準備と

本手順の全体的な目的は、microRNAによる細胞改変と細胞の磁性化を同時に実現する手法を紹介することです。この手法は、移植前の細胞の遺伝子工学的な改変など、再生医療分野における主要な課題を解決することができます。

microRNAによる効率的な細胞修飾に加えて、酸化鉄を用いた修飾も可能となりました。これにより、磁場を印加することで、目的部位における細胞保持能を高めることができます。細胞治療は心疾患の治療において非常に有望ですが、細胞保持率の低さが課題となっており、細胞生存率を早急に改善させる必要があります。

本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、トランスフェクション複合体の調製に向けてヒト臍帯静脈内皮細胞の培養を行ってください。トランスフェクションの48時間前に、適切なサイズのプラスチック製細胞培養ウェルプレートにHUVECを播種します。このとき、播種密度は成長表面1平方センチメートルあたり約13,000細胞としてください。

次に、新鮮なmiR/ポリエチレンイミン/超常磁性酸化鉄ナノ粒子を調製します。まず、細胞増殖表面1平方センチメートルあたり2.5 picomolesのmicroRNAと5%グルコース溶液を用いて希釈し、最終濃度を0.125 picomoles/µLにします。次に、PEIを等量の5%グルコース溶液で希釈します。

希釈したPEIをmicroRNA溶液に加え、得られた混合物を30秒間ボルテックスします。次に、miR/PEI混合物を室温で30分間インキュベートします。MNPを室温の超音波洗浄機付きウォーターバスで少なくとも20分間ソニケーションします。

次に、適切な量のMNP溶液を調製済みのmiR/PEI混合液に加えます。30秒間ボルテックスした後、室温で30分間インキュベートします。続いて、調製したmiR/PEI/MNP混合液を、細胞の培養基に直接、滴下して加えます。

トランスフェクションの6時間後に、この混合液を新鮮な培地と交換します。本文のプロトコルに記載されているベクター安全性の解析後、共焦点顕微鏡および超解像構造照明顕微鏡を用いて、トランスフェクション複合体の細胞内局在を確認し、特性評価を行います。そのために、前述と同様に、24ウェル培養プレートのウェルに配置したゼラチンコート済みガラスカバースリップ上にHUVECを播種します。

3色で標識したmiR/PEI/MNPを細胞にトランスフェクションし、5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、37°Cで24時間インキュベートします。カバーガラスを、まず2%ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次いでPBSのみで洗浄します。4%パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて37°Cで15分間インキュベートし、細胞を固定します。

PBSで洗浄した後、標準的なプロトコルに従ってDAPIで核を染色します。次に、過剰な染料を除去するため、シェーカーを用いてPBSで細胞を15分間、3回洗浄します。準備したカバーガラスを適切な封入剤を用いて顕微鏡スライドガラスに載せ、顕微鏡観察に使用する前に、スライドガラスを少なくとも1時間乾燥させます。

テキストプロトコルに記載されているSIM設定を用いて、63倍の油浸対物レンズで画像を撮影します。in vitroでの細胞標的化および模擬動的条件については、まず前述の手順に従ってHUVECを24ウェルプレートにトランスフェクトします。24時間インキュベートした後、細胞を洗浄します。

次に、PBSで希釈したEDTAを1×分量加え、細胞を37 °Cで4分間インキュベートしてから細胞を回収します。回収した細胞を300 ×gで10分間遠心分離します。1ウェルから得られた細胞ペレットを、1 mLの新鮮な培地と混合します。

そして、細胞を12ウェルプレートの1つのウェルに移植します。小さな磁石をテープで局所的に固定します。培養プレートをシェーカーに設置し、細胞懸濁液を150 RPMで12時間インキュベートして、動的な条件を模倣します。

次に、細胞を洗浄し、4% PFAを用いて固定します。DAPIで核を染色します。z-stackモードで405および504ナノメートルの励起レーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞の接着を記録し、生データを取得します。

解析用の画像を作成するために、最大強度投影（maximum intensity projection）画像処理を用います。磁気応答性細胞および非応答性細胞の定量解析を行うには、まず24ウェルプレートでHUVECsにトランスフェクションを行います。細胞を24時間インキュベートした後、前述の手順に従って細胞を洗浄し、回収します。

各ウェルから得られた細胞ペレットを、加温した滅菌済みの細胞ソート用バッファー 500 µL で再懸濁します。この細胞懸濁液を、付属のマグネットで固定した磁気ソートカラムに適用します。その後、マグネットに固定したままのカラムを、新鮮な細胞ソート用バッファーで3回洗浄します。

フロースルーを磁気非反応分画として回収します。マグネットからカラムを取り外し、プランジャーを用いて新しい細胞分取バッファーをカラムに押し通し、磁気反応性細胞分画を直ちに回収します。Mag-分画とMag+分画の両方を300 ×gで10分間遠心分離します。

細胞ペレットをPBSで再懸濁した後、細胞数を計測し、トリパンブルー排除試験を用いて細胞生存率を評価します。臍帯から単離されるHUVECは、内皮マーカーであるCD31の発現と、基底膜マトリックス上での管腔形成によって特徴付けられます。miR/PEI/MNPをトランスフェクションしたHUVECは、すべてタグ付きmiRを取り込みます。

そして、トランスフェクションの24時間後において、生存率に影響は見られません。さらに、超解像顕微鏡により、3色で標識されたトランスフェクション複合体が核周縁に局在していることが示されています。PEIの毒性は、miR/PEIをトランスフェクションした細胞の機能低下によって確認されます。

重要な点として、MNPは細胞特性を回復させます。miR/PEI/MNPで修飾された細胞は、管腔形成において未処理の細胞と差がありません。さらに、これらの細胞は、光退色後蛍光回復（FRAP）によって明らかにされたように、細胞間のギャップ結合通信を維持しています。

miR/PEI/MNP修飾細胞の懸濁液を回転シェーカー上に設置した培養プレートのウェルに播種すると、細胞は局所的に磁石を適用した領域に遊走し、接着する傾向があります。代表的な画像に、磁石適用領域における細胞増殖を示します。磁石を適用していない場合。

そして、液体の流れが集中する培養ウェルの中心に細胞が凝集します。習得すれば、細胞のトランスフェクションは2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、磁性化を含む、血管内皮細胞を一過的に、かつ非常に効率的に改変する方法について十分な理解が得られるはずです。

また、細胞産物の最終的な特性評価方法についても説明します。この手順を行う際は、細胞播種量、トランスフェクション複合体調製時の各コンポーネント量、インキュベーション時間、およびトランスフェクション後の洗浄ステップについて、指定された数値を遵守することが重要です。この手法は、他の罹患臓器を治療するための他の細胞型にも十分に転用可能であると考えています。

この手順に従い、磁化修飾細胞を用いたin vivo研究を実施することができます。これにより、細胞の鉄負荷が目的部位での保持を確実にするために十分であるかという追加の疑問を解決できる可能性があります。また、in vivo MRIにおける検出限界を定義することも可能です。