哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

この実験の全般的な目的は、細菌感染が、外因性ストレスに応答してストレス顆粒を形成する宿主細胞の能力に及ぼす影響を評価することです。この手法は、特定の病原体がストレス顆粒経路全体を変化または妨害できるかどうかを評価するための、細胞微生物学分野における有用なツールとなります。この技術の主な利点は、無料の画像解析プログラムを用いることで、ストレス顆粒を厳密かつ自動的な方法で定性的および定量的に解析できる点にあります。

この手法は、ストレス顆粒の形成と組成のダイナミクス、およびこれらのパラメータが特定の病原体によってどのように影響を受けるかについての知見を提供します。ありがとうございます。チャレンジを開始する前に、新たにストリークしたトリプチケースソイアガー1%コンゴレッド寒天培地プレートから、赤色のS.flexneri M90T細菌コロニーを、8 mLのトリプチケースソイブロスを含む15 mLコニカルチューブに接種してください。

蓋をしっかり閉めた後、222 RPMの振盪条件下、30 °Cでコロニーを一晩培養します。翌日、150 µLの細菌を8 mLの新鮮なトリプティックソイブロスに継代し、37 °C、222 RPMで約2時間培養します。これにより、毒性遺伝子発現の後期指数増殖期への誘導を行い、細菌の感染能を高めます。継代培養物の光学密度が0.6から0.9の間になったら、細菌を1 mL取り、遠心分離による回収のために1.5 mLチューブに移します。

次いで、ペレットを感染培地で再懸濁し、吸光度（OD）を1に調整します。次に、HeLa細胞のカバースリップ培養の各ウェルから上清を吸引します。そして、各ウェルに室温の新鮮なHeLa細胞培地500 µLを加え、HeLa細胞を慎重に洗浄します。

洗浄液を1ウェルあたり500 µLの感染培地に交換し、24ウェルプレートを遠心分離して細菌を細胞上に沈降させます。沈降した細菌共培養物を37 °Cの組織培養インキュベーターに30分間移し、宿主細胞への感染を促進させます。インキュベーション終了後、1回あたり1 mLの新鮮な37 °C HeLa培養液で3回リンスし、細胞から外来細菌を除去します。

次に、ゲンタマイシンを含む新鮮な培養液1 mLを感染細胞に加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。インキュベーション終了後、培地を目的のストレス因子を添加した適切な培養液500 µLに交換し、細胞を組織培養インキュベーターに戻します。1時間後、上清を完全に吸引し、室温のPBS調製4%パラホルムアルデヒド0.5 mLでサンプルを30分間固定します。

次に、固定液を適切な廃棄容器に廃棄し、カバースリップを1 mLのTBS（トリス緩衝生理食塩水）で2分間、緩やかに振盪しながら洗浄します。洗浄後、TBSを完全に吸引し、各ウェルの細胞を500 µLの0.3% Triton X-100含有TBSで透過処理します。10分後、透過処理溶液を1 mLのTBSに交換してプレートを緩やかに揺らし、さらにTBSを1 mLのブロッキング溶液に交換して、室温で1時間放置します。

目的の一次抗体カクテルで細胞を標識するために、ベンチトップにしっかりとテープで固定したパラフィルムの上に、カバーガラス1枚あたり50 microlitersの一次抗体ミックスを分注します。次に、ピンセットで1枚目のカバーガラスを拾い上げます。そして、カバーガラスの端をティッシュペーパーで軽く叩き、余分な液体を取り除きます。

カバーガラスを液滴の上に慎重に置き、適切な標識条件下でインキュベートします。一次抗体による標識インキュベートの終了後、各カバーガラスを、1ウェルあたり1 mLのTBSを含む新しい24ウェルプレートの個々のウェルに移し、プレートシェーカーを用いて室温で5分間の洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、先ほど示した方法に従い、各カバーガラス上の細胞を適切な二次抗体カクテルミックスで標識します。

そして、カバーガラスを室温、暗所で1時間インキュベートします。二次抗体による標識インキュベーション後、先に示したように、新しい24ウェルプレートを用いて、1 mLのPBSで細胞を3回、緩やかに揺らしながら洗浄します。この際、遮光して行ってください。最後の洗浄後、各カバーガラスを脱イオン水に短時間浸して塩を除去し、カバーガラスの端をティッシュで軽く押さえて水分を取り除きます。その後、1枚のガラス顕微鏡スライドにつき5 µLの蛍光封入剤を用い、気泡が入らないように注意してカバーガラスを封入します。

次に、ネイルポリッシュでカバーガラスを封印します。そして、イメージングまでスライドを適切に保存します。蛍光共焦点顕微鏡で細胞をイメージングするには、まず適切な対物レンズと画像取得に適した蛍光チャンネルを選択することから始めてください。

次に、適切なイメージングソフトウェアを使用して、細胞のイメージスタックを取得します。すべての画像のキャプチャが完了したら、適切な画像解析ソフトウェアを用いてイメージスタックを崩壊（collapse）させ、スタックをTIFFファイルとして保存します。次に、コントロールと実験群のTIFF画像を画像解析プラットフォームに読み込み、Lookup Tableを選択してSequenceウィンドウでチャンネルパラメータを開きます。

すべてのチャンネルタブのチェックボックスをクリックして、すべてのチャンネルを非アクティブにします。次に、チャンネル0をクリックし、チャンネル0のカラーバーをクリックして好みの色を選択します。必要に応じてチャンネルの強度を上げ、すべての構造を可視化してください。実験分析に適した各カラーチャンネルの選択と調整が完了したら、キャンバス（canvas）タブを選択し、ズーム（zoom）タブを調整して、1視野あたり約10個の細胞が表示されるようにします。

ポリゴンツールを使用して、目的の細胞をクリックし、細胞の周囲に線を伸ばして細胞境界を画定します。この関心領域に名前を付けるには、関心領域ウィンドウで目的の細胞を右クリックし、関心領域の名前をダブルクリックして修正します。同様の方法ですべての目的の細胞を選択して命名した後、「Detection and Tracking」タブ内にある「Spot Detector」アプリケーションを開きます。

「Pre Processing」タブを開き、解析するチャンネルを選択します。「Detector」タブ内で、「Detect bright spots over dark background」を選択し、適切なスケールと感度を設定します。「Region of Interest」タブで、シーケンスから推奨される関心領域を選択します。

「Filtering」タブで「NoFiltering」を選択します。「Output」タブで、適切な出力先を選択してください。「Remove previous spots rendered as regions of interest」を選択し、「no file selected」をクリックして、ファイルを保存するフォルダを選択します。

次に、「Display」タブで関心のある適切なオプションを選択し、「Start Detection」をクリックします。イメージング解析ソフトウェア内のスポット検出機能を使用して、指定した各関心領域（ROI）内のストレス顆粒を特定できます。その後、特定されたすべてのストレス顆粒を表示するためのバイナリ画像を生成することが可能です。

ストレス顆粒の解析は、解析対象となる各ストレス顆粒の特性に合わせて慎重に調整する必要があります。例えば、検出する関心領域（ROI）のサイズ要件を変更したり、検出パラメータの感度を変更したりすると、結果が変動します。ピクセルサイズの設定を大きくすると、より小さなストレス顆粒がカウントされなくなり、ストレス顆粒の数が減少します。

感度を上げると、ストレス顆粒の検出数が増加します。例えば、本実験では、スケール2で感度100とした場合に、ストレス顆粒マーカーであるG3BP1において最良の結果が得られました。一方、スケール2で感度55とした場合に、ストレス顆粒マーカーのEIF3Bにおいて最良の結果が得られました。

その後、ストレス顆粒のサイズから表面積を算出できます。頻度分布図は、異なる細胞集団間でのストレス顆粒のサイズの変動を強調するのに有用です。さらに、蛍光強度は、解析したストレス顆粒の質に関する情報を提供します。

習得すれば、ホールセルチャレンジは約6〜7時間で実施でき、解析にはさらに2〜3時間かかります。この手順を行う際は、データのばらつきを最小限に抑えるため、コントロール試料と実験試料を常に同時に、かつ同一の条件下で処理することが重要です。本手順に従った後、解析を3次元ボリュームに拡張することで、ストレス顆粒の局在に関するさらなる知見を得ることが可能です。

この半自動の手法により、非感染細胞および感染細胞におけるストレス顆粒の厳密かつ不偏的な解析が可能になります。これにより、これまで未知であったストレス顆粒経路の転用を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、細胞への細菌感染方法、ストレス顆粒形成の誘導方法、およびストレス顆粒を定性的・定量的に解析するための半自動アプローチの使用方法について、十分に理解できるはずです。

また、Shigella flexneriやクロトリマゾールのようなストレス顆粒誘導剤は危険を伴う可能性があるため、手袋の着用、BL2ラボでの作業、およびすべての試薬の適切な廃棄などの予防策が必要であることに留意してください。