Name: レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶレーザー局在化鎖間架橋の単一分子解析法。ゲノムDNA中の損傷分布を直接可視化し、DNA修復分野における細胞応答メカニズムの解明に貢献する革新的アプローチを示す。

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本研究は、（Z01 AG000746-08）とファンコニ貧血研究基金を老化にNIH、国立研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

掘る-TMPの調製<ol><li> 50mgの4&#39;-クロロ-4,5-の（0.18ミリモル）&#39; 、8-トリメチルソラレンおよび590 mgの乾燥した25mLの丸で4,7,10-トリオキサ-1,13- tridecanedi -アミン（2.7ミリモル）の混合窒素下-bottomフラスコ。 12時間、10mLのトルエン及び還流を加えます。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。 <ol><li>シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製。クロロホルム、メタノール、及び28％アンモニア溶液（1：1：0.5 9）でカラムを溶出します。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、そして回復純粋4「 - [N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5」、8-トリメチルソラレンのように粘性の淡黄色液体。 </li><li>でジゴキシゲニンNHSエステルを、5mgの（0.008ミリモル）と8-トリメチルソラレン - [[N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5 &#39;4の5.5ミリグラム（0.012ミリモル）の混合窒素下で乾燥した丸底フラスコ。 0.5mLの無水N、N-ジメチルホルムアミドを加える（DMF）AND 3.4トリメチルアミンμL、18時間50℃で撹拌しました。 </li><li>減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。 </li><li>ジクロロメタンの最小量の残留物を溶解させます。固定相としてのシリカゲルと水平取薄層板の下部に2μLスポットに溶液を適用します。クロロホルムで分取TLCを実行：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）。 </li><li>垂直エッジを除いてプレートをマスクし、短波長UV 254 nmのランプを有する生成物のバンドを識別する。スパチュラを用いてプレートから製品をこすりとクロロホルムを使用して、純粋な生成物を単離：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）の混合物。 </li><li>減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去。 50％エタノール1mL中の残留ペレットを溶解：すべての溶媒が蒸発するまでH 2 Oは、（約3時間）、遠心エバポレーターで50μLの1.5 mLチューブ（〜20のアリコート）における一定分量及び乾燥に分配します。 </li><li>遠心蒸発器で再びH 2 O及び乾燥：50％EtOH中の200μLの各アリコートを再溶解。 50％エタノール200μlに再度各アリコートを溶解：H 2 O、長期保存のために-20℃で遠心蒸発器と店舗ペレットで乾燥。 </li></ol></li><li> H 2 Oで1準備：H 2 O中に溶解掘る-TMPの100希釈し、250 nmでODを測定し使用するために、50％エタノール50μlにペレットを溶解します。掘る-TMPの吸光係数は25,000です。 -20℃で保存した場合に解決策は、約一ヶ月のために安定しています。各使用前に250 nmでODを測定することにより、濃度を確認してください。 <ol><li>ストック濃度を計算する：ABS×100×10（μMで）6 / 25,000 =濃縮。典型的には、ストック溶液は、約3mmです。培地に添加エタノールの体積を最小限にするために、この範囲内であることが重要です。 </li></ol></li></ol> 2.レーザーローカライズのDig-TMPのICL <ol><li> PESRSの窒素レーザー（337nm）を有する共焦点顕微鏡でrformレーザ局在は、365nmの線を放出し、0.7ナノワットの電力で、10Hzで3ナノ秒パルスを発射染料セルを通してポンピング。 </li><li> 35ミリメートルのガラスの側に縦のマークを作るマーキングペンで細胞培養皿底。皿の側にブラックストライプが交差の一方のアームの最上部にあるように、ダイヤモンドペンを用いて培養表面上のガラスの中心に十字を傷つけます。また、細胞を同じ焦点面になるようにクロスは、ガラスの成長表面上にマークされています。 </li><li> 70％のEtOHすすぎでマーキングした後、プレートを滅菌します。細胞を播種する前にドライ。 </li><li>クロスでのプレートの細胞（例えばHeLa細胞またはU2OSなどの標準的な実験室株）は1日か2日前に培養皿をマーク。細胞は活発に分裂し、実験の日に百分の50から70の合流する必要があります。均一ラベルDNAを1μMの5-クロロ-2-デオキシウリジン（CldU）で24時間インキュベートします。 </li><li>加えます20μMの最終濃度まで細胞培養培地へのH 2 O：50％EtOH中のDIG-TMP。 37℃にメディアを持参してください。掘る-TMPを平衡化させるために30分間インキュベーター内で細胞や場所にわたって培地（37℃、5％CO 2）に変更。 </li><li>細胞をインキュベートしている間、レーザがアクティブである視野のX / Y座標を確立します。レーザは、水平および対角線に沿ってミラー化スライドガラスをエッチングするためにソフトウェアによって指示された製造業者の較正手順に従います。 2行はレーザーがターゲットを打つことが可能なフィールドの境界を画定します。 </li><li>顕微鏡ステージ上に、制御されたCO 2及び湿度37°Cで、環境チャンバ内にプレートを置き、十字の交差点で60X油目的に焦点を当てます。 </li><li> 、ソフトウェアでシェイプツールと研究者によって確立されたROIに365 nmのレーザービームを向ける3のストライプを形成するために＆＃181;0.6μmとし、MX。 ROIの輪郭が十字の交差点のすぐ近くに位置する細胞の核内にカーソルが配置されています。核を介してレーザ途中を標的とするように、Z焦点面を調整します。 350〜370ナノメートルの範囲でレーザーを使用してください。 405nmのレーザーは、架橋19を誘導することができません。 注：我々は、微分干渉コントラスト（DIC）画像で核質と区別することができる核小体、外核質領域にROIを見つけます。 </li><li> （セルが暗くなり、その後消え）細胞を抹消するのに十分なレベルに電力設定値を増加させることにより、レーザの焦点及び活性を検証します。これは、顕微鏡を介して、次いで、カバーガラスを通って細胞内へのレーザのための妨げられない光路のために重要な診断です。 <ol><li> （これは各レーザー/マイクについて経験的に決定されなければならソラレンとICL誘発DDRを活性化させるのに十分なだけに電力設定を下げroscope組み合わせ）。 （γ-H2AXの形成によって監視）ソラレンの不在でDDRを活性化しないレーザー強度設定（ここでは1.7％）を使用します。 注：これは重要な決意であり、レーザ光源や光パス内のコンポーネントが変更された場合に設定が調整を必要とするかもしれません。 GFPの蓄積に従う迅速レーザソラレンストライプに（秒）募集されているが、単独のレーザに露出ROIしないどちらもそのようなXPC又はFAN1として修復タンパク質を、タグ付けされました。数分は他人のために必要とされる一方、DDRのいくつかのタンパク質は、数秒以内に表示されます。関心のある各タンパク質のための時間経過の決定を行う必要があります。また、レーザに露光されなかった細胞で応答するタンパク質のないストライプが存在しないことに注意してください。 </li></ol></li><li>フィールド内のすべてのセルは、クロスの交差点の近くに滞在し、新しいフィールドにプレートを移動標的にされた後。 </li><li> determに設計された実験では、インター病変距離の分布は、交差点の周囲20-25フィールド（4-5細胞/フィールド）レーザに細胞をさらすINE。ローカライズのICL近傍の複製パターンを分析するために、レーザ発射後、10μM5-ヨード-2-デオキシウリジン（IDU）で細胞をインキュベートします。 注：IDUとのインキュベーションの時間はある程度任意です。我々は（下記参照）を20分と短く、60分ほど長く使用してきました。より長いパルス（数時間）は、多くの場合、このように画像に単一フォークの進行状況を機会を失って、合体複数の複製路につながります。いくつかの実験において、CESは、複製トラクトのパルス標識続いて、DIG TMPへの曝露の前に標識DNAを均一するために24時間CldUで標識されます。 </li></ol> 3.細胞の収穫とDNAの繊維の延伸<ol><li> 、ステージからプレートを取り外し培地を除去し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。 PBS溶液を除去。商用トリプシンの10μLのドロップを置きますガラス表面の中央に十字の交差点に/ EDTA溶液。 </li><li>室温（RT）で3~4分間インキュベートした後、ピペットチップに剥離した細胞とのトリプシン溶液を描きます。トリプシンを中和する必要はありません。 </li><li>シラン処理ガラス顕微鏡スライドの一端に細胞とトリプシン/ EDTAの滴を置き。溶解細胞および0.5％SDS溶液10μLを添加することによってDNAを放出し、プールの周囲を乾燥させ、ピペットチップで穏やかに混合し、室温で3~4分間インキュベートします。 </li><li>スライドを傾け20ºと液体は最後まで実行することができます。 DNA繊維を流れる液体の流体力学的な力によって延伸/伸長されます。スライドを空気乾燥（約10分）とすると3に修正：10分間、1つのメタノール/酢酸。再び定着液と空気乾燥からスライドを削除します。この時点で、彼らは、-20℃で、70％EtOH中で無期限に保存することができます。 70％エタノールから除去して、NEの前に空気乾燥さ許可XTステップ。 </li><li> PBSでスライドを洗浄し、次いで、室温で1時間、2.5 M HCl中で変性。この治療法は、DNAが抗体に組み込まハロゲン化核酸塩基がアクセスできるように脱プリン化します。 </li><li> 0.4 Mトリス-HCl、pH7.4中のスライドを中和します。 5分ごとにPBS / 0.5％のTween-20（PBST）で二回洗浄します。 </li><li>ブロックは、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）および10％ヤギ血清をスライドします。スライド上に均一にブロッキング溶液を広げ、室温で1時間インキュベートしパラフィンで穏やかにスライドを覆います。 </li><li>各スライドをラット抗ブロモデオキシウリジン（具体CldUが検出）一次抗体をブロッキング溶液で200倍希釈1のピペット100μL。スライド上に均一に希釈を広げ、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートするパラフィルムで穏やかにスライドを覆います。パラフィルムを外し、5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>各スライドのブロッキング溶液中：（100 1）ヤギ抗ラットアレクサフルオロ647希釈のピペット100μL。カバーパラフィルムで軽くスライドし、RTで45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li> ：200希釈（1時40分）マウス抗ブロモデオキシウリジンは（LDUとCldUを検出するこの二重特異性は、インキュベーション前にラット抗BrdUのによりCldUの遮断を必要とする）一次抗体およびウサギ抗DIG抗体（1のピペット100μL ）各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで穏やかにスライドをカバーし、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li> （1：100）、ヤギ抗マウスアレクサフルオロ488およびc（1：5,000）で希釈のピペットで100μLのヤギ抗ウサギプローブ（ 例えば 、Qドット655）は、各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで軽くスライドを覆い、室温で45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>ペーパータオル上に過剰PBSTを排出します。各スライド上に退色防止封入剤の50μLを追加し、カバースリップでカバーしています。画像や店舗用-20℃で48時間以上いいえ。 </li></ol>蛍光顕微鏡による4.ファイバーイメージング<ol><li> FITC、Cy5でおよびQドット655の検出が取り付けられ、完全に電動フィルタホイールを有する倒立顕微鏡上で63X対物レンズを介して画像取得を行います。励起フィルター425 nmであり、発光フィルターは、発光ピーク20を中心とする20nmのと655 nmです。 </li></ol>

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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

レーザーローカライゼーション技術は、明視野顕微鏡で表示されている核を有する接着細胞を使用する必要があります。我々は、ポリリジンまたはコラーゲン、またはより複雑な混合物のような細胞接着製剤でガラス表面に、例えば一次リンパ球、又はAD293などの緩く付着培養細胞などの非接着細胞を、取り付けることを試みました。これらの治療は、表面に細胞を結合することができるが、我々は、彼らは一般的に、それは非常に困難核に注力すること丸みを帯びとどまることがわかります。さらに、細胞は、しばしば、増殖培地を除去した後の最初の洗浄を生き残るために失敗します。しかし、接着細胞のための要件の中に、我々はこれらの研究のための標準的な細胞株の幅広いだけでなく、一次細胞を正常に使用しています。マイコプラズマ汚染のために細胞をテストするために有用です。私たちは、細胞応答はこれらの感染によって変更されていることがわかります。 レーザーの焦点面が重要です。目標はにあります核内のICLを配置します。高すぎると光活性化は、核の上になります。低すぎると、それはガラスの上になります。私たちは、それが役に立つ細胞質と核の交差点でDIC...

DNAはまた、それはまた、酸化的代謝によって産生される内因性ラジカル種に襲われるなど、放射線、紫外線、環境有害物質、燃焼生成物、などの外因性物質から一定の攻撃の下にあります。これらのすべては、化学的または物理的DNA 1の完全性を破壊する可能性があります。ゲノムにおける摂動は、病変の修復に関与するタンパク質とマイクロRNAのない場合は、何千、何百ものDNA損傷応答（DDR）、リクルートおよび翻訳後修飾カスケードを活性化することができ、細胞周期、アポトーシス、老化、および炎症経路の調節2。 DDRについての私たちの情報のほとんどは、DSBは用いた研究から来ています。これは、生きた細胞3のゲノムDNAに、配列特異的な休憩を含め、休憩を導入するための技術の利用可能性に大部分です。また、propensit免疫蛍光法によって表示することができDDRタンパク質、巣を誘導する切断のyは、タンパク質の応答の動態と要件を識別するために非常に役立っています。 DDRを研究するための重要な技術の一つは、生きた細胞4の核に「関心領域」にDSBのストライプを指示する（ROI）のレーザービームを使用ボナーや同僚、によって導入されました。実際に、彼らはDDRのタンパク質が免疫蛍光法によって識別することができたに長い焦点を作成しました。これは、レーザ曝露された細胞におけるリン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の強力なストライプのそれらの実証によって示されました。それ以来、レーザーアプローチは、DSBはによって誘発されるDDRの多くの研究で採用されてきました。パワフルで人気の、そして劇的な免疫蛍光画像のソースが、病変のアイデンティティを心配することなく、観察可能な結果を​​生成するために、ほとんどの実験ではレーザー強度を調整することに留意すべきです密度、または間隔。確かに、これらの見積りを行うことが困難な場合があります。したがって、それらは主にレーザー5によってDNAに導入された病変の多数にもかかわらず、無視されます。これは、文献6には多くの矛盾に貢献しています。 DSBは対照的に、DNAのほとんどの化学修飾は、DDRタンパク質の離散病巣の形成を刺激しません。これは、病変の周波数の私達の現在の理解の光の中で重要です。培養中のヒト細胞がS期7、8、9中大きく形成され、細胞周期あたりのような多くの50のDSBを招くと推定されています。少数の非増殖細胞に形成されています。これは、セル/ 1日目、10あたり数万である核酸塩基の損失または変更イベントの数とは対照的です。したがって、我々は、最大で約知っていますDDRは比較的まれであるイベント、および集計にはるかに共通している螺旋歪曲病変によって誘発されるものについてあまりにより誘発されます。 ゲノムDNAの共有結合修飾に対する細胞応答についての質問に対処するために、我々は固有のDDR誘導活性を有していたDNA付加体を歪まリックスで動作するように望んでいました。さらに、実験デザインや解釈を容易にするために、我々は時間にその導入に関して制御することができた構造に興味を持っていたと可視化に適しました。したがって、我々はソラレンに基づいた戦略を開発しました。サイトで：ソラレンはよく5&#39; TAを好む光活性DNAインターカレーターを特徴としています。長波紫外線（UVA）光にさらされない限り、このようなナイトロジェンマスタード及びマイトマイシンC（MMC）のような他の架橋剤とは異なり、それらはDNA反応性ではありません。インターカレート分子は螺旋歪ま間架橋を生成するために、反対の鎖上のチミン塩基（のICLと反応します）11。私たちの実験で使用したトリメチルソラレンではほとんどの製品が形成されていない比較的少ないモノ付加物が（10％未満）が生成されているのICL、12、および一方の鎖上の隣接する塩基間の鎖内架橋があります。彼らは複製および転写、ソラレンおよび他の架橋剤を強力にブロックされているので、シスプラチンとMMCのように、一般的な化学療法で使用されています。したがってソラレンヘリックス歪ま構造によりDDRの活性化に続いて、また、臨床的重要性を有する化合物に対する細胞応答への洞察を提供した研究を可能にしました。 私たちは、トリメチルソラレンは（DIG）をジゴキシゲニンにリンクされた試薬を合成し、植物ステロールは、哺乳動物細胞中に見出され、頻繁にimmunotagとして使用されていません。光活性化のための要件は、生細胞中の核に定義されたROIにおけるソラレンのICLのレーザ光（波長365nm）によって局在化を可能にします。これらは、IMMで表示することができますディグタグに対するunofluorescence。 DNA修復およびDDRタンパク質はのICL 13、14ローカライズレーザのストライプ状に現れました。 DSBを生成するために使用される高レーザ強度によって活性化DDRは、単離されたまたはクラスタ化された損傷15,16に起因するかもしれません。その結果、はるかに低い濃度で存在し、自然に病変を発生するために、これらの実験からの結果の関連性は、不確実です。 DNAにおけるソラレン付加頻度と間隔について同様の質問に対処するために、我々は、DNAの繊維技術17とimmunoquantumドットを利用しました。量子ドットは、蛍光色素よりもはるかに明るい光への曝露によって漂白されていません。従って、それらはしばしば単一分子イメージング18、蛍光色素が不十分明るいされるアプリケーションのために使用されます。個々のDNA繊維は、Gに延伸することができますLASSスライド前細胞収穫にインキュベーション中に組み込まれるヌクレオシド類似体に対して免疫蛍光によって表示することができます。我々は、DIGソラレンで細胞を処理し、レーザマイクロ照射にROIを露出します。繊維は、細胞から調製し、個々のDig-ソラレン付加物はimmunoquantumドットで可視化することができます。比較的短い時間（20-60分）類似体ヌクレオシドに細胞を曝露することレーザ局在のICLの近傍における複製トラクトの表示を可能にします。

<table><tbody><tr><td>ジゴキシゲニン NHS エステル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>ジアミノグリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>アンモニウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC プレート</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flassガラスカラム24/40、100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2回転ディスク共焦点顕微鏡、自動ステージと環境制御チャンバーとプレートホルダーを装備</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Volocityソフトウェア</td></tr><tr><td>マイクロポイントガルボ付き&nbsp;</td><td>窒素パルスレーザーを使用した</td><td>Andor Technologies</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>色素セル</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 染料</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mmガラスBotommプレート1.5カバーガラス、10 mmガラス直径、コーティングされていない</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>新参者供給</td><td>部品#5070</td><td>新しいシランスライド</td></tr><tr><td>マウス抗BrdU抗体(IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 in 40</td></tr><tr><td>ラット抗BrdU抗体(CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 in 200&nbsp;</td></tr><tr><td>ウサギ抗Dig抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 ヤギ抗ウサギIgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q-11421MP</td><td>1 in 5,000</td></tr><tr><td>AF647- ヤギ抗ラットIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>112-605-167</td><td>100</td></tr><tr><td>AF488-ヤギ抗マウスIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>115-545-166</td><td>100</td></tr><tr><td>ツァイスエピ蛍光顕微鏡 A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp;Axiovisionソフトウェア</td></tr><tr><td>Q-dot 655</td><td>フィルターChroma</td><td>39107</td><td></td></tr>を使用</tbody></table>

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

DNA損傷応答（DDR）が広範囲に生細胞におけるレーザーマイクロビーム照射による二本鎖切断（DSB）の研究で特徴づけられています。 DDRは、ストランド間のDNA架橋（のICL）を含む共有結合性DNAの修飾を歪まヘリックスするために、同様に定義されていません。私たちは、生きた細胞の核に、immunotaggedソラレンのレーザー光活性化により、ローカライズのICLによって刺激DDRを、研究してきました。付加物の分布と複製フォークの出会いについての基本的な問題に対処するために、我々は他の二つの技術とレーザー局在を組み合わせます。 DNAの繊維は、多くの場合、短いパルスの間に組み込まれたヌクレオシド類似体の免疫蛍光による複製フォークの進行状況を表示するために使用されます。 Immunoquantumドットが広く、単一分子イメージングのために使用されてきました。新しいアプローチでは、レーザ局在のICLを有する細胞からのDNAの繊維は、顕微鏡スライド上に拡散されます。タグ付きのICLはimmunoquantumドットと目に表示されます電子間の病変の距離が決定します。 ICLと複製フォークの衝突を可視化することができ、さまざまな出会いのパターンを識別し、定量化しました。

レーザ局在掘る-TMP（ 図1A）のICLは、ソラレンに連結されたDIGタグに対する免疫蛍光によって表示することができます。レーザは、任意の輪郭の領域に衝突するように指示することができるが、ストライプは、細胞内の「自然な」形状ではなく、正規の信号が容易に起因する一次または二次抗体による非特異的結合にアーチファクトから区別することができます。完全な特異未満の抗体を使用している場合、この機能は便利です。掘る-TMPのICLのストライプでDDR、γ-H2AXの周知のマーカーの例は、図1Bに示されています。 掘るの免疫蛍光は、付加物の頻度及び間隔にどのような結論を許可しないレーザストライプに病変をタグ付け。するために、この決意細胞は前のICLの導入に24時間CldUと共にインキュベートしました。第に対する染色E CldUは掘るの可視化は、長繊維に損傷をタグ付けし、そのようなDAPI​​（4 &...

レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

この手順の全体的な目的は、ゲノムDNAにおけるレーザー局所化鎖間架橋の分布を単一分子解析し、DNA鎖間架橋に対する細胞応答を研究することです。この手法は、広く用いられている実験ツールであるレーザー技術によって導入されたDNA損傷の分布に関する、DNA修復分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、レーザー活性化化合物によってゲノムDNAに導入されたDNA損傷を直接イメージングできることです。これまでこれは不可能でした。本手順のデモンストレーションは、当研究室のJulia GichimuとHima Galiが行います。ターゲットレーザーを使用する際は、レーザーが適切なXYZ座標に当たっているかを確認し、レーザーの照射先として設定可能なカメラのキャプチャ領域を確定させるために、ミラースライドキャリブレーションを行うことが重要です。スライド上で、あらかじめエッチングされた領域を探します。露光時間とレーザー出力を設定してください。その後、フォーカスを調整し、ミラースライド上の近くの非標的領域に移動させます。キャリブレーションの手順を開始します。ソフトウェアがレーザーを照射し、ミラースライド上に水平および対角線のエッチングを行います。これらの線によって、レーザーが標的細胞に照射可能な領域の境界が定義されます。視野内にいくつかの関心領域（ROI）を設定し、レーザーを照射して、選択した領域が正確に標的となり、適切なXYZ座標に当たっていることを確認します。また、顕微鏡標的レーザーシステムのセットアップ時には、生物学的なキャリブレーションを行う必要があります。最初のステップは、トリメチルプソラレン（TMP）を光活性化させ、鎖間架橋を誘導し、あらかじめキネティクスを特性評価したGFPタグ付き修復因子のリクルートを誘発するために必要な最小レーザー出力を定義することです。この実験では、GFP-FAN1を発現するプラスミドを安定的にトランスフェクションしたU2OS細胞株を使用します。ここで示すように、細胞を6 µMのTMPと1.2%レーザー照射に10分間曝露し、一連の画像をビデオとして確認すると、標的ROIへのGFP-FAN1の集積が確認できます。次のステップは、この出力設定において、化合物を添加しない条件下では集積が誘導されないことを検証することです。ここに示すように、細胞に1.2%のレーザーのみを10分間照射し、その画像をビデオで確認すると、標的ROIへのGFP fan oneの集積は見られません。第三に、細胞を破壊（ブローアウト）させることが可能な最小出力設定を定義することが重要です。この出力設定で細胞を破壊できるかどうかを、ターゲットレーザーを使用する日に、日常的な生物学的キャリブレーションとして毎日テストする必要があります。核小体を避けて、核内にROIを設定します。フォーカスを調整してください。レーザー出力を12%に設定し、照射します。最後に、正確なターゲット設定を行うために、焦点面を細胞の中央に設定することが不可欠です。これを示すために、3つの細胞を3つの異なる焦点面でターゲットにします。細胞の中央です。高すぎ、あるいは低すぎます。標的とした3 µmにわたる一連の画像スタックを生成し、撮像焦点面全体におけるGFP fan one stripeの分布を検証します。細胞の中央を標的とした細胞のみが、すべてのZ面において1本のGFPファンストライプを示します。レーザー局在化を行う前に、細胞培養用の35 mmガラスボトムディッシュを準備します。マーキングペンを使用して、各ディッシュの側面に垂直な印を付けます。ダイヤモンドペンを用いて、培養面のガラス中央に十字形に傷をつけます。このとき、ディッシュ側面の黒い線が十字の一方の腕の頂点に来るようにしてください。十字の印は、細胞と同じ焦点面に位置するようにガラスの増殖面に刻みます。細胞を滅菌済みの十字印付き培養ディッシュに播種し、DNAを均一にラベルするため、1 µM の 5-クロロ-2'-デオキシウリジンを含む培地で24時間インキュベートします。実験当日に、50%エタノールに溶解したdigoxigenin結合TMP（dig TMP）を、最終濃度が20 micromolarとなるように細胞培養液に添加します。培地を37 degrees Celsiusまで温めます。培養皿内の培地をdig TMPを含む培地に交換し、dig TMPを平衡化させるため、37 degrees Celsius、5%CO2条件下で30分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、先に示した通り、ミラースライドのキャリブレーションと細胞の12%ブローアウトを行います。プレートを、CO2濃度と湿度が制御された37°Cの環境チャンバーに入れ、顕微鏡ステージ上に設置します。60倍のオイル浸漬対物レンズを用いて、十字線の交点に焦点を合わせます。最初にターゲットとする領域を選択し、シェイプツールを使用して、十字の交差箇所の直近にある個々の細胞内にROIを設定します。核小体以外の核質領域を選択してください。Z方向の焦点面を調整し、レーザーが核の中間に当た sao ように設定します。次に、鎖間架橋誘発DNA損傷応答におけるソラレンを活性化させるために必要な最小限のパワー設定を行います。ここでは1.2%を使用します。レーザーを照射してください。視野内のすべての細胞を標的にした後、プレートを新しい視野に移動させます。その際、十字線の交点に近い位置を維持してください。これまで示した手順を12〜18視野で繰り返し、計80〜100個の細胞を標的にします。細胞を回収するには、ステージから培養皿を取り出してください。培地を除去し、PBS溶液で細胞を洗浄します。PBSを除去し、市販のtrypsin EDTA溶液を10 µL、ガラス表面中央にある十字の交点に滴下します。室温で3〜4分間インキュベートした後、剥離した細胞を含むtrypsin溶液をピペットチップで回収します。細胞を含むtrypsin EDTAの液滴を、シラン化ガラス顕微鏡スライドの一端に滴下します。細胞を溶解させDNAを放出させるため、5% SDS溶液を10 µL加え、室温で3〜4分間インキュベートします。その際、ピペットチップで穏やかに混ぜながら、液滴の周囲を乾燥させます。スライドを20度に傾け、液体を端まで流します。流体の流体力学的力によって、DNAファイバーが伸展および伸長されます。スライドを10分間自然乾燥させます。その後、メタノールと酢酸を3:1の割合で混合した溶液にスライドを浸し、10分間固定します。その後、固定液からスライドを取り出し、再び風乾させます。この段階で、スライドは20 °Cの70% ethanol中で無期限に保存することが可能です。蛍光顕微鏡を用いてDNAファイバー上のDIGシグナルを検出するためにスライドを処理する場合、伸展させたDNAを含むスライドを70% ethanol溶液から取り出し、風乾させます。続いて、塩化水素でDNA繊維を変性させた後、中和させるためにpH 8のトリス塩酸塩が入った容器に移します。次に、サンプルをPBSで洗浄します。最後に、既報の手順に従い、適切な抗体で染色します。dioxigeninタグを付加したトリメチルソラレンの構造が示されています。DNA鎖間架橋（ICL）は、dig TMPに対する免疫蛍光染色によって検出可能です。この例では、赤色で可視化されたレーザー局所ICLを含むROIにおいて、DNA損傷応答の既知のマーカーであるgamma H2AXが緑色で可視化され、蓄積している様子が示されています。DAPI染色された核は青色に示されています。明視野像では、ダイヤモンドペンで付けられたマークの上に細胞の一部が位置していることがわかります。ROI（関心領域）は核小の外側に配置されていることに留意してください。付加体の頻度と間隔を決定するため、ICLを導入する前に、細胞を5-クロロデオキシウリジンで24時間インキュベートしました。細胞を回収してDNAファイバーを伸展させた後、DIGシグナルをアミノ量子ドット（赤色で可視化）で、5-クロロデオキシウリジンをアミノ蛍光（緑色で可視化）でそれぞれ検出しました。ファイバー上のDIGシグナルの解析により、ICL間の距離は10 KB未満から160 KB超までの範囲であることが判明しました。付加体のクラスター化を示す証拠は見られませんでした。これらのガイドラインに従えば、適切な波長のレーザーで局在化可能な酸化病変などの、他のDNA付加物に本アプローチを拡張することが可能であると考えられます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオは、単一細胞からのタンパク質分泌物を検出するための局所的な表面プラズモン共鳴イメージングを示しています。マイクロ流体セットアップとペプチド結合プラズモニックナノ構造チップを使用すると、共鳴角での反射光強度の変化により、単一細胞から分泌されたタンパク質との相互作用が明らかになります。...

単一細胞からのタンパク質分泌物を検出するための局在表面プラズモン共鳴イメージング

我々は、H 2 O 2 / H 2 O溶液（0.01％-0.5％）またはメタノール溶液で満たされたマイクロ流体チャンバ内でサンプルを照射することにより、親水性又は疎水性の状態にするのSi（001）表面を処理されたHF の現場変更でのプロセスについて報告相対的な低パルスフルエンスのパルスUVレーザーを使用して。...

液体環境におけるパルスUVレーザー照射によるシリコン表面の濡れ性の選択エリア変更

電子分光イメージングは、ナノメートルの分解能で核酸とタンパク質を画像化し、区別することができます。miniSOGシステムと組み合わせることで、透過型電子顕微鏡サンプル中のタグ付きタンパク質を特異的に標識することができます。これらの技術の使用を例として、二本鎖断線修復病巣を使用して説明します。...

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ...

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ...

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

このプロトコルは、インラインラジカル線測定とプラズマ光源を使用して、フラッシュ酸化タンパク質のフットプリントを実行する方法を提示する。この方法は、タンパク質研究の高速光化学酸化の再現性を簡素化し、改善するために、危険なUVレーザーを置き換えます。...

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

このプロトコルは、レーザーマイクロ照射によるDNA修復タンパク質の採用測定など、下流顕微鏡研究のためのS相細胞を効率的に同定するための非侵襲的な方法を記述する。...

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

ここでは、レーザーマイクロダイセクションを介してヒトの死後黒質緻密組織から神経メラニン顆粒を分離するための堅牢なプロトコルを示します。この改訂および最適化されたプロトコルは、サンプル収集に必要な時間を大幅に最小限に抑え、必要なサンプル量を削減し、LC-MS/MS分析によるタンパク質の同定と定量を強化します。...

ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル

学ぶレーザー局在化鎖間架橋の単一分子解析法。ゲノムDNA中の損傷分布を直接可視化し、DNA修復分野における細胞応答メカニズムの解明に貢献する革新的アプローチを示す。

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

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