次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

この手順の全体的な目的は、次世代エレクトロポレーションを用いて、初代ヒトT細胞に小型RNA試薬を効率的に導入することです。この手法は、特定の遺伝子産物がT細胞の分化や免疫機能をどのように調節しているかなど、T細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、初代ヒトT細胞にsRNAやその他の合成小型RNA試薬を導入するための、極めて効率的で信頼性の高い方法であることです。

この手法はヒトTh17細胞の生物学的特性に関する知見を提供しますが、ヒトやマウスの他のリンパ球など、他の系にも適用可能です。0日目に、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBSで希釈した抗ヒトCD3および抗ヒトCD28を、6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり1.5 millilitersずつコーティングし、37 degrees Celsiusで少なくとも2時間静置します。臍帯血単核細胞（CBMCs）の分離および洗浄が完了したら、市販のヒトCD4陽性T細胞キットを用いて、ネガティブセレクションによるCD4陽性T細胞の分離を行います。

分離バッファーを加え、単核細胞を再懸濁します。細胞を新しい5 mLチューブに移し、1本あたり100 µLの胎児牛血清（FBS）と100 µLの抗体ミックスを添加します。その後、各チューブをオービタルシェーカーを用いて4 °Cで20分間インキュベートし、十分に混合します。インキュベーション後、3〜4 mLの分離バッファーを加えて細胞を洗浄します。

細胞を4°Cで300 ×gにて8分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を慎重に吸引します。磁気ビーズを新しいチューブに移し、同量の分離バッファーを加えてビーズを洗浄します。

1 mLマイクロピペットを使用してビーズを十分に混合し、チューブをマグネットに少なくとも1分間置きます。上清を慎重に吸引し、洗浄前に移した量と同じ容量で磁気ビーズを再懸濁します。各チューブに500 µLの分離バッファーを加えて細胞を再懸濁し、続いて500 µLの洗浄済み磁気ビーズを加えます。

細胞と磁気ビーズを室温のオービタルシェーカーで15分間インキュベートし、十分に混合させます。インキュベート後、1 mLマイクロピペットを使用して細胞を少なくとも10回十分にピペッティングし、次に3〜4 mLの分離バッファーを加えて、各チューブをマグネットに2分間置きます。上清に含まれるネガティブセレクションされたCD4陽性T細胞を、慎重に新しいチューブに移します。

CD4陽性T細胞の分離が完了したら、細胞を氷上に保持し、血球計数計を用いて細胞数を測定します。抗体コートプレートをPBSで2回洗浄し、各ウェルに2倍濃縮Th17分化誘導培地を1.5 milliliters加えます。次に、ヒトCD4陽性T細胞を遠心分離して細胞をペレット化します。

上清を注意深く吸引して廃棄し、血清不含の基本培地で細胞を再懸濁します。その後、1ウェルあたりの最終容量が3 mLとなり、分極化サイトカインの最終濃度が1 Xとなるように細胞を播種し、プレートを5% CO₂、37 °Cのインキュベーター内で2日間培養します。2日目に、48ウェル組織培養プレートの各ウェルに、カルシウムおよびマグネシウム含有PBSで希釈した抗ヒトCD3および抗ヒトCD28を250 µLずつコーティングし、37 °Cで少なくとも2時間静置します。トランスフェクション用のスモールRNAを準備するため、各トランスフェクションにつき、5 µMのsiRNAストック溶液1 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。

すべてのチューブを氷上に保持します。次に、抗体コートプレートをPBSで2回洗浄し、各ウェルに1X Th17分化誘導培地を500 µLずつ加えます。培養プレートとトランスフェクション試薬の準備が整ったら、1 mLマイクロピペットを用いて細胞を再懸濁させます。この際、ウェルの底からすべての細胞が確実に剥離するように、穏やかにピペッティングを行ってください。

細胞をコニカルチューブにまとめ、4°Cで500 ×gにて5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、少なくとも1 mLのPBSで細胞を再懸濁して洗浄します。ヘモサイトメーターを用い、トリパンブルー排除法で生存率を評価して生存Th17細胞をカウントした後、マイクロ遠心チューブで細胞をペレット化します。

上清を注意深く吸引し、キットに付属のリサスペンションバッファーを用いて細胞を再懸濁します。細胞は室温で保持してください。各マイクロ遠心チューブに、1 µLのsmall RNAに対し、細胞懸濁液を9 µL加えます。

細胞とトランスフェクション用のsmall RNAを混合するため、一度ピペッティングし、その後、提供されたピペット電極チップに細胞をロードします。最適なトランスフェクションを行うため、トランスフェクション前にピペット電極チップ内に気泡が入らないようにしてください。エレクトロポレーションピペット内で気泡が発生するのを防ぐのに十分な量にするため、9.5 µLの細胞懸濁液を添加します。

提供されたキュベットに、室温の電解質バッファーを3 mL充填します。キュベットをNeonピペットステーションにセットし、ピペットをキュベット内の所定の位置に配置します。直ちに、細胞と小型RNAの10 µL混合液をそれぞれエレクトロポレーションします。

エレクトロポレーション完了後、細胞混合液を、培養プレートの準備済みウェルに分注した500 µLの1倍 Th17分化誘導培地に直接加えます。最後に、プレートを5% CO2、37 °Cのインキュベーターでさらに2日間培養します。細胞死を防ぐため、慎重かつ迅速に操作してください。

エレクトロポレーションを行うサンプル数が多い場合は、細胞を回収し、バッチ処理でトランスフェクションすることができます。このコンタープロットは、Th17分化誘導条件下で培養したT細胞が、ケモカイン受容体CCR6および転写因子ROR gamma Tを発現していることを示しており、これらは非分化誘導条件下で培養したT細胞では発現していませんでした。また、Th17分化誘導条件下で培養したT細胞は再刺激によりIL-17Aを産生しましたが、ThN条件下では産生されませんでした。

small RNAのトランスフェクション後もTh17分化は起こりますが、いくつかの実験ではIL-17A産生頻度の低下が観察されています。このことは、各実験において比較用の化学的に整合したsmall RNAコントロールを用意することの重要性を示しています。small RNAのトランスフェクション後も生存率は維持され、通常は70%を超えます。2日目にCD45をコードするPTPRC遺伝子を標的としたsiRNAプールをヒトTh17細胞にトランスフェクションしたところ、化学的に整合したコントロールsiRNAと比較してCD45の発現が著しく減少しました。

ここで示されているCD45発現の単峰性の集団シフトは、形質導入効率がほぼ100%であることを示しています。RNAiによるROR gamma T発現の抑制は機能的な影響を及ぼし、これらの細胞はコントロールsiRNAを形質導入した細胞と比較してIL-17Aの産生が減少しました。このビデオを視聴することで、次世代エレクトロポレーションを用いて、in vitroで分極させたヒトTh17細胞に小型RNAを形質導入する方法について十分に理解できるはずです。