Name: アンインビトロ結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学ぶ結核病変における薬物結合予測法。急速平衡透析法と泡沫マクロファージ由来マトリックスを用いて、抗微生物薬の壊死性病変浸透性を動物実験なしで評価する技術を習得できます。

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私たちは、それぞれ、PA-824（pretomanid）、AZD5847、radezolidとtedizolid bedaquilineを提供するためのジョンソン・エンド・ジョンソン、TBアライアンス、アストラゼネカ、リブ-XとTrius治療に感謝したいです。ブレンダンプリドー、マシュー・ツィンマーマン、ステファン・ジャズウィン、エマ・レイ・フラド、ナンシールーエル、レヤン・リおよびダニエル・ウェイナー MALDI分析、生物分析方法、caseumサロゲートの調製、化学合成、およびウサギcaseumの単離と支持を提供しました。この作品は、センターオブエクセレンスのためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とウェルカム・トラストからビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団、賞＃OPP1044966とOPP1024050からV・ダートイス、NIH共有計装グラントS10OD018072だけでなく、共同資金に資金調達を行いましたP・ワイヤットに発展途上国の疾患のためのリード最適化のために。

すべての動物研究は、NIAID（NIH）、Bethesda、MDの機関動物管理および使用委員会の承認を得て、国立衛生研究所の実験動物の管理および使用のガイドに従って実施した。 結核菌を含むすべての研究は、生物安全性封じ込めレベル3（BSL-3）の実験室で実施された。 1.ウサギ感染モデルとカゼムコレクション<ol><li> 以前に記載されたような鼻のみのエアロゾル曝露システムを使用して、 結核菌でニュージーランドの白色ウサギに感染させる。 12、13感染が12〜16週間進行するようにします。ウサギを35mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンで筋肉内に静置し、ウサギに0.22mL / kgのペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウムを静脈内に安楽死させ、剖検を続ける。 </li><li>ピンセットとメスを使用して、胸部から肺を取り除く。vity。各肺葉から、個々の空洞および大きな壊死肉芽腫をメスを用いて切開する。空洞と肉芽腫の壁からカゼムを慎重にこすり落とす。使用準備が整うまで-20℃で2 mLスクリューキャップチューブに試料を計量し、記録し、保存する。 </li><li> 3メガラドのドライアイスで感染性のカゼウムサンプルをガンマ線照射して、BSL-2ラボでの使用に不快で安全なものにします。 </li></ol> 2.THP-1細胞からのCaseum Surrogateのインビトロ発生<ol><li> T175細胞培養フラスコ（80mL /フラスコ）中のRPMI1640培地（2mM L-グルタミンおよび10％ウシ胎仔血清）中のTHP-1単球を増殖させる。フラスコを5％CO 2雰囲気下、37℃で3〜4日間インキュベートする。 </li><li> T175フラスコから2本の50mLコニカルチューブで培養液を150 xgで5分間遠心します。上清を捨て、ペレットを10mLのRPMI 1640培地に懸濁する。 </li><li>この培養物5μLを45μLのtを含む1.5mLチューブにピペットライパンブルー。ピペッティングにより完全に混合する。 10μLを血球計算盤に移し、光学顕微鏡（倍率10倍）を用いて生存可能なTHP-1単球の数を数えた（染色していない）。培養液1mLあたりの生存細胞数を計算する。 RPMI培地で希釈して1.25 x 10 6 cells / mLの最終密度にします。 </li><li>大きな細胞培養プレート（50×10 6細胞/プレート）上に培養物40mLをロードする。 40μLの100μMPMA（エタノール中で調製したホルボール12-ミリステート13-アセテート）を加え、細胞をインキュベーター内で一晩付着させる。 注：PMAの最終濃度は100nMである。 </li><li>エタノール中の純粋なオレイン酸（OA）（0.89g / mL）を0.1Mの濃度（ すなわち、エタノール968.3μL中の31.7μLのOA）に希釈する。新鮮な予熱したRMPI培地でこの溶液を10 mMの濃度に希釈する。 37℃に予熱したRPMI培地中でこのOA懸濁液を0.4mM（最終使用濃度）に希釈する。 </li><li>既存のメディアと非メディアを削除する-adhered細胞を細胞培養プレートから、穏やかにはTHP-1マクロファージ（THP-M）を0.4 mMのOAの40ミリリットルを加えます。一晩インキュベーター中で37°Cでインキュベートします。 </li><li>視覚各THP-Mにおける多数の脂質体の介在物の存在を確認するために40倍の倍率で光学顕微鏡を使用しています。細胞培養プレートからすべてのRPMI培地を除去し、穏やかに50 mLの血清学的ピペットを使用して、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回接着細胞を洗浄します。 注：脂質体はTHP-Mの細胞質のように、小さい透明な球状構造で表示されます。 </li><li>各プレートに、PBS中の5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の40ミリリットルを加えます。 37°Cで15分間インキュベートします。 </li><li>繰り返しピペッティング全体板の表面上に10-mLの血清学的ピペットを使用して、泡沫状マクロファージ（FM）を取り外します。 50 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、5分間、150×gでスピンダウン。 </li><li> 10 mlのPBS（第三のPBS洗浄）Aで細胞ペレットを再懸濁予め計量した15mLコニカルチューブに移す。 150xgで5分間再びスピンダウンする。血清学的ピペットを使用して上清を慎重に吸引し、廃棄する。 </li><li> FMペレットを3回凍結融解して細胞を溶解し、75℃で20〜30分間インキュベートしてマトリックス中のタンパク質を変性させます。使用準備が整うまでペレットを-20℃で保存する。 </li></ol>迅速な平衡透析（RED）アッセイ<ol><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）中のすべての試験化合物の10 mMストック溶液を調製する。各アッセイの前にDMSO中で500μMの作業溶液に希釈する。 </li><li>カゼインサロゲートペレットを入れたチューブを秤量する。空のチューブの重量を引いて、ペレットのみの重量を導出する。チューブ当たり2〜3個の金属ビーズを添加し、組織ホモジナイザーを用いて1,200ストローク/分で1分間、各マトリックスの10倍希釈懸濁液を達成するために、カセムまたは代理マトリックスをPBS（1：9w / v） </li><li>スパイク6.5μLの500μL5μM（≦1％DMSO）およびボルテックスの最終濃度を達成するために、643.5μLのホモジネートに試験化合物のμM溶液を添加する。 </li><li> REDインサートをベースプレートに挿入します。各REDインサートのドナーチャンバー（赤いリング）と各レシーバーチャンバーへの350μLのPBSに200μLの薬物添加マトリックスを加えます。各試験化合物について3つのインサートを調製する（3つのサンプル）。プレートを接着プレートシールでシールし、サーモミキサー上で37℃、200 rpm（1 xg）で4時間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、ドナーおよびレシーバーチャンバーの内容物を2〜3回上下にピペッティングすることにより穏やかに混合する。ドナーチャンバーからホモジネートのアリコート20μLをピペットで出し、1.5mLチューブ（1：1）中の20μLのきれいなPBSに加える。同様に、レシーバーチャンバーからのPBSサンプルのアリコート20μLをピペットで取り出し、クリーンホモジネート（マトリックスマッチング）20μLを加えます。 8 注：マトリックスマッチングは、定量分析のために2つの別々の較正曲線（ホモジネートおよびPBS中）を作成した。ドナーチャンバーの内容物は時間の経過とともに沈降することがある。アリコートを除去する前にピペットで内容物を穏やかに混合する。 </li></ol> 4.LC-MS定量およびデータ解析<ol><li> 500ng / mLのジクロフェナクまたは10ng / mLのベラパミル（内部標準）を含む160μLの1：1メタノール：アセトニトリルを各チューブに加え、ボルテックスしてタンパク質を沈殿させる。 10,000×gで5分間遠心分離して沈殿物を沈降させ、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LCMS）分析のために上清を96ウェルディープウェルプレートに移す。 7 </li><li>上記のサンプルと同じマトリックス組成を維持しながら、各試験化合物について1〜1,000nMの較正曲線を構築する。 LC-MS法を用いて、ドナーおよびレシーバーチャンバーからのサンプル中の試験化合物の濃度を定量する。 </li><li>非結合部分（ f u ）を計算する式1を用いて希釈マトリックス中の薬物を計算する。式2を用いて希釈されていないマトリックス中のf uを計算する（ D =希釈係数10）。 14 <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li>式3を用いて各化合物の回収（質量バランス）を調べ、安定性/代謝/非特異的結合の問題を有する化合物を同定する。 注：回復率は通常70〜130％です。 15 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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</ol>

競合する金銭的利益はない。

結核に感染した患者の肺壊死病変および空洞には、薬物治療に対して反抗的な細菌の亜集団が含まれる。これらの構造の大部分のコアは、細胞外環境においてこれらの胞子を保持することに特に関与する。これらの離れた場所への抗菌剤の好都合な分布は、結核薬効の重要な決定要因であると考えられている。このプロトコールのバリデーションの前に、大腸病変における創薬化合物の分布を予測できるインビトロ技術は存在しなかった。結果として、これらの重大な病巣における薬物分布の評価は、動物感染モデル、病巣中心の薬物動態学的研究およびMALDI質量分析イメージング技術に大きく依存していた。 5,17 インビトロアッセイでは、再は、in vivo薬物動態試験の退屈とコストをかけずに結核病変における薬剤の浸透を予測するための迅速かつ効果的な方法です。プロトコルは、本来RED装置の使用目的であった血漿タンパク結合アッセイの改変です。ピペット可能な一貫性の組織試料の均質化は、同じ装置を用いて測定する結合組織タンパク質を可能にしま...

肺結核疾患の治療には、様々なタイプの病変への薬物の効果的な分配が必要である。壊死病巣および腔は、薬剤耐性または「持続性」細菌の亜集団を有する大腸菌センターを含む。 1、2空洞病は、劣悪な治癒率と不良な予後と関連している。以前の研究では、定量的および画像技術を用いて、カゼムを浸透させる能力が薬物クラスごとに著しく異なることが示されている。しかし、これらの方法は、遅く退屈な動物感染モデルの使用を必要とする。 ex vivoカゼウムへの薬物結合を測定するインビトロアッセイを設計した。この結合は、肉芽腫の薬物浸透と逆相関することが判明し、したがって、予測ツールとして使用。 7 平衡透析は、血漿蛋白質結合研究に金標準的なアプローチとみなされています。迅速平衡透析（RED）デバイスは、そのようなアッセイを実施するための、迅速で使いやすいと信頼性の高いシステムを提供します。 8デバイスは、2つのコンポーネントで構成され：使い捨て、半透膜の垂直シリンダによって分離された2室からなる使い捨てインサート。一度に48個のインサートまで保持することができ、再使用可能なベース板。透析膜は、8 kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有する薬物 - 高分子結合研究のために理想的です。膜区画の高い表面積対体積比は、急速透析および平衡化を可能にします。インサートとベースプレートの両方は、最小の非特異的結合のために検証されてきました。生体分析技術とRED素子の組み合わせは、Pにおける薬物の非結合画分の正確な推定を提供しますラスマ8,9 当初は血漿タンパク質結合を測定するように設計されていたが、RED装置はホモジネートを用いたいくつかの組織結合研究に用いられてきた。このプロトコールでは、壊死病変および結核感染ウサギの腔から摘出された壊死屑であるカゼムに対する薬物結合を測定する。ケース状材料の無細胞性および非血管性は、アッセイと適合する均一な懸濁液にホモジナイズすることを容易にする。 カゼウムが生産するのが面倒で、来るのが難しいことを考えると、プロトコールはまた、泡沫状マクロファージから調製された代理母材と共に使用するために検証されている。 THP-1単球由来マクロファージはオレイン酸で誘導され、それらに「泡沫」外観を与える複数の脂質体を蓄積する。これらの脂質負荷細胞を採取し、我々はcaseumへの代理として使用マトリックスを生成するために処理。この研究では、この代用マトリックスに結合するその薬剤を示した効果肉芽腫及び空洞の乾酪性コア中の薬物の浸透を妨げるインビボのプロセスを模倣、caseumに結合するとよく相関します。

<table><tbody><tr><td>ニュージーランド白ウサギ</td>Covance-HN878<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>結核菌BEI</td><td>リソース</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ケタテシア(ケタミン)100 mg / mL C3N</td><td>ヘンリーシャインアニマルヘルス</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>アナセド(キシラジン)100 mg / mL</td><td>ヘンリーシャインアニマルヘルス</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>ユータゾール(ペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム)溶液&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 単球細胞株</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2;TC処理フラスコ(T175)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培地、グルタミンなし</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ハイクロンウシ胎児血清、ガンマ線照射&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-グルタミン、200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC ディッシュ、145 mm x 20 mm、ベント付き</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>ピアスREDデバイス再利用可能なベースプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-89811</td><td></td></tr>ピア<tr><td>スREDデバイスインサート、50 /ボックス&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>ピアスレッドインサート取り外しツール&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>粘着プレートシール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4、10x 500 mL(Gibco)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸</td><td></td><td>Σ V4629</td><td></td></tr><tr><td>ジクロフェナクナトリウム塩</td><td>Σ</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション、0.4%</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 ジェノ/グラインダー</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>ビーズミル ホモジナイザーアクセサリー、金属バルクビーズ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R コバルト60照射器</td><td>JLシェパード</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp;C-Chipディスポーザブル血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>直立光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>バイナリ液体クロマトグラフィーシステム</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>マルチペンセント</td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

結核病の根絶には、複雑な肺病変の複数の層に浸透することができる薬物レジメンが必要である。窩洞および病変の大部分のコアにおける薬物分布は、一般に害虫とも呼ばれる薬物耐性細菌の亜集団を収容するため、特に重要である。結核病変における薬剤浸透の測定のための既存の方法は、 生体分析または画像化技術に結合された経費のかかる時間のかかる生体内薬物動態研究を必要とする。この結合は、カゼムを介する薬物分子の受動的拡散を妨げるので、カゼイン高分子への薬物結合のインビトロ測定は、そのような技術の代替として提案されている。迅速な平衡透析は、血漿タンパク質および組織結合研究を行うための迅速かつ信頼性の高いシステムである。このプロトコールでは、excisであるカゼウムのホモジネートへの薬物結合を測定するために、高速平衡透析（RED）装置を使用した結核に感染したウサギの病変および腔から滲出した。このプロトコールはまた、カゼムの代わりに使用する脂質負荷THP-1マクロファージから代理マトリックスを生成する方法も記載している。このカゼウム/サロゲート結合アッセイは、結核薬の発見において重要なツールであり、他の疾患によって引き起こされる病変または膿瘍の薬物分布を研究するのに役立つことができる。

このプロトコルを使用して、我々は浸透カゼムでの予測された効率のために何百もの結核薬開発化合物を試験した。 図1は、REDアッセイの基本概念を視覚化しています。 REDインサートの透析膜は、未結合の小分子がドナーウェルからレシーバウェルに拡散し、最終的に両方のコンパートメント間の平衡を達成することを可能にする。タンパク質または脂質のような巨大分子に結合した小分子は、ドナーウェルに捕捉される。両方の区画からの試料の定量分析により、カゼムまたは代理母材中の各小分子の未結合画分（ f u ）を計算することが可能になる。この画分は、インビボでのカゼウムの薬物浸透と直接的に相関することが示されている 。 図2が示すように、MALDI（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）質量分析メトリー画像では、 f uが高くなればなるほど、薬剤はカゼムに拡散する。したがって、これは、薬物分子が病変の細胞層との界面か...

ここでは、肺結核病変および腔からのカゼムとの薬物結合を測定するための迅速な平衡透析（RED）法を説明する。このプロトコールはまた、発泡マクロファージ由来のマトリックスと共に使用され、これは、カゼムの有効な代用物である。

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

このプロトコルの全体的な目的は、結核病変から得られた乾酪様物質への薬剤結合を予測することです。この手法により、動物モデルや高価なイメージング技術を使用せずに、抗菌薬が壊死病変の乾酪様コアにどの程度効果的に浸透するかを判断できます。この方法は結核の直接的な発見に洞察を与えるだけでなく、薬剤の浸透が制限される病変や膿瘍の形成を特徴とする他の疾患にも適用可能です。プロトコルの実施における一貫性が実験間のデータの再現性を確保するため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本日は、細胞培養の手順とサロゲートマトリックスの調製について実演します。その後、当研究室のリサーチアソシエイトであるHsin-pinが、適切なアッセイについて実演します。2 mMのl-グルタミンおよび10%胎児ウシ血清を含む80 mLのRPMI 1640培地を入れたT-175細胞培養フラスコで、THP-1単球を培養します。フラスコを37°C、5%二酸化炭素条件下で3〜4日間インキュベートします。細胞が約70%コンフルエントに達したら、2本の50 mLコニカルチューブに分注し、150 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを10 mLのRPMI 1640培地に懸濁させる。この培養液5 µLを、45 µLのトリパンブルーを含む1.5 mLチューブにピペッティングして加える。ピペッティングにより十分に混ぜ合わせる。10 µLを血球計数器に分注します。光学顕微鏡を10倍倍率で使用し、生存しているTHP-1単球の数をカウントします。培養液1 mLあたりの生存細胞数を決定した後、RPMI培地を用いて最終密度が1.25 × 10⁶ cells/mLになるように希釈します。100 µM PMAを40 µL、チューブに加えます。その後、培養物を140 × 20 mmの細胞培養プレートに移します。インキュベーター内で一晩置いて、細胞を接着させます。次に、純粋なiliac acidをエタノールで0.1 molarの濃度に希釈します。ここでは、31.7 µLのiliac acidを968.3 µLのエタノールに溶解させます。この溶液を、あらかじめ加温した新鮮なRPMI培地で10 millimolarの濃度まで希釈します。イリア酸懸濁液を、37°Cに予熱したRPMI培地を用いて最終的に0.4 millimolarの作業濃度まで希釈します。脂肪酸を水溶液に十分に溶解させるためには、予熱したRPMI培地でイリア酸を希釈することが極めて重要です。ピペットを用いて、THP-1マクロファージを含む細胞培養プレートから既存の培地と非付着細胞を除去し、0.1 millimolarのイリア酸を40 mL緩やかに加えます。インキュベーター内にて37°Cで一晩インキュベートします。翌日、光学顕微鏡を用いて40倍の倍率で、THPマクロファージに多数の脂質小体封入体が存在することを視覚的に確認します。脂質小体は、細胞質内の小さく透明な球状構造として観察されます。細胞培養プレートからRPMI培地をすべて除き、50 mL セロロジカルピペットを用いて、接着細胞をPBSで2回静かに洗浄します。5 millimolar EDTAおよびPBSを40 mL、プレートに加えます。37 °Cで15分間インキュベートします。次に、泡沫マクロファージを剥離させるため、10 mLセロロジカルピペットを用いてプレート全体の表面を繰り返しピペッティングします。細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移し、150 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを10 mLのPBSで再懸濁し、あらかじめ重量を量っておいた15 mLコニカルチューブに移します。再度、150 ×gで5分間遠心分離します。その後、セロロジカルピペットを用いて上清を慎重に吸引し、廃棄します。泡沫状マクロファージペレットを3回、フリーズスローサイクルに供します。サーマルブロックを用い、ドライアイスと37 °Cでのインキュベーションを交互に繰り返し、細胞を溶解させます。その後、75 °Cで20～30分間インキュベートし、マトリックス中のタンパク質を変性させます。パレットは、使用するまで-20°Cで保存してください。このビデオのセクションで示す迅速平衡デバイス（RED）アッセイは、先ほど作成したサロゲートマトリックス、またはTB感染ウサギ病変から採取したケーシングのいずれかを用いて実施できます。ここでは、サロゲートマトリックスを用いてアッセイを行う方法を示します。すべての試験化合物の10 millimolarストック溶液を調製します。ここでは、moxyfloxacinをDMSOで調製します。各アッセイの前に、DMSOを用いて500 micromolarのワーキングソリューションに希釈します。摘出された乾酪物質またはサロゲートパレットを入れたチューブの重量を量ります。空チューブの重量を差し引き、乾酪物質またはサロゲートパレットのみの重量を算出します。チューブ1本につきメタルビーズを2〜3個加え、その後PBSをW/V比1:9の割合で加えます。ボルテックスミキサーを用いて、乾酪物質またはサロゲートマトリックスを1分間破砕します。調製したテスト化合物を6.5 µL、ホモジネート643.5 µLに加えます。最終濃度を5 µMにし、ボルテックスで混合します。次に、レッドインサートをベースプレートに設置します。各試験用のインサートを準備し、各化合物を3連（triplicate）で用意します。各レッドインサートの赤いドナーチャンバーに、薬剤を添加したマトリックスを200 microliters加えます。その後、各レシーバーチャンバーにPBSを350 microliters加えます。プレートに粘着シールを貼り、サーマルミキサーを用いて37 °C、200 rpmで4時間インキュベートします。インキュベーション後、ピペッティングを2〜3回行い、ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーの内容物を穏やかに混合します。各ドナーチャンバーから20 µLのホモジネートを回収し、1.5 mLチューブに入れた20 µLのクリーンなPBSに転移します。同様に、受容室から20 µLずつのPBSサンプルを、20 µLのクリーンなホモゲネートに転移させます。マトリックスマッチングを行うことで、定量分析のためにホモゲネートとPBSで2つの別々の比色検量線を作成する必要がなくなります。ドナー室の内容物は、時間の経過とともに沈殿が生じます。分注する前に、ピペッティングして内容物を穏やかに混合します。内部標準として、diclofenacを500 nanograms per milliliter、またはverapamilを10 nanograms per milliliter含むメタノールとアセトニトリルの1:1混合液を、各チューブに160 microlitersずつ加えます。ボルテックスミキサーで攪拌し、タンパク質を沈殿させます。10000 x gで5分間遠心分離して沈殿物を沈降させた後、上清を96ウェルディープウェルプレートに移し、液体クロマトグラフィー質量分析法（LCMS）による分析を行います。サンプルと同じマトリックス組成を維持しながら、化合物ストック溶液を希釈し、各試験化合物について1から1000 nanomolarsの検量線を作成します。LCMS法を用いて、ドナー室およびレシーバー室のサンプル中の試験化合物の濃度を定量します。ここに示す式1を用いて、薬物および希釈マトリックスの非結合分率（fu）を算出します。次に、Dを希釈倍率10として、式2を用いて非希釈マトリックス中のfuを算出します。最後に、ここに示す式3を用いて、各化合物の回収率または物質収支を確認します。安定性、代謝、または非特異的結合に問題がある化合物を特定します。通常、回収率は70%から130%の間になります。このビデオで説明するプロトコルは、数百種類の結核治療薬開発化合物について、乾酪様物質への浸透予測効率を試験するために用いられてきました。赤色のインサートの透析膜により、非結合の低分子がドナーウェルからレシーバーウェルへと拡散し、最終的に両コンパートメント間で平衡状態に達します。タンパク質や脂質などの高分子に結合した低分子は、ドナーウェル内に留まります。ここに示すように、両コンパートメントから採取したサンプルの定量分析を行うことで、カゼウムまたは代替マトリックス中における各低分子の非結合分率（fu）を算出できます。fuが高くなるほど、薬剤はより広範囲に乾酪組織へと拡散します。6種類の薬剤について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、すなわちMALDI質量分析イメージングを実施しました。代表的な肺病変のイオンマップをここに示し、信号強度は左側のスケールバーで示しています。ヘマトキシリン染色およびESNまたはHNEによる連続切片の染色結果を以下に示す。白黒の等高線は、各病変の乾酪性中心部を強調している。これらのデータは、薬剤分子が病変の細胞層との界面から乾酪物質の外縁へと拡散するという仮説と一致している。乾酪様高分子への結合は薬剤を捕捉し、乾酪様コアへのさらなる拡散を妨げます。ここで示すように、THP-1由来の泡沫状マクロファージから調製したマトリックスは、実際の乾酪物質の有効な代用となります。両方のマトリックスにおける結合は、互いに強い相関を示します。この手順に従うことで、複数の化合物を同時にテストし、時間とリソースを節約することが可能です。これをカセット試験と呼びます。開発以来、このアッセイは結核治療薬探索のための複数のリード最適化プログラムで使用されてきました。微小細菌および結核感染組織検体の取り扱いは極めて危険であるため、BSL2ラボで感染したケーシングサンプルを扱う前に、ガンマ線照射を用いた検証済みの組織滅菌プロトコルを使用することを忘れないでください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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