Name: 哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶ細菌感染が哺乳動物細胞のストレス顆粒形成に与える影響を免疫蛍光法で定量的に解析する方法。無料画像解析プログラムを用いた自動化された厳密な解析により、宿主病原体相互作用の理解が深まります。

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著者は何も開示することはない。

本明細書に概説されたプロトコルは、外因性ストレスの存在下または非存在下で、非感染細胞および細胞質病原体S.フレクスナーネに感染した細胞におけるSGの誘導、局在化および分析を記載する。フリーイメージングソフトウェアを使用することにより、このプロトコルにより、SG形成の正確な定性および定量分析が可能となり、与えられた表現型の差異を同定および統計的に取り扱うことができます。 感染、SG誘導および画像化のためのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。感染のためには、ここで概説したような侵襲のような宿主細胞との細菌相互作用が可能な限り同調することが重要である。これは、感染プロセスの初期に細菌チャレンジの影響を調べる際に特に重要です。私たちは以前に、 フレックスネリ感染後のeIF3b局在化などのいくつかの表現型が、野生型の初期に摂動されることを示した他の表現型、例えばG3BP1含有SGの凝集は、後の時点3でより影響を受けるが、 S.フレックスネリのチャレンジ。したがって、細菌チャレン...

細胞レベルでの宿主 - 病原体相互作用の可視化は、病原性戦略への洞察を獲得し、主要な細胞経路を同定するための強力な方法である。事実、病原体は、自身の生存または増殖のための戦略として中央細胞プロセスを破壊するように進化しているので、病原体を重要な細胞標的または構造を特定するためのツールとして使用することができる。細胞成分の可視化は、蛍光標識された宿主タンパク質を組換え発現することによって達成することができる。これはリアルタイム分析を可能にするが、特異的に標識された宿主タンパク質を有する細胞株の生成は非常に面倒であり、望ましくない副作用をもたらし得る。複数の宿主因子を同時に分析することができ、特定の細胞型に限定されないため、特異的抗体を用いた細胞因子の検出がより便利である。欠点は、免疫蛍光分析が宿主細胞固定化を必要とするので、静的視野のみを捕捉できることであるイオン。しかしながら、免疫蛍光イメージングの重要な利点は、それが定性分析および定量分析の両方に容易に役立つことである。これは、次に、宿主 - 病原体相互作用への新しい洞察を提供するために統計的に有意な差異を得るために使用することができる。 蛍光画像解析プログラムは、3Dおよび4D解析を実行するための強力な解析ツールです。しかし、ソフトウェアの高コストとそのメンテナンスは、フリー・オープンソース・ソフトウェアに基づく方法をより広く魅力的にしています。バイオ分析ソフトウェアを使用した慎重な画像分析は、視覚分析を実証し、統計的有意性を割り当てるときに、所与の表現型の正確性に対する信頼性を高めるので有益である。これまで、SGは、個別のSG 4の手動識別を必要とする無料のImageJソフトウェアを使用して分析されていました。ここでは、bacの文脈における細胞SG形成の誘導および分析のためのプロトコルを提供するフリーオープンソースのバイオイメージ分析ソフトウェアICY（http://icy.bioimageanalysis.org）を使用して、腸内感染を検出した。バイオイメージ解析ソフトウェアには、SG解析に非常に適したスポット検出プログラムが組み込まれています。これにより、指定された関心領域（ROI）での自動検出プロセスの微調整が可能になります。これは、個々のSGの手動分析の必要性を克服し、サンプリングバイアスを除去する。 多くの環境ストレスは、直径0.2-5μmの相密度の高いサイトゾル、非膜構造であるSGの形成を誘発する5,6 。この細胞応答は、酵母、植物および哺乳動物において進化的に保存され、全身タンパク質翻訳が阻害される場合に起こる。これは、失活した翻訳開始複合体のSGへの凝集を含み、翻訳的に不活性なmRNAの保持場所と考えられ、細胞mRNAのサブセットの選択的翻訳を可能にする。ストレスを除去すると、SGが溶解し、タンパク質合成の全体的な速度が再開する。 SGは、翻訳伸長開始因子、RNA代謝に関与するタンパク質、RNA結合タンパク質、ならびに宿主細胞シグナリング2に関与するスカフォールドタンパク質および因子からなるが、正確な組成は適用されるストレスに依存して変化し得る。 SG形成を誘発する環境因子には、アミノ酸飢餓、UV照射、熱ショック、浸透圧ショック、小胞体ストレス、低酸素症およびウイルス感染が含まれる2,7,8。ウイルスがどのように誘導され、SGの形成を破壊するかについての理解が進んだが、細菌、真菌、原生動物病原体などの他の病原体がこの細胞ストレス応答にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。 シゲIIフレクスナーは、ヒトのグラム陰性通性細胞質ゾル病原体であり、重度の下痢またはシゲラ症の原因物質である。シゲロシスは重大な公衆衛生上の負担であり、5歳未満の小児では毎年28,000人の死亡を引き起こす。 フレックスネリは結腸上皮に感染し、宿主の細胞骨格成分11,12をハイジャックすることにより細胞間拡散を起こす 。上皮の感染は、サイトゾル内でのフレクスネリ（ flexneri）の複製を支持するが、感染マクロファージは、熱中症と呼ばれる炎症性細胞死プロセスによって死ぬ。感染は、熱、酸化ストレスおよび組織破壊を伴う好中球および重度の炎症の大規模な動員につながる。したがって、感染細胞は、ゴルジ破壊、遺伝毒性ストレスおよび細胞骨格再編成などの感染によって誘導される内部ストレスを受ける炎症過程に起因する環境ストレスにさらされる。 多数のSGマーカーを用いて環境ストレスに応答する細胞の能力に対するS.フレックスネリ感染の特徴付けは、感染がSG組成3の定性的および定量的差異をもたらすことを実証した。しかしながら、他の細菌病原体についてはほとんど知られていない。ここでは、異なる環境ストレスを有する細胞のストレス、SG成分の標識、および感染の文脈におけるSGの形成および組成の定性的および定量的分析を含む、細胞質病原菌S.フレックスネリによる宿主細胞の感染のための方法論を説明する。および非感染細胞が含まれる。この方法は、他の細菌病原体に広く適用可能である。さらに、SG形成の画像分析は、ウイルスまたは他の病原体による感染のために使用され得る。それはSGを分析するために使用することができます外因性のストレスに応答したSG形成に対する感染の影響または感染の効果。

<table><tbody><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), 起源ヤギ&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-16377</td><td>堅牢で広く使用されているSGマーカー。細胞質染色は細胞の描写を可能にします。希釈率 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20)、原産ヤギ&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-16378</td><td>eIF3b (N20) と同じ目標で、私たちの手には eIF3b (N20) と同じでした。希釈 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), 起源ウサギ (MC: モノクローナル)</td> <td>細胞シグナル伝達</td><td>3411</td><td>eIF3b と多タンパク質 eIF3 複合体の一部 .希釈率 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, 原産ヤギ&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-14211</td><td>(Ref # 13)が推奨しています。希釈1:200</td></tr><tr><td>eIF4B、起源ウサギ</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>私たちの手の中の良好なストレス顆粒マーカー。希釈 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B、起源ウサギ</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3592</td><td>参考文献#13により推奨されています。希釈1:100</td></tr><tr><td>eIF4G、起源ウサギ</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-11373</td><td>広く使用されているSGマーカー。(参考文献#13):マウス細胞株ではうまく機能しない可能性がある。希釈率 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, 起源ウサギ (MC: モノクローナル)</td><td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>広く使用されているSGマーカー。希釈率 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1、原産ヤギ&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-1751</td><td>広く使用されているSGマーカー。SGが存在する場合、P体にも見られます(参照#13)。希釈 1:300</td></tr><tr><td>Alexa-conjugated Secondary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 anti-goat, origin</td><td>donkey Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Cross absorbed.希釈 1:500</td></tr><tr><td>A568 アンチヤギ、起源ロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-11057</td><td>クロス吸収。希釈 1:500</td></tr><tr><td>A488 アンチマウス、オリジンロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21202</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>A568 アンチマウス、オリジンロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A10037</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>A647 アンチマウス、オリジンロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A31571</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>A488 アンチウサギ、オリジンロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21206</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>A568抗ウサギ、起源ロバ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A10042</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>その他の試薬<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>赤痢菌flexneri</td><td></td><td></td><td>ご要望に応じて様々な研究室から入手可能</td></tr><tr><td>トリプトンカゼイン大豆(TCS)ブロス</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>赤痢菌の標準増殖培地、応用 - 細菌増殖</td></tr><tr><td>TCS寒天</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>赤痢菌のための標準的な成長寒天、応用 - 細菌の成長</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>病原性プラスミドを失ったシゲルのためのディストリミネーションツール、アプリケーション - 細菌増殖</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>感染を増加させるために細菌をコーティングするのに有用、アプリケーション - 感染</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>細胞外細菌の選択的殺傷、細胞質細菌の選択的死滅、応用 - 感染</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>細胞がRTでインキュベートされるときに有用なPH緩衝液、応用 - 細胞培養</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>31885</td><td>HeLa細胞用の標準培地、応用 - 細胞培養</td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>HeLa細胞培養培地に使用される5%サプリメント、アプリケーション - 細胞培養</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>1:100希釈 HeLa細胞培養培地に使用、アプリケーション - 細胞培養</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td>試薬<td>希釈剤、アプリケーション - 細胞培養</td></tr><tr><td>亜ヒ酸</td><td>ナトリウムSigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>強力なストレス顆粒誘導剤 (注:毒性が高く、特別な取り扱いと廃棄が必要)、アプリケーション - ストレス誘導剤</td></tr><tr><td>クロトリマゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>強力なストレス顆粒誘導剤 (注:健康被害、特別な取り扱いと廃棄が必要)、アプリケーション - ストレス誘導剤</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA</td><td>Electron Microscopy Scences</td><td>15714</td><td>4% PFAは、細胞の標準的な固定に使用されます、アプリケーション -固定</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>免疫蛍光染色前の宿主細胞の透過化に0.03%で使用、アプリケーション -透過化</td></tr><tr><td>A647-ファロイジン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A22287</td><td>希釈は1:40で、二次抗体染色中に最もよく追加されます、アプリケーション - 染色</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D9542</td><td>宿主の核と細菌の両方を可視化するために使用される核酸染色、アプリケーション -</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>カバースリップの免疫蛍光染色に有用なパラフィンフィルムの染色、アプリケーション - 染色</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>ほとんどの蛍光色素に適した堅牢な封入剤、アプリケーション -</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381の埋込</td><td>ほとんどの蛍光色素に適した安価で堅牢な封入剤、アプリケーション -</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>の取り付け Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>標準的な組織培養プレート、アプリケーション - 細胞培養</td></tr><tr><td>12 mm&nbsp; ガラスカバースリップ</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>免疫蛍光アプリケーション用の細胞培養サポート、アプリケーション - 細胞サポート</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>ほとんどの蛍光色素に適した安価で堅牢な封入剤、アプリケーション - 取り付け</td></tr><tr><td>プログラムと機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td></td><td>堅牢な統計テストオプションを備えたデータ分析およびグラフ作成プログラム、アプリケーション - データ分析</td></tr><tr><td>ライカ SP5</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td></td><td>共焦点マイクロソープ、アプリケーション - 画像買収</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>プロフェッショナル画像解析プログラム、アプリケーション - データ分析</td></tr><tr><td>Excel マイクロソフト</td><td></td><td></td><td>データ分析およびグラフ作成プログラム、アプリケーション - データ分析</td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

細胞成分の蛍光イメージングは​​、宿主 - 病原体相互作用を調べるための有効なツールである。病原体は、細胞小器官の超微細構造、細胞骨格のネットワーク構成、ならびにストレス顆粒（SG）形成などの細胞プロセスを含む感染細胞の多くの異なる特徴に影響を及ぼし得る。どのように病原体が宿主プロセスを破壊するかの特徴付けは、病因の分野の重要かつ不可欠な部分である。様々な表現型が容易に目に見えるかもしれないが、病原体チャレンジによって誘発される細胞構造の定性的および定量的差異の正確な分析は、実験試料と対照試料との間に統計学的有意差を定義するために不可欠である。 SGの形成は、進化的に保存されたストレス応答であり、抗ウイルス応答をもたらし、ウイルス感染を用いて長く研究されてきた1 。 SG形成はまた、シグナル伝達カスケードに影響を及ぼし、他の未知のconseq2 。細菌病原体のようなウイルス以外の病原体に対するこのストレス応答の特徴付けは、現在、新たな研究領域3である 。今のところ、ウイルスの系においてさえも、SG形成の定量的および定性的分析はまだ日常的には用いられていない。ここで我々は、様々な外因性ストレスに応答してSGの形成に影響を与える、非感染細胞および細胞質細菌病原体に感染した細胞におけるSG形成を誘発および特徴付けするための簡単な方法を記載する。 SGの形成および組成の分析は、多数の異なるSGマーカーおよびオープンソース画像分析ツールであるICYのスポット検出器プラグインを使用することによって達成される。

この原稿で説明されているプロトコルを説明し、実証するために、本発明者らは、サイトゾル病原菌であるフレクスネリ（flexneri）に感染したか否かにかかわらず、HeLa細胞におけるクロトリマゾール誘発SGのイメージを特徴付けた。手順の概要は図1に示されており、コンゴーレッドプレートにストリーミングされた有毒で無害なフレックスネリ 、細菌の調製、感染、環境ストレスの添加、サンプルの固定と染色、サンプルのイメージングと定量、画像分析。 SG形成を誘発するために多数の異なるストレスを使用することができ、様々なSGマーカーが呼び掛けに利用可能である。 eIF3bは、細胞の細胞質区画を明らかに染色する標準的なSGマーカーであり、細胞縁を同定するために使用することができる。 G3BP1は、バックグラウンド染色なしでSGに凝集する広く使用されるSGマーカーである（ 図 2A、B </strong&gt...

本発明者らは、細胞が細菌および多数の異なるストレスでチャレンジされた後の哺乳動物細胞におけるストレス顆粒形成の定性的および定量的分析のための方法を記載する。このプロトコルは、広範囲の宿主 - 細菌相互作用における細胞ストレス顆粒応答を調べるために適用することができる。

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

この実験の全般的な目的は、細菌感染が、外因性ストレスに応答してストレス顆粒を形成する宿主細胞の能力に及ぼす影響を評価することです。この手法は、特定の病原体がストレス顆粒経路全体を変化または妨害できるかどうかを評価するための、細胞微生物学分野における有用なツールとなります。この技術の主な利点は、無料の画像解析プログラムを用いることで、ストレス顆粒を厳密かつ自動的な方法で定性的および定量的に解析できる点にあります。この手法は、ストレス顆粒の形成と組成のダイナミクス、およびこれらのパラメータが特定の病原体によってどのように影響を受けるかについての知見を提供します。ありがとうございます。チャレンジを開始する前に、新たにストリークしたトリプチケースソイアガー1%コンゴレッド寒天培地プレートから、赤色のS.flexneri M90T細菌コロニーを、8 mLのトリプチケースソイブロスを含む15 mLコニカルチューブに接種してください。蓋をしっかり閉めた後、222 RPMの振盪条件下、30 °Cでコロニーを一晩培養します。翌日、150 µLの細菌を8 mLの新鮮なトリプティックソイブロスに継代し、37 °C、222 RPMで約2時間培養します。これにより、毒性遺伝子発現の後期指数増殖期への誘導を行い、細菌の感染能を高めます。継代培養物の光学密度が0.6から0.9の間になったら、細菌を1 mL取り、遠心分離による回収のために1.5 mLチューブに移します。次いで、ペレットを感染培地で再懸濁し、吸光度（OD）を1に調整します。次に、HeLa細胞のカバースリップ培養の各ウェルから上清を吸引します。そして、各ウェルに室温の新鮮なHeLa細胞培地500 µLを加え、HeLa細胞を慎重に洗浄します。洗浄液を1ウェルあたり500 µLの感染培地に交換し、24ウェルプレートを遠心分離して細菌を細胞上に沈降させます。沈降した細菌共培養物を37 °Cの組織培養インキュベーターに30分間移し、宿主細胞への感染を促進させます。インキュベーション終了後、1回あたり1 mLの新鮮な37 °C HeLa培養液で3回リンスし、細胞から外来細菌を除去します。次に、ゲンタマイシンを含む新鮮な培養液1 mLを感染細胞に加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。インキュベーション終了後、培地を目的のストレス因子を添加した適切な培養液500 µLに交換し、細胞を組織培養インキュベーターに戻します。1時間後、上清を完全に吸引し、室温のPBS調製4%パラホルムアルデヒド0.5 mLでサンプルを30分間固定します。次に、固定液を適切な廃棄容器に廃棄し、カバースリップを1 mLのTBS（トリス緩衝生理食塩水）で2分間、緩やかに振盪しながら洗浄します。洗浄後、TBSを完全に吸引し、各ウェルの細胞を500 µLの0.3% Triton X-100含有TBSで透過処理します。10分後、透過処理溶液を1 mLのTBSに交換してプレートを緩やかに揺らし、さらにTBSを1 mLのブロッキング溶液に交換して、室温で1時間放置します。目的の一次抗体カクテルで細胞を標識するために、ベンチトップにしっかりとテープで固定したパラフィルムの上に、カバーガラス1枚あたり50 microlitersの一次抗体ミックスを分注します。次に、ピンセットで1枚目のカバーガラスを拾い上げます。そして、カバーガラスの端をティッシュペーパーで軽く叩き、余分な液体を取り除きます。カバーガラスを液滴の上に慎重に置き、適切な標識条件下でインキュベートします。一次抗体による標識インキュベートの終了後、各カバーガラスを、1ウェルあたり1 mLのTBSを含む新しい24ウェルプレートの個々のウェルに移し、プレートシェーカーを用いて室温で5分間の洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、先ほど示した方法に従い、各カバーガラス上の細胞を適切な二次抗体カクテルミックスで標識します。そして、カバーガラスを室温、暗所で1時間インキュベートします。二次抗体による標識インキュベーション後、先に示したように、新しい24ウェルプレートを用いて、1 mLのPBSで細胞を3回、緩やかに揺らしながら洗浄します。この際、遮光して行ってください。最後の洗浄後、各カバーガラスを脱イオン水に短時間浸して塩を除去し、カバーガラスの端をティッシュで軽く押さえて水分を取り除きます。その後、1枚のガラス顕微鏡スライドにつき5 µLの蛍光封入剤を用い、気泡が入らないように注意してカバーガラスを封入します。次に、ネイルポリッシュでカバーガラスを封印します。そして、イメージングまでスライドを適切に保存します。蛍光共焦点顕微鏡で細胞をイメージングするには、まず適切な対物レンズと画像取得に適した蛍光チャンネルを選択することから始めてください。次に、適切なイメージングソフトウェアを使用して、細胞のイメージスタックを取得します。すべての画像のキャプチャが完了したら、適切な画像解析ソフトウェアを用いてイメージスタックを崩壊（collapse）させ、スタックをTIFFファイルとして保存します。次に、コントロールと実験群のTIFF画像を画像解析プラットフォームに読み込み、Lookup Tableを選択してSequenceウィンドウでチャンネルパラメータを開きます。すべてのチャンネルタブのチェックボックスをクリックして、すべてのチャンネルを非アクティブにします。次に、チャンネル0をクリックし、チャンネル0のカラーバーをクリックして好みの色を選択します。必要に応じてチャンネルの強度を上げ、すべての構造を可視化してください。実験分析に適した各カラーチャンネルの選択と調整が完了したら、キャンバス（canvas）タブを選択し、ズーム（zoom）タブを調整して、1視野あたり約10個の細胞が表示されるようにします。ポリゴンツールを使用して、目的の細胞をクリックし、細胞の周囲に線を伸ばして細胞境界を画定します。この関心領域に名前を付けるには、関心領域ウィンドウで目的の細胞を右クリックし、関心領域の名前をダブルクリックして修正します。同様の方法ですべての目的の細胞を選択して命名した後、「Detection and Tracking」タブ内にある「Spot Detector」アプリケーションを開きます。「Pre Processing」タブを開き、解析するチャンネルを選択します。「Detector」タブ内で、「Detect bright spots over dark background」を選択し、適切なスケールと感度を設定します。「Region of Interest」タブで、シーケンスから推奨される関心領域を選択します。「Filtering」タブで「NoFiltering」を選択します。「Output」タブで、適切な出力先を選択してください。「Remove previous spots rendered as regions of interest」を選択し、「no file selected」をクリックして、ファイルを保存するフォルダを選択します。次に、「Display」タブで関心のある適切なオプションを選択し、「Start Detection」をクリックします。イメージング解析ソフトウェア内のスポット検出機能を使用して、指定した各関心領域（ROI）内のストレス顆粒を特定できます。その後、特定されたすべてのストレス顆粒を表示するためのバイナリ画像を生成することが可能です。ストレス顆粒の解析は、解析対象となる各ストレス顆粒の特性に合わせて慎重に調整する必要があります。例えば、検出する関心領域（ROI）のサイズ要件を変更したり、検出パラメータの感度を変更したりすると、結果が変動します。ピクセルサイズの設定を大きくすると、より小さなストレス顆粒がカウントされなくなり、ストレス顆粒の数が減少します。感度を上げると、ストレス顆粒の検出数が増加します。例えば、本実験では、スケール2で感度100とした場合に、ストレス顆粒マーカーであるG3BP1において最良の結果が得られました。一方、スケール2で感度55とした場合に、ストレス顆粒マーカーのEIF3Bにおいて最良の結果が得られました。その後、ストレス顆粒のサイズから表面積を算出できます。頻度分布図は、異なる細胞集団間でのストレス顆粒のサイズの変動を強調するのに有用です。さらに、蛍光強度は、解析したストレス顆粒の質に関する情報を提供します。習得すれば、ホールセルチャレンジは約6〜7時間で実施でき、解析にはさらに2〜3時間かかります。この手順を行う際は、データのばらつきを最小限に抑えるため、コントロール試料と実験試料を常に同時に、かつ同一の条件下で処理することが重要です。本手順に従った後、解析を3次元ボリュームに拡張することで、ストレス顆粒の局在に関するさらなる知見を得ることが可能です。この半自動の手法により、非感染細胞および感染細胞におけるストレス顆粒の厳密かつ不偏的な解析が可能になります。これにより、これまで未知であったストレス顆粒経路の転用を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、細胞への細菌感染方法、ストレス顆粒形成の誘導方法、およびストレス顆粒を定性的・定量的に解析するための半自動アプローチの使用方法について、十分に理解できるはずです。また、Shigella flexneriやクロトリマゾールのようなストレス顆粒誘導剤は危険を伴う可能性があるため、手袋の着用、BL2ラボでの作業、およびすべての試薬の適切な廃棄などの予防策が必要であることに留意してください。

immunofluorescence-analysis-stress-granule-formation-after-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Cayron、J.、 et al。 ストレス処理下での細菌増殖のマルチスケール解析 J. Vis. 経験。...

マイクロ流体チャンバーを用いたストレス下での細菌増殖の顕微鏡解析

出典: Vonaesch, P. ら、 哺乳類細胞の細菌挑戦後のストレス顆粒形成の免疫蛍光解析。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオは、病原性細菌シ ゲラ・フレクスネリ...

がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

このビデオでは、mRNA、RNA結合タンパク質(RBP)、およびその他のさまざまなタンパク質で構成される哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量化のためのアッセイを示しています。...

哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ

我々は、迅速な抗生物質感受性試験のためのマイクロ流体プラットフォームを開発した。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ることができます。...

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。...

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。...

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

B 細胞受容体に対する抗体、初期段階のモデルをコーティングした coverslips に拡がっている B 細胞で同時にイメージ アクチン構造、微小管と微小管プラス端結合蛋白質に STED...

アクチンおよび誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡を用いた B 細胞免疫シナプスにおける微小管細胞骨格の可視化

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

このプロトコルは、単一細胞および細胞集団レベルでのストレス条件下での細菌増殖の時間分解された記述を可能にする。...

ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析

蛍光顕微鏡画像で特定の細胞区画内の細胞体を迅速に探査し、正確に分析するために構築された自由に利用可能なワークフローを提示します。このユーザーフレンドリーなワークフローはオープンソースソフトウェアのIcy上で設計され、また、ImageJの機能を使用しています。パイプラインは、画像解析に関する知識なしに手頃な価格です。...

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

学ぶ細菌感染が哺乳動物細胞のストレス顆粒形成に与える影響を免疫蛍光法で定量的に解析する方法。無料画像解析プログラムを用いた自動化された厳密な解析により、宿主病原体相互作用の理解が深まります。

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

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