / kg</td></tr><tr><td>カープリーブ5.0%w / v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>鎮痛剤(有効成分:カルプロフェン)。メーカー推奨用量:4 mg / kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>眼軟膏</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>フリードマン ピアソン ロンガー 湾曲 0.7 mm カップ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>ボン マイクロ フォーセプス</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>FST 11083-07</td><td>背根の粉砕を行うため傷害</td></tr><tr><td>組織分離はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアドソン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr>ゴールド<tr><td>スタインリトラクター</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr>ヴァン<tr><td>ナススプリングシザース(ストレート)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM吸収性ゼラチンスポンジ</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>出血制御用</td></tr><tr><td>マイクロリットルシリンジRN701(10 &mu;L)</td><td>ハミルトン</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>カスタムメイドリムーバブルニードル(DRG注射用)</td><td>ハミルトン</td><td>7803-05</td><td>33ゲージ、38 mm、ポイントスタイル3</td></tr>カスタム<tr><td>メイドリムーバブルニードル(CTB注射用)</td><td>ハミルトン</td><td>7803-05</td><td>33ゲージ、10 mm、ポイントスタイル3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump、SYS-Micro4コントローラー付き</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

神経系損傷後の軸索再生を達成するのは困難な作業です。中枢神経系(CNS)のさまざまな部分は解剖学的に互いに異なるため、軸索再生の研究に使用する適切なモデルを特定することが重要です。適切なモデルを使用することで、損傷の重症度、関心のある神経細胞の種類、再生を評価するための望ましい脊柱管に基づいて、特定の治療法を処方することができます。感覚経路内では、DRGニューロンは末梢からCNSへの感覚情報の中継に関与しています。ここでは、ウイルスベクターによるDRG注射と、成体ラットの下部頸髄の同時後根挫傷をモデルとして使用するプロトコルを紹介します 感覚軸索再生を研究するためのモデルとして。対照ウイルスであるAAV5-GFPを用いて実証したように、DRGニューロンの形質導入と脊髄への感覚軸索の追跡における直接DRG注射の有効性を示しています。また、軸索再生を評価するための損傷モデルとして、前足の除神経における後根挫傷の有効性を示します。この侵襲的な外科的処置を行うためには専門的なトレーニングが必要ですが、プロトコルは柔軟性があり、潜在的なユーザーは実験要件に合わせて多くの部品を変更できます。重要なのは、研究に適した動物モデルを探している人々の基盤として役立つことができるということです。この記事は、新しいユーザーが非常に効率的かつ効果的な方法で手順を学ぶのに役立つと信じています。

表現として、添付のDRGと横脊髄部C7に直接、DRGニューロンを形質導入し、四週間対照ウイルス、AAV5-GFPを注入した後に、脊髄における感覚軸索をトレースにこのプロトコルの有効性を示すために提示されています後根圧潰損傷（ 図1A）ことなくDRG。脊柱及び脊髄後角の両方における軸索はGFP（ 図1B）、ならびに注入DRG（ 図1C）内の細胞体と軸索を発現します。楔核の追加の解剖学的分析は、脳幹における感覚軸索端末は、正の順行CTBが（ 図1D）をトレース明らかにする。 DRG注射は、脊髄またはCTB-正端子にはGFP陽性の軸索は、完全なC5-C8後根挫滅損傷と同時に行われていない場合楔核におけるSは（ 図2A）が観察されます。しかし、軸索切断感覚軸索がまだなく超えて脊髄<sup c...

このプロトコルは、感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、ウイルスベクターによる後根神経節(DRG)注射の使用と成体ラットの同時後根挫傷を示しています。このモデルは、感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療の使用を調査するのに適しています。

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

この外科的手法の目的は、中枢神経系内でより損傷の激しい病変を作ることなく、神経細胞体レベルで直接的に治療を適用し、治療的介入後の軸索再生を評価することです。この手法は、治療を受けた軸索が脊髄内で再生し、さらには脳幹の標的にまで到達し得るかといった、軸索再生分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、脊髄に直接的な損傷を与えることなく、中枢神経系の軸索再生を調べられる点にあります。これにより、術後の合併症が軽減され、動物福祉が向上します。まず、動物に適切に麻酔を施します。足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認し、外科的手術に適した麻酔深度にあることを確認してください。次に動物の体重を量り、術前体重を記録します。DRGへの外科的注入を行う場合は、耳の間から肩甲骨のすぐ下まで、首の被毛を剃毛します。剃毛した部位を消毒剤で消毒してください。動物の側腹部に2 mLの生理食塩水を皮下注射し、併せて適切な用量の鎮痛剤および抗生物質を投与します。処置中の角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼軟膏を塗布します。動物を脊髄定位固定装置に固定し、動物の下に37 °Cに設定した加熱パッドを設置します。皮膚の上から、突出したC2およびT2棘突起を確認することから手術を開始します。次に、10番メスを用いて、C2とT2の棘突起の間に皮膚切開を加えます。皮膚を切開すると、ゼリー状の質感を持つ第一層の筋肉の上に、正中線に沿った白い線維組織が見えるはずです。白い正中線に沿って、第一層の筋肉に同様の大きさの切開を加えます。その付近に主要な血管が存在するため、最初の目立つT2棘突起を超えないようにしてください。2つのリトラクターを、1つは吻側、もう1つを尾側に配置して、第一層の筋肉を牽引します。横紋様に見える2層目の筋肉が確認できるはずです。2本の縦走筋が薄い膜状組織でつながっている2層目筋肉の中央線を探します。次に、マイクロシザーを用いて膜状組織を切開し、2本の縦走筋を分離します。リトラクターを調整し、脊髄を覆っている3層目の薄い筋肉を露出させます。3層目の筋肉の上をピンセットで軽く触れることで、棘突起を確認できます。マイクロシザースを用いて3層目の筋肉に小さな切開を加え、キュレットまたはメスを横方向に動かして筋肉を骨から慎重に掻き出し、椎骨を明確に露出させます。左側のC5からC8の後根神経節（DRG）を露出させるため、精細骨剪刀を用いてC4からT1椎骨の椎弓と椎弓根の一部を慎重に除去し、左側半椎弓切除術を行います。注射に十分なDRGが露出したら、特注の33ゲージ鈍針を装着しウイルスを満たしたマイクロリッターシリンジを、脳定位固定装置のシリンジホルダーにセットして準備します。次に、30ゲージのベベル針を用いて、各標的DRGに小さく浅い開口部を作り、注入針の挿入を容易にします

dorsal-root-ganglion-injection-dorsal-root-crush-injury-as-model-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からクロマチン免疫沈降法を提示する。アプローチは、特定の転写因子結合部位と末梢および中枢神経系の両方で負傷した軸索の再生のための重要なヒストンとDNAのエピジェネティックな修飾を識別するために使用することができます。...

軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

本報告では、マウス坐骨神経を粉砕する方法を説明します。このメソッドは、容易に利用可能な止血鉗子を使用して、簡単かつ再現性を完全に坐骨神経のときめきを生成します。さらに、坐骨神経挫滅後の神経再生の解析に適した筋肉全体のマウントを準備する方法について説明します。...

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

出典: Li, Q., et al.ほ乳類の軸索再生の研究 成体マウス後根神経節のin vivoエレクトロポレーションJ. Vis.

圧死後のマウスの坐骨神経における軸索再生

出典:Cheah, M., et al.感覚軸索再生のモデルとして、背根神経節注射と背根潰傷傷。J. Vis. Exp.

背根神経節注射と背根挫傷傷を用いたラットの感覚軸索再生のモデル化

出典: Li, Q. et al.ほ乳類の軸索再生の研究 成体マウス後根神経節のin vivoエレクトロポレーションJ. Vis.

感覚軸索再生を促進するマウス後根核のエレクトロポレーション媒介トランスフェクション

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2...

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

エレクトロポレーションは、興味の遺伝子を細胞に提供する効果的なアプローチです。このアプローチは生体内で成体マウス後根神経節 (DRG)...

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

学ぶ後根神経節インジェクションと後根損傷法により、成体ラットの感覚軸索再生と遺伝子治療を研究する。脊髄損傷を回避しつつ中枢神経系での軸索再生を評価できる動物福祉に配慮した手法である。

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

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