Name: S100A12の発現、精製および抗菌活性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぼうS100A12の発現・精製法と抗菌活性測定法。H. pyloriを用いたアッセイで、金属結合能を持つ安定した二量体の高収率調達と抗菌メカニズム解析に役立つプロトコルを解説します。

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この研究は、退役軍人事務所職業訓練賞1IK2BX001701、CTSA賞UL1TR000445、翻訳科学進歩センター、国立科学財団賞番号1547757および1400969、およびNIHグラントGM05551によって支持されました。その内容は、著者の責任であり、必ずしも移民科学振興機関または国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.S100A12の発現<ol><li>コンピテントBL21 DE3細胞を、標準熱ショックプロトコール18を用いてpGEMEX-S100a12プラスミドで形質転換する。氷上の微量遠心管内で50μLの細菌に1〜5μLのプラスミドを添加する。 20分間インキュベートする。 </li><li>細胞を42℃で30秒間熱ショックする。 </li><li>細胞を氷上で2分間インキュベートする。 </li><li> 500μLのSOC培地を細胞に添加する。オービタルシェーカー上で250rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> LB寒天培地（100μg/ mLアンピシリン添加）で150μLの形質転換反応をプレートする。 37℃で12〜16時間インキュベートする。 </li><li>一つのコロニーを選ぶ。 LB（100μg/ mLアンピシリンを補充）2mLを接種する。 </li><li>オービタルシェーカー（300 rpm）で37℃で4〜6時間インキュベートする。 OD 600は、1〜3の吸光度単位を読み取る必要があります。 </li><li> 50μLのZYM-5052 autoinduに500μLのスターター培養液を加えます100μg/ mLのアンピシリンを補充した培地で処理した。最良の通気と最大の発現のために、250mLのバッフル付き三角フラスコを使用してください。 37℃で24時間振とう（300rpm）。 </li><li>細菌懸濁液を遠心管に移す。 4℃で遠心分離（4,000×g、10分間）して細胞をペレット化する。 </li><li>培地をデカントし、サンプルを記録し、-80℃で細胞ペーストを保存する。サンプルは何年も安定しています。 </li></ol>低圧クロマトグラフィーを用いたS100A12の精製<ol><li> 30mLの20mMトリス、pH8.0中で細胞を再懸濁する。 </li><li>懸濁液を氷上で超音波処理して細胞を溶解する。 〜20W出力、5秒オン、5秒オフサイクルを5分間使用する。 </li><li>溶液を高速遠心管に移す。 4℃で30分間、20,000×gで遠心分離することにより、細胞溶解物を明確にする。 </li><li>上清を傾瀉し、清浄な100mLポリプロピレンビーカーに移す。ビーカーを氷上に置いて溶液を冷却する。攪拌棒を追加する11.20gの硫酸アンモニウムをゆっくり加える。溶液を氷上でさらに1時間撹拌する。これにより、硫酸アンモニウムの60％溶液が生成され、ほとんどの大腸菌内在性タンパク質が沈殿する。 S100A12は可溶性のままです。 </li><li>溶液を4℃、20,000 xgで20分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化する。 </li><li>上清を捨て、透析チューブ（MWCO3,500 kDa）に移す。 4℃で1Lの20mM Tris（pH8.0）に対して透析する。透析バッファーを2回交換してください。変更の間に4時間を許可します。 </li><li> 陰イオン交換クロマトグラフィー <ol><li>低圧系でクロマトグラフィーを行う。典型的な流速は1mL /分である。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8.0）で5mLセファロースカラムを平衡化する。 </li><li>サンプルポンプを使用して〜40 mLのS100A12溶液をロードします（フロースルーを収集します）。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8）でカラムを洗浄する。 </li><li> 0〜30％の勾配でカラムを現像する（BuBカラムは19カラム容量（CV、95mL）で20mMトリス、pH8.0,1M NaClである。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートをとり、MOM SDS PAGEを用いてクマシー染色で分析します。定電圧（20V / cm）で30分間ゲルを流します。 </li><li> S100A12を含むプール画分。 S100A12は、変性ゲル上で約10kDaタンパク質で作動する。 </li><li>限外濾過装置（MWCO 10kDa）を用いて画分を5mLに濃縮する。 3,000×gで約8分間遠心分離する。一番上の部分を取る。 </li></ol></li><li> サイズ排除クロマトグラフィー <ol><li> S75カラムを1 CV（120 mL）の20 mM Tris pH 8,100 mM NaClで平衡化する。 </li><li> 5mLの濃縮S100A12画分を（イオン交換クロマトグラフィーから）注入する。 </li><li>カラムを1 mL / mの流速で120 mL以上に展開する。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートを取り、SDS PAGEを用いてクマシー染色を用いて分析する。タンパク質の同一性を確認するウェスタンブロットまたは質量分析（単量体サブユニット10,575.0Daの計算分子量、10575.4Daで測定）。 </li></ol></li><li> プール分 <ol><li>分光光度計を用いてプロテインA 280の吸光度を測定する。 SECバッファをブランクとして使用してください。 S100A12ホモ二量体の計算吸光係数は5960M -1 cm -1である 。 注：典型的な収量は50 mLの培養あたり35〜45 mgのS100A12です。 </li><li>アリコートS100A12を1.5 mLのマイクロ遠心チューブ（1 mg /チューブ）に入れ、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 </li></ol></li></ol> 3.抗菌活性アッセイ<ol><li> 5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したトリプシン大豆寒天プレート上にG27株を播種する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で2〜3日間増殖させる。 </li><li> 1×コレステロールを補充したBrucellaブロスにH.pyloriを接種する。文化的5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう（250rpm）。 </li><li> H.pylori 1:10を50％Brucella broth、50％calprotectin buffer + 1x cholesterolに希釈し、100μM塩化亜鉛プラス0,100,1,000μg/ mL精製S100A12を添加した培地で培養する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう培養（250rpm）。 </li><li>翌日、連続希釈を行い、血液寒天プレート上にプレートする。細菌コロニーを5％二酸化炭素を補充した室内空気で37℃で2〜3日間生育させる。コロニー形成単位を列挙して、S100A12および/または外来性亜鉛の存在下または非存在下での細菌増殖を計算する。 </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
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<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
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<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
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<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
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<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

ヒトS100A12の発現および精製の両方のための効率的なプロトコールが提示される。 E.coli発現系は、特にmg量が生化学的および生物物理学的研究のために必要とされる場合、組換えタンパク質の製造に使用される最も一般的なツールである。ここに記載されている手順の重要な強化は、標準的なルリアブロス培地18での発現と比較して、精製タンパク質の収率をほぼ30倍増加させる自動誘導培地26の使用である。さらに、自動誘導培地は、タンパク質発現ワークフローを大幅に簡素化します。従来の増殖培地を用いて、指数増殖期の間に誘導剤を添加できるように、培養物を連続的にモニターしなければならない。自動誘導メディアを使用している場合、倍増時間を監視する必要はありません。培養物を飽和まで増殖させる。自動誘導による成長の初期段階培地上では、大腸菌はグルコースを炭素源として使用する。グルコースが枯渇すると、バクテリアはタンパク質発現を誘導する炭素源としてラクトースに切り替わります26 。自己誘導...

S100タンパク質は、機能の多様な配列を有するカルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのクラスである1 。それらは組織および細胞特異的様式で発現され、広範囲の細胞機能を調節する2,3 。カルシウム結合タンパク質に特有のS100タンパク質は、細胞内および細胞外の両方の機能を発揮します4,5 。細胞内では、Ca 2+結合は、タンパク質結合パートナー6を特異的に標的とする疎水性表面を露出する構造変化を誘導する。この細胞内機構は、細胞増殖、分化およびエネルギー代謝などの重要な過程を調節する。細胞外環境では、S100タンパク質は2つの機能を示す7 。 1つは、それらは損傷関連分子パターン（DAMP）タンパク質として作用し、炎症促進性サイトカインパターン認識受容体8,9 との相互作用による免疫性免疫応答。さらに、S100タンパク質クラスのいくつかのメンバーは、栄養免疫と呼ばれる過程で微生物病原体を飢餓にさせる働きをする転移金属を封鎖する10,11 。 S100A12（カルグラヌリンCおよびEN-RAGEとしても知られている）は、マクロファージおよび好中球において高度に発現され、炎症性疾患の潜在的なバイオマーカーとして同定されている12,13。そのEF-Hand部位でカルシウムを結合することに加えて、S100A12は、ダイマー界面14,15の反対側に位置する2つの高親和性遷移金属結合部位を有する。各結合部位は、3つのヒスチジン残基および1つのアスパラギン酸残基を含み、亜鉛または銅をキレートすることができるsup class = &quot;xref&quot;&gt; 16,17。最近、我々は、S100A12依存性亜鉛欠乏が、 ヘリコバクターピロリの成長および炎症誘発性病原因子の活性を調節する上で重要であることを報告した18 。 ピロリ菌は世界中の人口の約半分の胃に感染する。間違いなく最も成功した細菌病原菌の一つとなっている19 。 H.pyloriによる感染は、胃炎、消化性および十二指腸性潰瘍、粘膜関連リンパ組織（MALT）リンパ腫、および浸潤性胃腺癌（胃癌）を含む重大な胃疾患の転帰につながり得る。胃癌は、世界の非心臓癌関連死の主要な原因であり、胃癌の1つの最も大きな関連する危険因子は、 H.pyloriの感染である。 ヘリコバクターピロリはロブにもかかわらず胃のニッチに存続するこの細菌感染を制御する免疫機構のより良い理解の必要性を強調している20,21,22,23。 H.pylori関連炎症は、感染部位にS100A12を含む抗菌タンパク質のレパートリーを沈着させる多形核細胞または好中球の深い浸潤によって特徴付けられる18,24,25。宿主と病原体の複雑な対話を理解するために、我々はS100A12を精製し、この医学的に関連する病原体に及ぼす抗菌作用を研究する技術を改良しようとした。以下のプロトコルは、生物学的に活性な状態でのS100A12精製のための改良技術を概説する。高い親和性を有する栄養素を結合する能力それらを侵入する微生物からキレートする。さらに、以下の方法は、本来の抗菌分子が細菌病原体の増殖を制限する機構を研究するための重要な試薬として、このタンパク質の有用性を強調している。 S100Aファミリータンパク質は、免疫シグナル伝達および宿主防御に関与する先天性免疫系分子の重要なグループとして評価されてきた27 。これらの中で最もよく研​​究されているものは、カルプロテクチン（MRP-8/14、カルグラニュリンA / B、S100A8 / A9） 28,29,30 である。カルプロテクチンは、二量体界面31で遷移金属に結合するS100A8およびS100A9サブユニットのヘテロ二量体を形成する好中球関連タンパク質である。カルプロテクチンは、2つの金属結合部位を有することが示されている：部位1は、Zn 2+ 、Mn 2+ 、またはFe 2+に結合することができ、部位2は、<html> Zn 2+ 31,32に結合する。カルプロテクチンは、黄色ブドウ球菌 、 カンジダ・アルビカンス 、 アシネトバクター・バウマンニ 、 クレブシエラ・ニューモニエ 、 エシェリヒア・コリ 、およびヘリコバクター・ピロリを含む様々な病原体に対して抗菌活性を有すること、ならびにカルプロテクチンの金属キレート化活性に起因することが、 、 29 。 以前の研究は、カルプロテクチンが、外膜の脂質A構造の改変、（ ヘリコバクターピロリ中の主要な前炎症性ビルレンス因子である）カギIV型分泌系の抑制、バイオフィルム形成の誘発、および抑制を含むヘリコバクターピロリに対する多数の活性を発揮することを示したピロリ菌の増殖と生存率は用量依存的にclass = &quot;xref&quot;&gt; 25,33。さらに、遺伝的および生化学的アッセイにより、 ヘリコバクター・ピロリに対するカルプロテクチンの抗菌活性は、栄養素に結合する能力に大きく起因することが明らかになった25 。 ピロリ菌は、この病原体が増殖し増殖するための微量栄養素要求を確認するために化学的に規定された培地を利用した以前の研究によって決定されたように、亜鉛を必要とする34 。さらに、カルプロテクチンは、 H.pylori感染組織内に非常に豊富であり、好中球浸潤物と関連しており、感染およびその後の炎症の際の抗菌戦略として宿主がカルプロテクチンを使用する可能性があることを示しているバイアスプロテオミクススクリーニング技術からの最近の証拠は、反応性酸素種が豊富な条件下では、カルプロテクティブスズは、ヘキサ - ヒスチジン結合部位を変える翻訳後修飾を受け、それによってタンパク質36の金属結合活性を阻害する。このように、本発明者らは、これらの分子の広いレパートリーの中の他のS100Aファミリータンパク質が補助金属キレート化剤として潜在的に作用する可能性があると仮説した。我々は、上記の翻訳後修飾についてのスクリーニングで同定されておらず、亜鉛に結合する能力を有し、 H.pylori感染個体由来のヒト組織において非常に豊富であるため、さらなる研究のためにS100A12を選択した。 本発明者らの研究は、S100A12がH.pyloriの G27株において用量依存的にH.pyloriの増殖および生存を阻害し、このタンパク質の抗菌活性が過剰栄養素亜鉛の添加によって逆転され得ることを示している。この研究は、S100A12がPMSS1および7.1に対する抗菌活性を示した以前の研究を補完するH. pyloriの 3菌株であり、多数の臨床分離株および実験室で適応されたH.pylori菌株に対する広範な抗菌活性を示している18 。総合すると、これらの結果は、S100A12が栄養免疫による細菌の増殖と増殖を制御するメカニズムとして重要であることを確認しています。この重要な宿主 - 細菌相互作用の将来の研究には、宿主組織内の細菌負荷を低減するためのS100A12の活性を利用すること、またはH.pylori感染に関連して免疫シグナル伝達に対するこのタンパク質の寄与を決定することが含まれる。

<table><tbody><tr><td>S100A12 Expression<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Expression cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Autoinduction medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Extract Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>ラクトース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>Selection agent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0<</td><td></td></tr><tr><td>strong>S100A12 精製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA 開始クロマトグラフィーシステム</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q セファラオス高速フロー</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite 分光光度計</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0<</td><td></td></tr><tr><td>em>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血液寒天培地</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

s100a12の発現、精製および抗菌活性

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

カルグラニュリンタンパク質は先天性免疫の重要なメディエーターであり、カルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのS100クラスのメンバーである。いくつかのS100タンパク質は、遷移金属を高親和性で結合し、「栄養免疫」と呼ばれる過程において、それらを侵入する微生物病原体から効果的に隔離する能力を有する。 S100A12（EN-RAGE）は亜鉛と銅の両方に結合し、マクロファージや好中球などの生来の免疫細胞に非常に豊富に存在します。本発明者らは、S100A12の活性金属結合構成における発現、濃縮および精製のための洗練された方法を報告する。このタンパク質の細菌増殖および生存度分析における利用は、S100A12が細菌病原体であるヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性を有することを示している。抗菌活性は、栄養素の亜鉛をキレート化するS100A12の亜鉛結合活性を前提としており、これにより、成長およびpに亜鉛を必要とするH.pyloriが飢えているロリファーション。

S100A12の発現および精製 3段階の精製により、50mLの細菌培養液から約40mgの組換えS100A12を産生した。第一段階は、内因性大腸菌（E.coli）タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿であった 。この工程の後に、陰イオン交換クロマトグラフィー（ 図 1A ）を行った。タンパク質は、クーマシーブリリアントブルー（ 図1B ）で染色されたSDS-PAGEによって追跡されます。精製手順の最後のステップは、タンパク質を分子量および形状によって分離するサイズ排除クロマトグラフィー用のS100A12を含有する画分をプールすることを含んでいた（ 図2A ）。 S100A12はホモダイマー（サブユニットあたり92アミノ酸）であり、約21kDaの全分子量を有する。サイズ排除クロマトグラフィーから集...

ここでは、S100A12（calgranulin C）を発現、精製する方法を紹介します。我々は、ヒト病原体H.ピロリに対するその抗菌活性を測定するためのプロトコルを記載する。

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

本プロトコルの全体的な目的は、抗菌アッセイに利用できるよう、活性型のS100A12の単離および精製を容易にすることです。この手法は、病原細菌への感染に応答して産生される抗菌ペプチドであるS100A12の役割は何か、といった微生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、最適化されたプロトコルによって、栄養金属を結合して隔離する能力を持つ、安定した高純度のS100A12ダイマーを高収量で得られることです。一般的に、この手法を初めて行う方は苦労することがあります。というのも、S100A12はある条件下で様々なサイズのオリゴマーを形成し、これらのオリゴマーはin vitroにおいて抗菌活性が低下するためです。我々がこの手法を考案したのは、関連するS100Aファミリータンパク質であるカルプロテクチンの精製と抗菌活性の研究を始めた時でした。この手法におけるサイズ排除およびカラムによる最終精製ステップでは、視覚的なデモンストレーションが極めて重要になります。また、このプロセスの成功には抗菌アッセイが重要です。この手順を開始するために、テキストプロトコルに従ってコンピテントBL21 DE3細胞を形質転換します。次に、氷上のマイクロ遠心チューブ内で、50 µLの細菌に1〜5 µLのプラスミドを加えます。20分間インキュベートします。その後、細胞を42°Cで30秒間ヒートショックします。氷上で2分間インキュベートします。次に、500 µLのSOC培地を加えます。37 °Cのオービタルシェーカーで250 rpmにて1時間インキュベートします。続いて、形質転換反応液150 µLを、100 µg/mLのアンピシリンを添加したLB寒天培地に播種します。37°Cで12～16時間インキュベートします。インキュベート後、単一のコロニーをピックアップし、アンピシリンを添加したLB培地2mLに接種します。オービタルシェーカーを用いて37°C、300 rpmで4～6時間インキュベートします。次に、500 µLのスターター培養液を、アンピシリンを添加した50 mLのZYM 5052オートインダクション培地に加えます。37 °Cで300 rpmで24時間振とうします。その後、細菌懸濁液を遠心管に移します。4,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、培地を除去し、サンプルを記録して、細胞ペレットを-80 °Cで保存します。まず、細胞ペレットを30 mLの20 mM Tris（pH 8.0）に再懸濁します。次に、細胞を溶解させるため、氷上で20 Wの出力で、5秒間のオンと5秒間のオフのサイクルを用いて5分間超音波処理を行います。超音波処理した溶液を高性能遠心管に移します。細胞溶解液を清澄化するため、4°C、20,000 ×gで30分間遠心分離します。その後、上清を清潔な100 mLポリプロピレン製ビーカーにデカンテーションします。溶液を冷却するため、ビーカーを氷上に置きます。スターバーを加え、11.20 grams の硫酸アンモニウムをゆっくりと加えます。氷上で溶液を1時間攪拌します。次に、溶液を遠心管に移し、4°Cで20,000 ×gにて20分間遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化します。上清を透析チューブにデカンテーションします。4°C、pH 8.0の20 mM Tris 1 Lに対して透析を行います。透析バッファーは、4時間ごとに2回交換してください。次に、5 mLのセファロースカラムを10 mLの20 mM Trisで平衡化します。サンプルポンプを用いて、約40 mLのS100A12溶液をロードします。通り抜け分画を回収します。次に、カラムを20 millimolar trisで洗浄します。19カラムボリュームかけて0から30%の勾配でカラムを展開します。5 milliliterずつ分画して回収します。Coomassie染色を伴うMES SDS pageを用いて、各分画の10 µL分注液を分析します。次に、S100A12を含む分画を回収します。超遠心ろ過装置を使用して、これらの分画を5 mLまで濃縮します。その後、20 millimolar trisおよび100 millimolar sodium chlorideを含む120 milliliterの溶液を用いて、S75カラムを平衡化します。濃縮分画の5 milliliterサンプルを注入してください。次に、流速1 milliliter/minで120 milliliterまでカラムを展開します。5 mLずつ画分を回収します。Coomassie染色を伴うSDS-PAGEを用いて、各サンプルの20 µL分注液を分析します。その後、テキストプロトコルに従ってタンパク質の同一性を確認し、画分を回収します。まず、1Xコレステロールを添加したブルセラブロスにH.pyloriを画線培養します。5%二酸化炭素を補充した空気条件下、37°C、250 rpmの振盪で一晩培養します。その後、H.pyloriを、50%ブルセラブロスと50%カルプロテクチンバッファーおよび1Xコレステロールの混合液を用いて10倍に希釈します。必要に応じて、S100A12タンパク質および/または外因性金属を添加します。抗菌アッセイは極めて重要なポイントです。S100A12ダイマーの安定性を確保するためにはカルプロテクチン緩衝液を使用することが重要であり、また細菌増殖アッセイには金属欠乏ミネラル培地を用いる必要があります。これにより、富栄養な複合細菌培地に一般的に含まれている過剰な微量栄養素によって、タンパク質が圧倒されることを防ぐことができます。翌日、サンプルを段階希釈します。次に、血液寒天培地に塗布します。5%二酸化炭素を添加した空気中、37°Cで2〜3日間、細菌コロニーを培養します。その後、テキストプロトコルに記載されている通りに細菌の増殖を算出します。本研究では、活性な金属結合形態でS100A12を発現および精製するための改良法を提示します。3段階の精製プロセスは、まず内因性E.coliタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿から始まり、続いてアニオン交換クロマトグラフィーを行います。Coomassie Brilliant Blueを用いたSDS-PAGEによりタンパク質を確認した後、S100A12を含む画分を回収し、サイズ排除クロマトグラフィーに供します。S100A12は、サブユニットあたり92個のアミノ酸からなるホモ二量体であり、全分子量は約21 kilodaltonsです。次に、定量的微生物培養法を用いてS100A12の抗菌活性を調査します。細菌細胞の計数により、外来性の栄養源である亜鉛の存在下または不在下で100 µg/mLのS100A12に曝露させても、細菌の生存能は有意に抑制されないことが明らかになりました。しかし、培地のみで1,000 µg/mLのS100A12に曝露させると、細菌の生存能は69倍減少します。外因性の亜鉛栄養源を添加することでこの結果は逆転し、S100A12の抗菌活性がその亜鉛捕捉能に依存していることが示されます。適切に実施すれば、習得後はタンパク質の発現から精製までを3〜4日で完了させることができます。本手順に続き、誘導結合プラズマ質量分析法などの他の手法を用いることで、さらなる疑問を解消することが可能です。金属のキレート化は、どのようにして微生物の増殖を制限するのでしょうか。この手法の開発により、微生物学分野の研究者が H.pylori の栄養免疫を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、抗菌タンパク質 S100A12 の発現、精製、および活性の定量方法について十分に理解することができるはずです。H.pyloriを扱う際は極めて危険であることに留意してください。また、本手順を実施する際は、BS2認定施設での作業など、常に適切な予防措置を講じる必要があります。本手法の応用範囲は、潰瘍、胃炎、浸潤性付属器癌を含む胃疾患にまで及びます。これらのプロセスを理解することで、それらを標的とした新規の抗菌分子を構築するためのより適切な手段が得られます。本手法はS100Aファミリータンパク質の生化学的な洞察を提供しますが、免疫シグナル伝達における役割や、癌、関節炎、感染症などの数多くの疾患プロセスにおける研究にも適用可能です。

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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S100A12の発現、精製および抗菌活性

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