哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

本発明者らは、細胞が細菌および多数の異なるストレスでチャレンジされた後の哺乳動物細胞におけるストレス顆粒形成の定性的および定量的分析のための方法を記載する。このプロトコルは、広範囲の宿主 - 細菌相互作用における細胞ストレス顆粒応答を調べるために適用することができる。

この実験の全体的な目標は、宿主細胞が外因性ストレスに応答してストレス顆粒を形成する能力に対する細菌感染の影響を評価することです。この方法は、細胞微生物学の分野で、特定の病原体がストレス顆粒経路全体を変化または破壊できるかどうかを評価するための貴重なツールです。この手法の主な利点は、無料の画像解析プログラムを使用して、応力顆粒を厳密かつ自動化された方法で定性的および定量的に分析できることです。

この手法により、応力顆粒の形成と組成のダイナミクス、およびこれらのパラメータが特定の病原体によってどのように影響を受けるかについての洞察が得られます。ありがとうございます。チャレンジを開始する前に、縞模様の新鮮なトリプシン大豆寒天 1%コンゴレッド寒天プレートから、8ミリリットルのトリプシン大豆ブロスを含む15ミリリットルの円錐管に、赤いS.flexneri M90Tバクテリアコロニーを接種します。

蓋を締めた後、コロニーを222 RPMおよび30°Cで振とうしながら一晩インキュベートします。翌日、150マイクロリットルの細菌を8ミリリットルの新鮮なトリプシン大豆ブロスで摂氏37度、222RPMで約2時間継代培養し、病原性遺伝子発現の後期指数関数的誘導を開始し、細菌感染性を高めます。継代培養の光学密度が0.6〜0.9の場合、1ミリリットルの細菌を1.5ミリリットルのチューブに移し、遠心分離によって収集します。

そして、ペレットを光学密度1で感染培地に再懸濁します。次に、HeLa細胞カバースリップ培養の各ウェルから上清を吸引します。そして、ウェルあたり500マイクロリットルの新鮮な室温のHeLa細胞培地でHeLa細胞を慎重に洗浄します。

洗浄液をウェルあたり500マイクロリットルの感染培地に交換し、24ウェルプレートを遠心分離して細菌を細胞上に回転させます。沈殿した細菌共培養を摂氏37度の組織培養インキュベーターに30分間移し、宿主細胞の感染を促進します。インキュベーションの終了時に、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮な摂氏37°CのHeLa培地に3回のすすぎを行い、細胞から外因性細菌を除去します。

次に、感染した細胞をゲンタマイシンを含む1ミリリットルの新鮮な培地で覆い、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。インキュベーションの終了時に、培地を目的のストレッサーを補充した500マイクロリットルの適切な培地と交換し、細胞を組織培養インキュベーターに戻します。1時間後、上清を完全に吸引し、サンプルをPBS中の室温4%パラホルムアルデヒド0.5ミリリットルに30分間固定します。

次に、固定剤を適切な廃棄物容器に廃棄し、カバーガラスを1ミリリットルのトリス緩衝生理食塩水で軽く振って2分間洗います。洗浄終了時に、TBSを完全に吸引し、TBS中の0.3%Triton X-100を500マイクロリットルで各ウェルの細胞に透過処理します。10分後、透過処理液を1ミリリットルのTBSと交換し、プレートを優しく撫で、TBSを1ミリリットルのブロッキング溶液と交換して室温で1時間。

目的の一次抗体カクテルで細胞を標識するには、ベンチトップにしっかりとテープで留めたプラスチックパラフィルムに、カバースリップごとに50マイクロリットルの一次抗体ミックスをスポットします。次に、ピンセットを使用して最初のカバースリップを拾います。そして、カバーガラスの端をティッシュペーパーに軽くたたいて、余分な液体を取り除きます。

カバースリップを液滴に慎重に置き、適切なラベリング条件下でカバースリップをインキュベートします。一次抗体標識インキュベーションの終了時に、各カバースリップをウェルあたり1ミリリットルのTBSを含む新しい24ウェルプレートの個々のウェルに移し、プレートシェーカーで室温で細胞を5分間3回洗浄します。最後の洗浄後、先ほど示したように、各カバーガラス上の細胞を適切な二次抗体カクテルミックスで標識します。

そして、カバーガラスを室温で1時間暗所でインキュベートします。二次抗体標識インキュベーションの最後に、新しい24ウェルプレートで1ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、先ほど示したように穏やかに振とうしますが、光から保護します。最後の洗浄後、各カバースリップを脱イオン水に短時間浸して塩分を取り除き、カバースリップの端をティッシュに軽くたたき、気泡のないガラス顕微鏡スライドあたり5マイクロリットルの蛍光封入剤にカバースリップを慎重に取り付けます。

次に、カバーガラスをマニキュアで密封します。そして、イメージングするまでスライドを適宜保管してください。蛍光共焦点顕微鏡で細胞をイメージングするには、まず、画像取得に適した対物レンズと適切な蛍光チャネルを選択します。

次に、適切なイメージングソフトウェアを使用して、細胞の画像スタックを取得します。すべての画像がキャプチャされたら、適切な画像解析ソフトウェアを使用して画像スタックを折りたたみ、スタックをTIFFファイルとして保存します。次に、コントロールと実験的なTIFF画像を画像解析プラットフォームに読み込み、[Lookup Table]を選択して、シーケンスウィンドウでチャネルパラメータを開きます。

すべてのチャンネルタブのチェックボックスをクリックして、すべてのチャンネルを無効にします。次に、チャネルゼロをクリックし、チャネルゼロのカラーバーをクリックして好みの色を選択し、必要に応じてチャネルの強度を上げて、すべての構造を視覚化します。実験解析に適した各カラーチャンネルを選択および調整した後、キャンバスタブを選択し、ズームタブを調整して、表示フィールドごとに約10個のセルを視覚化します。

ポリゴンツールを使用して、目的のセルをクリックし、セルの周囲に線を延長してセルの境界を描きます。この関心領域に名前を付けるには、関心領域ウィンドウで、関心領域のセルを右クリックし、関心領域の名前をダブルクリックして変更します。同じ方法で目的のすべてのセルを選択して名前を付けた後、検出および追跡タブでSpot Detectorアプリケーションを開きます。

「Pre Processing」タブを開き、解析するチャンネルを選択します。[検出器] タブで、[暗い背景の明るいスポットを検出する] を選択し、適切なスケールと感度を選択します。「Region of Interest」タブで、シーケンスから提案された関心領域を選択します。

[フィルタリング] タブで、[NoFiltering ] を選択します。[出力] タブで、適切な出力を選択します。「関心領域としてレンダリングされた以前のスポットを削除」を選択し、「ファイルが選択されていません」をクリックして、ファイルを保存するフォルダを選択します。

次に、[表示] タブで、目的の適切なオプションを選択し、[検出の開始] をクリックします。イメージング解析ソフトウェア内では、スポット検出器を使用して、指定された各関心領域内の応力顆粒を同定できます。その後、識別されたすべての応力顆粒を表示するバイナリ画像を生成できます。

応力顆粒分析は、分析する各応力顆粒市場に合わせて慎重に調整する必要があります。たとえば、検出される関心領域のサイズ要件を変更したり、検出パラメータの感度を変更したりすると、結果にばらつきが生じます。ピクセル サイズ スケールが高いほど、小さい応力顆粒はカウントされず、応力顆粒の数が減少します。

感度を上げると、応力顆粒の数が増加します。たとえば、この実験では、感度が100のスケール2で、応力顆粒マーカーG3BP1から最良の結果が得られました。一方、感度が55のスケール2は、EIF3Bストレス顆粒マーカーにとって最良の結果をもたらしました。

その後、応力顆粒のサイズから表面積を計算できます。度数分布プロットは、異なる細胞集団間のストレス顆粒のサイズのシフトを強調するのに役立ちます。さらに、蛍光の強度は、分析された応力顆粒の品質に関する情報を提供することができます。

マスターすれば、全細胞チャレンジは約6〜7時間で完了し、分析はさらに2〜3時間で完了できます。この手順を試行する際は、データ内のばらつきを最小限に抑えるために、コントロールサンプルと実験サンプルを常に同時に同じ条件下で処理することを覚えておくことが重要です。この手順に従って、解析を 3 次元ボリュームに拡張して、応力顆粒の局在化に関する追加の洞察を得ることもできます。

この半自動手順により、非感染細胞および感染細胞のストレス顆粒を厳密かつ偏りなく分析することができます。これにより、これまで知られていなかった応力顆粒経路の破壊を明らかにすることができます。このビデオを見れば、細胞に細菌を感染させる方法、ストレス顆粒形成を誘導する方法、半自動アプローチを使用してストレス顆粒を定性的および定量的に分析する方法について十分に理解できるはずです。

また、赤痢菌やクロトリマゾールのようなストレス顆粒誘発剤は危険な場合があり、手袋の着用、BL2ラボでの作業、すべての試薬の適切な廃棄などの予防措置が必要であることを忘れないでください。