Name: 次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぼう、次世代エレクトロポレーションを用いた初代ヒトTh17細胞への小さなRNAトランスフェクション法を。T細胞分化と免疫機能の遺伝子制御を研究し、高効率な遺伝子発現解析が可能です。

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この作業は、米国国立衛生研究所の助成金（R01HL109102、P01HL107202、U19CA179512、F31HL131361）、白血病リンパ腫学会奨学生賞（K.M.A.)、国立総合医科学研究所（NIGMS）医学者研修プログラム（助成金 #T32GM007618）（M.M.）によって支援されました。

このプロトコルは、人間研究倫理のためのUCSFのガイドラインに準拠しています。 T細胞培養、CD4 + T細胞の単離、及びのTh17分極の調製<ol><li> 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり1.5mLの0日目に、コート6ウェル組織培養プレート37°C。 <ol><li>代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。 </li></ol></li><li>製造者の指示に従って、密度勾配遠心分離によって臍帯血単核細胞（CBMCs）を準備。 注意：慎重に作業し、血液媒介病原体への曝露のリスクを回避するために、ヒトの血液を取り扱う際に着用され、適切な個人用保護具（PPE）を確保。 </li><li> 単核細胞を単離し、洗浄した後、負SELEによるヒトCD4 + T細胞単離を行います市販のヒトCD4 + T細胞のキットを使用してction。 注：単核細胞の単離後に赤血球の混入がある場合、オプションの赤血球の溶解がCD4 + T細胞単離工程の前に行ってもよいです。分離緩衝液（PBS中2％FBS）1mLの単核細胞を再懸濁します。 1X溶解溶液5mLを加えます。室温で15分間インキュベートします。次いで、細胞をペレット化し、4℃で5分間、300×gで分離緩衝液及び遠心分離機の5ミリリットルを加えます。 <ol><li>新しい5mLのチューブに分離バッファー500μLあたり50×10 6の密度で単核細胞を再懸濁します。 </li><li> FBSの100μL、次いでよく混合するオービタルシェーカー上で20分間、4℃で各チューブをインキュベートチューブ当たり抗体混合物の100μLを加えます。 </li><li>インキュベーション後、細胞を洗浄し、分離緩衝液の3-4 mLを加え。細胞をペレット化し、4℃で8分間、300×gで細胞を遠心分離。慎重にsupeを吸引rnatant。 </li><li>このスピンの間に、磁気ビーズを事前に洗います。ビーズを洗浄し、分離緩衝液の等量を追加します（細胞と1：1で使用）を新しいチューブに磁気ビーズの所望の量を転送します。 1mLのマイクロピペットを用いてよく混合した後、少なくとも1分間磁石中に管を置き。注意深く上清を吸引除去します。最初の前洗浄に移し、同じボリューム内の磁気ビーズを再懸濁。 </li><li>分離緩衝液500μlで各チューブに細胞を再懸濁し、予め洗浄した磁気ビーズの500μLを加えます。 </li><li>よく混合するために室温（25°C〜18°C）でオービタルシェーカー上で15分間、磁気ビーズで細胞をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、十分少なくとも10倍1mLのマイクロピペットを用いて細胞をピペット。次いで、分離バッファー3-4 mLを加え、2分間磁石中に各管を配置します。 </li><li>慎重にある負の選択CD4 + T細胞を転送します新しいチューブに上清。 </li></ol></li><li> CD4 + T細胞の分離が完了すると、血球計数器で細胞をカウントし、氷上で細胞を維持します。 </li><li> PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。抗ヒトIFNγ（20μgの/ mL）を、抗ヒトIL-4（20μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（10ng / mLの）、ヒト：次いで、各ウェルへのTh17分極媒体の2X混合物1.5 mLを加えIL-1β（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-23（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-6（50ng / mlの）すべて2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100で希釈しましたU / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。 注：トランスフェクションおよびRNA干渉は、血清含有培地中で作業を行います。このプロトコルを無血清培地を使用する目的は、より優れたIL-17Aの生産を達成することです。 </li><li> 遠心分離機4℃で5分間、500×gでのヒトCD4 + T細胞は、細胞をペレット化します。慎重supernatを吸引蟻。その後、無血清基本培地中で細胞を再懸濁し、最終容量をウェル当たり3ミリリットルであり、偏光サイトカインが1×最終濃度で今であるように、ウェル当たり1.5mLの中に3×10 6の密度で細胞をプレート。 <ol><li> 5％CO 2、2日間37℃のインキュベーターにプレートを置きます。 </li></ol></li></ol> 2.エレクトロポレーションインビトロの極性ヒトTh17細胞<ol><li> 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり250μLと2日目に、被覆48ウェル組織培養プレート37°C。 <ol><li>代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。 </li></ol></li><li>トランスフェクションのために小さなRNAを準備します。各トランスフェクションのために、1.5mLの微量遠心管へのsiRNAの5μMストック溶液のアリコートを1μL。適切な化学マッチした小さなRNAのCONTRを含めますオール。氷の上のすべてのチューブを保管してください。 </li><li> PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。 、抗ヒトIFNγ（を10μg/ mL）を、抗ヒトIL-4（10μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（5 NG / mL）を、ヒトIL-：次いで、各ウェルに1×のTh17分極媒体の500μLを加えます1β（20ng / mlの）、ヒトIL-23（20ng / mlの）、ヒトIL-6（25 ngの/ mL）を全て2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100 Uで希釈します/ mLのペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。 </li><li>培養プレートおよびトランスフェクション試薬を調製した後、穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、1 mLのマイクロピペットで細胞を再懸濁します。 4℃で5分間、500×gでコニカルチューブと遠心分離機に細胞をプールします。 注：本明細書で提示する4日間のプロトコルよりも長い培養期間のために、細胞は、この同じプロトコルを使用して、3日毎に約トランスフェクトされなければなりません。ステップ2異なる低分子RNAで処理した細胞をプールすべきではないので、0.4しかし修飾されなければなりません。テストされた条件のすべてが、収集し、計数し、個別にトランスフェクトされなければなりません。 </li><li>注意深く上清を吸引し、その後洗浄するPBSの少なくとも1 mL中に細胞を再懸濁。その後、マイクロ遠心チューブに細胞を移す（生存率を評価するためにトリパンブルー排除を使用して、血球計など ）のライブTh17細胞を数えます。 </li><li>細胞をペレット化し、室温で5分間、500×gで遠心します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、その後、mL当たり2.5〜4×10 7細胞の密度でトランスフェクションシステム10μLキットから提供再懸濁緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。室温で細胞を保管してください。 注：ガイドラインとして、30分以内にトランスフェクトすることができるようにのみなど、多くの細胞を調製してみてください。複数のバッチを比較することができます。 </li><li>それぞれのMicroCに小さなRNAの1μLに細胞の9μLを追加entrifugeチューブ。ピペットは、一度に設けられピペット電極チップにロードし、次いでトランスフェクションのための細胞および小RNAを混合します。 注：典型的には、トランスフェクション前にピペット電極先端に泡を作成防ぐために混合物の十分があることを確認するために、細胞懸濁液の9.5μLを加えます。 </li><li>室温電解バッファE.プレイス3mLのピペットステーション内部キュベットを備えたキュベットを充填した後、キュベット内の位置にピペットを配置します。 </li><li>以下のパラメータを使用して、細胞および小RNAの直ちにエレクトロポレーション各10μLミックス：パルス電圧1,500-1,550 Vを、パルス幅10ミリ秒、及び3つのパルストランスフェクションデバイスに合計します。 </li><li>エレクトロポレーションが完了した後、直接培養プレートの調製ウェルに1XのTh17分極媒体の500μLに細胞混合物を加えます。 5％CO 2、さらに2日間37℃のインキュベーターに入れプレート。 注：ピペットでピペット電極チップを洗います上下PBS中で各トランスフェクションの間です。 </li></ol> 3.収穫ヒトTh17細胞<ol><li>穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、マイクロピペットで培養培地中で細胞を再懸濁。機能的および/または遺伝子発現アッセイのための細胞を調製します。 注：定期、十分な細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析および転写因子染色のために、または遺伝子発現分析のためのRNAの調製のために使用されるトランスフェクトされたTh17細胞の単一のウェルから得られています。 </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、ヒトTh17細胞への小RNAの送達のための改良された方法を提供します。ヒトTh17細胞は、ここで使用されたが、低分子RNAとエレクトロポレーションのこの方法は、TH1、TH2及びTregのような他の初代ヒトTヘルパーサブセットと共に使用することができます。細胞はトランスフェクションの前に培養して活性化されなければならないので、ナイーブCD4 + T細胞についてうまくいっていません。このプロトコルのために、我々は最初のよりよいIL-17Aの生産のためのin vitro培養系を最適化。最大の要因は、ベースのメディアでした。私たちは、無血清培地は、IL-17Aが、ヒトTh17細胞を産生するより良い誘導のために、従来の血清含有培地より​​も優れていたことがわかりました。 Th17細胞は、サイトカインTGFβ、IL-1β、IL-23、およびIL-6のサブセットを用いて生成することができるので、我々は、異なるサイトカインの混合物を試験しました。すべての4つの偏光のサイトカインが含まれていたときに、この研究では、より強固なIL-17Aの生産を達成しました。さらに、当社は、の長さを短く最適化唯一...

CD4 + T細胞は、適応免疫応答の重要なオーケストレーターです。ナイーブCD4 + T細胞は、いくつかの異なるエフェクターT細胞（ 例えば TH1、TH2、Th17細胞、 等 ）に現像することが可能である、局所微小環境1に依存特性サイトカインおよび転写因子の独自のセットをそれぞれ。 T細胞が作る系譜の決定は、自己に対する防御免疫と寛容の両方のために重要です。 Th17細胞は、細胞外細菌および真菌に対抗することが知られているT細胞のサブセットであるが、その不適切な応答はまた、多発性硬化症および乾癬2、3のように複数の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因に関与しています。ヒトTh17細胞は、適切な偏光環境4とそれらを提供することにより、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から生成することができます。バリオ<html>私たちのサイトカインIL-1βの組み合わせ、IL-23、TGFβ、及びIL-6は、人間のTh17細胞の発達のために使用されています。ヒトTh17細胞はCCR6、一般的にこの細胞集団を同定するために使用され、それらの主要な転写因子、（RORCによってコードされる）のRORγt5、6の式で定義されるケモカイン受容体を発現します。 Th17細胞は、複数のサイトカインを発現する能力を有するが、IL-17Aは、これらの細胞によって産生さ系統規定エフェクターサイトカインです。私たちは、ヒトTh17細胞のin vitro分化アッセイの頑健性を評価するために、3つのすべてのTh17関連マーカー（CCR6、のRORγt、IL-17A）の発現を調べました。また、我々は、これらのTh17マーカーの発現が非常に低いかまたは存在しないなければならないので、何のサイトカインまたはブロッキング抗体を陰性対照として使用するために培地に添加しなかった非分極条件下でヒトCD4 + T細胞を培養しました。 ve_content &quot;&gt;正常ヒトT細胞の発達及び生物学を研究する1つの方法は、開発中の遺伝子発現を操作することである。短干渉RNA（siRNA）は、タンパク質をコードするmRNAを標的とする合成小RNA分子であり、特定の遺伝子の発現を減少させるために利用することができます。マイクロRNA（miRNA）は転写後遺伝子発現を調節することが知られている内因性の非コード小型RNAである。miRNAは、Th17細胞7、8、9に含め、マウスおよびヒトT細胞生物学の両方で重要な役割を果たしていることが示されている。これは、遺伝子発現に及ぼす影響を研究するために、ヒトT細胞の小さなRNAの活動を操作し、最終的にはヒトT細胞生物学上の信頼性の高い方法を持つことが重要です。ここでは、我々は我々が導入するために開発さ簡単に使用できる、一貫性と信頼性プロトコルを記述小さな合成RNAおよびロックされた核酸（LNA、増大した安定性を有する化学的に修飾された核酸）免疫細胞への、そして、ヒトTh17細胞へ。 一般に、化学、生物学的、または物理的なカテゴリ10に分類された哺乳動物細胞、内低分子RNAを導入するいくつかの代替方法があります。脂質ベースのトランスフェクション、およびリン酸カルシウムのトランスフェクションを含む一般的に使用される化学的方法は、より効率的に細胞に取り込まれている化学-DNA複合体を作成することに依存しています。一般的に、化学的方法は、一次T細胞のトランスフェクション用として効率的ではありません。最も一般的な生物学的方法は、直接的にその天然の複製サイクルの一部として宿主に外来RNAを挿入するウイルスベクター（ 例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス）を使用することです。ウイルス形質導入は、一般的にプロウイルスプラスミドの分子クローニングのための時間にする場合は特に1つの要因、完了するまでに時間がかかります。また、ウイルス形質導入ベクターとしては、人間の研究者に対して潜在的に有害であり得ます。エレクトロポレーションは、物理mで核酸は一過性に、彼らは彼らのターゲットに作用することができセルに入力することができ、高電圧パルスに細胞を付すことにより、膜透過性を誘導するethod。従来のエレクトロポレーション機器は、初代リンパ球をトランスフェクトするための効果的ではなかったです。しかし、最適化された次世代のエレクトロポレーションは、トランスフェクトされる材料は、小さいRNAである場合は特に、非常に高い効率でT細胞をトランスフェクトすることができることが証明されています。用語次の世代は緩く、伝統的なエレクトロポレーションマシンから2つの新しいプラットフォーム（ 例えば 、ネオン、AMAXA）を区別するために使用されます。また、この方法は、多くの場合、検証合成試薬を用いて単一の実験で最大約120小RNAと中程度のスループットスクリーニングのために容易に拡張可能です。重要なことに、成功したトランスフェクションは、T細胞活性化後にわずか16のような時間で達成することができます。この方法の欠点は、しかし、それは安定したゲノムincorporatiが生じないということです上、したがって、一過性です。したがって、ウイルスベクターにパッケージングされ、正常に小さなRNAの長期発現が必要とされる場合にはT細胞で発現させることができる安定した発現構築物を作成するために余分な労力の価値があります。 我々は、異なる目的の11、12、13のために多様な合成一本鎖または二本鎖RNA又はLNAオリゴヌクレオチドのツールを提供する次世代のトランスフェクション（ 例えば 、ネオン）を使用しています。効率的なRNA干渉は、二本鎖短干渉RNA（siRNA）を使用して、一次マウスおよびヒトT細胞において誘導することができます。このプロトコルは、ヒトTh17細胞は、この技術を使用するための最適化された条件を記載しています。 siRNAに加えて、市販の合成miRNA模倣剤および阻害剤は、機能のmiRNAの利得及び損失を研究するために使用することができます。 miRNA模倣は、siRNAと非常に類似した二本鎖RNA分子であるが、デザイン性は、内因性の成熟miRNAの配列とD。 miRNA阻害剤は、化学的に修飾されたRNAおよび/または天然のmiRNAに結合し、その機能を拮抗するLNAベースの一本鎖オリゴヌクレオチドです。私たちは、これらのツールのすべてを含めて、初代培養Tリンパ球に効果的に使用されるが、人間のTh17細胞に限定されないことができることを見出しました。

<table><tbody><tr><td>抗ヒトIL-17A PE</td><td>エバイオサイエンス</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>クローン:eBio64DEC17</td></tr><tr><td>抗ヒトIFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td>クローン<td>:4S。B3</td></tr><tr><td>抗ヒト CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>クローン:SK3</td></tr><tr><td>マウス 抗ヒト CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>クローン:11A9</td></tr><tr><td>抗ヒト RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>クローン:Q21-559</td></tr><tr><td>抗ヒト CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>クローン:2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/転写因子染色バッファーセット</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>細胞内転写因子フローサイトメトリー染色用</td></tr><tr><td>Hu FcR 結合阻害剤 精製</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T 細胞増殖培地</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>「無血清ベース培地」</td></tr><tr><td>MACS CD28 純粋機能グレード、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>クローン: 15E8</td></tr><tr><td>抗ヒト CD3 精製</td><td>UCSF モノクローナル抗体コア</td><td>N/A</td><td>クローン: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF 精製抗ヒト IL-4</td><td>バイオレジェンド</td><td>500815</td><td>クローン: MP4-25D2</td></tr><tr><td>抗ヒト IFNg, 機能グレード精製</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>クローン: NIB42</td></tr><tr><td>組換えヒト IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-1&β;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-&β;1</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-6</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4+ T cellアイソレーションキット</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK5000</td><td>次世代エレクトロポレーション装置</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 &mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>キット (MPK1096)「</td><td>Transfection Resuspension Buffer」</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>平底プレート</td></tr><tr><td>costar 48ウェル組織培養処理プレート</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>平底プレート</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse 溶解バッファー、10x</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>555899</td><td>使用前に蒸留水で1倍溶液を作る必要があります</td></tr></tbody></table>

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトth17細胞の小さなrnaのトランスフェクション

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T細胞は、周囲のサイトカイン環境に応じて、エフェクターTヘルパー細胞のいくつかのサブセットに分化することができます。Th17細胞は、分極性サイトカインIL-1β、IL-6、IL-23、およびTGFβの存在下でそれらを活性化することにより、in vitroでナイーブCD4+ T細胞から生成できます。Th17細胞は、細胞外細菌や真菌に対する免疫を組織化しますが、その異常な活性は、いくつかの自己免疫疾患や炎症性疾患とも関連しています。Th17細胞は、ケモカイン受容体CCR6によって同定され、そのマスター転写因子RORγtと特徴的なエフェクターサイトカインIL-17Aによって定義されます。Th17細胞分化のための最適化された培養条件により、制御された環境下でのヒトT細胞生物学の機構研究が容易になります。また、RNA干渉やマイクロRNA(miRNA)模倣体や阻害剤の導入を通じて、特定の遺伝子や遺伝子発現プログラムの重要性を研究するための環境も提供します。このプロトコールは、次世代のエレクトロポレーションデバイスを使用して、分化した初代ヒトTh17細胞をsmall RNAで一過性トランスフェクションするための、使いやすく、再現性が高く、高効率な方法を提供します。

正常ヒトTh17細胞をエレクトロポレーションの信頼性の高いシステムを開発するための最初のステップは、 インビトロ分化ヒトのTh17細胞培養におけるロバスト生成することでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、ケモカイン受容体CCR6および転写因子のRORγt（ 図1A、左）を発現しました。 T細胞は（右図1A）非偏光（THN）条件下で培養したときに、これらのマーカーは発現されませんでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、再刺激時にIL-17Aを産生しなくTHN条件下（ 図1B、右）（左図1B）。 TH17分化は依然として低分子RNAによるトランスフェクション後に起こるが、いくつかの実験では、IL-17A産生の頻度（ 図1C）で観察された減少があります。サイトカイン産生に対する小さなRNAトランスフェクションの効果はimporを実証します各実験内の比較のための化学整...

次世代のエレクトロポレーションは、ヒトTh17細胞に小さなRNAをトランスフェクションし、遺伝子発現と細胞の挙動を変化させる効率的な方法です。

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

この手順の全体的な目的は、次世代エレクトロポレーションを用いて、初代ヒトT細胞に小型RNA試薬を効率的に導入することです。この手法は、特定の遺伝子産物がT細胞の分化や免疫機能をどのように調節しているかなど、T細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、初代ヒトT細胞にsRNAやその他の合成小型RNA試薬を導入するための、極めて効率的で信頼性の高い方法であることです。この手法はヒトTh17細胞の生物学的特性に関する知見を提供しますが、ヒトやマウスの他のリンパ球など、他の系にも適用可能です。0日目に、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBSで希釈した抗ヒトCD3および抗ヒトCD28を、6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり1.5 millilitersずつコーティングし、37 degrees Celsiusで少なくとも2時間静置します。臍帯血単核細胞（CBMCs）の分離および洗浄が完了したら、市販のヒトCD4陽性T細胞キットを用いて、ネガティブセレクションによるCD4陽性T細胞の分離を行います。分離バッファーを加え、単核細胞を再懸濁します。細胞を新しい5 mLチューブに移し、1本あたり100 µLの胎児牛血清（FBS）と100 µLの抗体ミックスを添加します。その後、各チューブをオービタルシェーカーを用いて4 °Cで20分間インキュベートし、十分に混合します。インキュベーション後、3〜4 mLの分離バッファーを加えて細胞を洗浄します。細胞を4°Cで300 ×gにて8分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を慎重に吸引します。磁気ビーズを新しいチューブに移し、同量の分離バッファーを加えてビーズを洗浄します。1 mLマイクロピペットを使用してビーズを十分に混合し、チューブをマグネットに少なくとも1分間置きます。上清を慎重に吸引し、洗浄前に移した量と同じ容量で磁気ビーズを再懸濁します。各チューブに500 µLの分離バッファーを加えて細胞を再懸濁し、続いて500 µLの洗浄済み磁気ビーズを加えます。細胞と磁気ビーズを室温のオービタルシェーカーで15分間インキュベートし、十分に混合させます。インキュベート後、1 mLマイクロピペットを使用して細胞を少なくとも10回十分にピペッティングし、次に3〜4 mLの分離バッファーを加えて、各チューブをマグネットに2分間置きます。上清に含まれるネガティブセレクションされたCD4陽性T細胞を、慎重に新しいチューブに移します。CD4陽性T細胞の分離が完了したら、細胞を氷上に保持し、血球計数計を用いて細胞数を測定します。抗体コートプレートをPBSで2回洗浄し、各ウェルに2倍濃縮Th17分化誘導培地を1.5 milliliters加えます。次に、ヒトCD4陽性T細胞を遠心分離して細胞をペレット化します。上清を注意深く吸引して廃棄し、血清不含の基本培地で細胞を再懸濁します。その後、1ウェルあたりの最終容量が3 mLとなり、分極化サイトカインの最終濃度が1 Xとなるように細胞を播種し、プレートを5% CO₂、37 °Cのインキュベーター内で2日間培養します。2日目に、48ウェル組織培養プレートの各ウェルに、カルシウムおよびマグネシウム含有PBSで希釈した抗ヒトCD3および抗ヒトCD28を250 µLずつコーティングし、37 °Cで少なくとも2時間静置します。トランスフェクション用のスモールRNAを準備するため、各トランスフェクションにつき、5 µMのsiRNAストック溶液1 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。すべてのチューブを氷上に保持します。次に、抗体コートプレートをPBSで2回洗浄し、各ウェルに1X Th17分化誘導培地を500 µLずつ加えます。培養プレートとトランスフェクション試薬の準備が整ったら、1 mLマイクロピペットを用いて細胞を再懸濁させます。この際、ウェルの底からすべての細胞が確実に剥離するように、穏やかにピペッティングを行ってください。細胞をコニカルチューブにまとめ、4°Cで500 ×gにて5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、少なくとも1 mLのPBSで細胞を再懸濁して洗浄します。ヘモサイトメーターを用い、トリパンブルー排除法で生存率を評価して生存Th17細胞をカウントした後、マイクロ遠心チューブで細胞をペレット化します。上清を注意深く吸引し、キットに付属のリサスペンションバッファーを用いて細胞を再懸濁します。細胞は室温で保持してください。各マイクロ遠心チューブに、1 µLのsmall RNAに対し、細胞懸濁液を9 µL加えます。細胞とトランスフェクション用のsmall RNAを混合するため、一度ピペッティングし、その後、提供されたピペット電極チップに細胞をロードします。最適なトランスフェクションを行うため、トランスフェクション前にピペット電極チップ内に気泡が入らないようにしてください。エレクトロポレーションピペット内で気泡が発生するのを防ぐのに十分な量にするため、9.5 µLの細胞懸濁液を添加します。提供されたキュベットに、室温の電解質バッファーを3 mL充填します。キュベットをNeonピペットステーションにセットし、ピペットをキュベット内の所定の位置に配置します。直ちに、細胞と小型RNAの10 µL混合液をそれぞれエレクトロポレーションします。エレクトロポレーション完了後、細胞混合液を、培養プレートの準備済みウェルに分注した500 µLの1倍 Th17分化誘導培地に直接加えます。最後に、プレートを5% CO2、37 °Cのインキュベーターでさらに2日間培養します。細胞死を防ぐため、慎重かつ迅速に操作してください。エレクトロポレーションを行うサンプル数が多い場合は、細胞を回収し、バッチ処理でトランスフェクションすることができます。このコンタープロットは、Th17分化誘導条件下で培養したT細胞が、ケモカイン受容体CCR6および転写因子ROR gamma Tを発現していることを示しており、これらは非分化誘導条件下で培養したT細胞では発現していませんでした。また、Th17分化誘導条件下で培養したT細胞は再刺激によりIL-17Aを産生しましたが、ThN条件下では産生されませんでした。small RNAのトランスフェクション後もTh17分化は起こりますが、いくつかの実験ではIL-17A産生頻度の低下が観察されています。このことは、各実験において比較用の化学的に整合したsmall RNAコントロールを用意することの重要性を示しています。small RNAのトランスフェクション後も生存率は維持され、通常は70%を超えます。2日目にCD45をコードするPTPRC遺伝子を標的としたsiRNAプールをヒトTh17細胞にトランスフェクションしたところ、化学的に整合したコントロールsiRNAと比較してCD45の発現が著しく減少しました。ここで示されているCD45発現の単峰性の集団シフトは、形質導入効率がほぼ100%であることを示しています。RNAiによるROR gamma T発現の抑制は機能的な影響を及ぼし、これらの細胞はコントロールsiRNAを形質導入した細胞と比較してIL-17Aの産生が減少しました。このビデオを視聴することで、次世代エレクトロポレーションを用いて、in vitroで分極させたヒトTh17細胞に小型RNAを形質導入する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。...

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in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

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一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

学ぼう、次世代エレクトロポレーションを用いた初代ヒトTh17細胞への小さなRNAトランスフェクション法を。T細胞分化と免疫機能の遺伝子制御を研究し、高効率な遺伝子発現解析が可能です。

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

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