Question 1

ゲノム編集技術はどのようにDNAに標的となる変異を作り出すのでしょうか？

Accepted Answer

ゲノム編集法では、人工的に設計されたヌクレアーゼ酵素を使用して特定のDNA配列に小さな切れ目や二本鎖切断を作ります。細胞はこの損傷を非同源末端結合または相同性誘導修復を通じて修復しようとします。修復過程で、従来の遺伝子ターゲティングの方法よりもはるかに高い効率で標的領域に変異が導入されます。

Question 2

DNA修復におけるNHEJとHDRの違いは何ですか？

Accepted Answer

非相同末端結合（NHEJ）は壊れたDNAの末端を直接的に再封するが、しばしば不完全に、塩基を欠落させたり追加したりして、ターゲット配列に変異を起こす。相同性誘導修復（HDR）は相同テンプレートからコピーすることで損傷を修正し、研究者がターゲット部位に正確な変化を誘導するために特定の配列を追加することを可能にする。

Question 3

亜鉛指核酸酵素とTALENは、ターゲティングアプローチにおいてどのように異なりますか？

Accepted Answer

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNs）は、DNA結合ジンクフィンガードメインをFokIエンドヌクレアーゼと融合させ、各ドメインは特定のヌクレオチドトリプレットを認識します。TALENsは、FokIを細菌の転写活性化因子様エフェクタードメインと結合させ、各ドメインは単一のユニークなDNA塩基を認識し、異なるレベルの配列特異性を提供します。

Question 4

CRISPR-Cas9システムは、タンパク質ベースのゲノム編集法と比較してなぜ有利なのでしょうか？

Accepted Answer

CRISPR-Cas9システムは、Cas9を望ましい遺伝子配列にターゲットにするために、シングルガイドRNA（sgRNA）と呼ばれるカスタマイズ可能なRNAガイド配列を使用します。このRNAベースのアプローチは、ZFNやTALENなどのタンパク質ベースの方法と比較して明確な利点を提供します。なぜなら、ガイド配列は哺乳類細胞や他のシステムのほぼ任意のゲノム位置をターゲットにするために容易に修正できるからです。

Question 5

CRISPR-Cas9のターゲティングにおいて、プロトスペーサー隣接モチーフはどのような役割を果たしていますか？

Accepted Answer

プロトスペース隣接モチーフ（PAM）は、標的DNA領域の3'端に位置する3塩基対の配列です。Cas9は標的DNAを認識し切断するためにPAMを必要とし、正確なPAM配列はCas9酵素が由来する生物に特異的であり、ゲノム編集の成功に不可欠です。

Question 6

CRISPRのガイド配列はどのように合成され、細胞に組み込まれるのでしょうか？

Accepted Answer

ターゲット配列にマッチする2つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、変性させ、アニーリングします。結果として生じたガイド配列を、制限酵素とリガーゼを使用してsgRNAスキャフォールドを含むプラスミドに配列結合します。CRISPR構築体は、その後Cas9をコードする構築体とターゲット細胞に共同トランスフェクトされ、培養され、望ましい変異をPCRまたはシーケンシングによってスクリーニングします。

Question 7

研究におけるゲノム編集の現在の応用は何ですか？

Accepted Answer

研究者はゲノム編集を使用して、特定の遺伝子に緑色蛍光タンパク質のようなレポーター配列を挿入し、遺伝子を機能不全にしノックアウト生物を作り出し、同じ染色体領域に二重鎖切断を誘導することで大きな遺伝子欠失を作り出します。これらの応用により、モデル生物や培養細胞における遺伝子機能 および疾病 メカニズムの研究が可能になります。

ゲノム編集 - 評価クイズ