Name: 準備とインビトロキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ microRNAの非ウイルス導入と細胞磁化法。PEI/MNPベクターを用いて内皮細胞を修飾し、磁場による標的細胞誘導とMRI検出を可能にする再生医療向け技術です。

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私たちは、フィルタ処理された超常磁性ナノ粒子のTEM像を取得する際、そのX線分析を行う上での技術サポートのためにG.フルダ（電子顕微鏡センター、ロストック大学、ドイツ）を感謝したいと思います。 RTCロストックで行わ作品は、連邦教育研究省ドイツ（FKZ 0312138A、FKZ 316159およびVIP + 03VP00241）とEU構造基金と国家メクレンブルク=フォアポンメルン州（ESF / IV-WM-B34-によってサポートされていました0030/10及びESF / IV-BM-B35-0010 / 12）とDFG（DA 1296から1）、ダンプ・財団、ドイツ心臓財団（F / 01/12）。フランク・ウィークホースト EU FP7の研究プログラム &quot;ナノMAG&quot; FP7-NMP-2013-LARGE-7でサポートされていました。

我々は、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

それらのさらなる磁気的に制御指導のための超常磁性ナノ粒子を搭載した遺伝子操作された細胞の生産は現在のプロトコルに提示されています。この戦略の成功した適用は、移植のために標的化可能細胞生成物を提供することによって、そのような損傷した領域2、3、4における低い保持および乏しい生着などの細胞療法のいくつかの問題の解決を可能にします。また、適切に選択された遺伝物質の同時導入は、細胞の性質を促進することができ、したがって、機能的利益41を増大させる可能性があります。 現在のプロトコルは、モデルとしてのHUVEC上で開発されてきました。これらの細胞をトランスフェクトすることが困難と毒性影響18、19、20</su...

遺伝子や細胞治療は、CVD処理における現在の課題を解決する可能性を持っている強力なツールです。これらのアプローチの両方が、現在臨床試験で検証されているという事実にもかかわらず、彼らはまだ広い臨床応用1のための準備ができていません。特に、遺伝子や細胞治療の課題に取り組むための一般的なアプローチは、臨床応用に適した多機能の遺伝子送達ベクターを開発することです。安全かつ効率的な遺伝子送達システムの欠如は遺伝子治療の主要な関心事です。同時に、移植前に細胞産物の遺伝子工学は、 例えば、心臓の分野では、機能改善のわずか約5％がポスト幹細胞移植1を達成している（例えば、低効率として、細胞治療の深刻な課題を克服することができ時間Poに数分以内に10％ - ）と損傷部位での貧弱な保持/移植は（ すなわち、細胞保持は5を下回りますST-アプリケーションにかかわらず、投与経路2、3、4）。 現在までに、ウイルスベクターは大きく、臨床試験におけるそれらの広い応用をもたらした効率の点で、非ウイルス系（〜67％）5上回ります。しかし、ウイルスビヒクルは、免疫原性などの重大なリスク（およびその後の炎症性の重篤な合併症を伴う応答、）、発癌性、および実施遺伝物質6の大きさに制限を運びます。これらの安全性の問題およびウイルスベクターの生産の高コストのため、非ウイルス系の使用は、特定のケース7,8で好ましいです。このような（CVD処理用など）血管新生を制御する成長因子の発現のような一過性の遺伝的補正を必要とする障害、又はdeliveに特に適していますワクチンのRY。 我々のグループでは、送達システムは、分枝25-kDaのポリエチレンイミン（PEI）及びビオチン-ストレプトアビジン相互作用9によって一緒に結合された超常磁性酸化鉄ナノ粒子（MNP）を組み合わせることにより設計しました。このベクターは、移植前に彼らの同時磁化を考慮して、細胞の遺伝子工学のための潜在的なツールです。後者は、高度な磁気ターゲティング技術が成功10を開発されているように、最近特に有望である磁気誘導/維持のための基礎を提供します。また、得られた磁気応答性細胞は、非侵襲的磁気共鳴画像法（MRI）または磁性粒子イメージング11,12によって監視される可能性を有しています。 PEI / MNPベクターの場合には、ポリアミンは、核酸縮合従って因子を分解からの保護を確実にします<html> sの、細胞内でのベクターの内在、およびエンドソーム脱出5。 MNPは、磁気誘導の観点からだけでなく、公知のPEIの毒性7、13、14を還元することによってだけでなく、PEIの特性を補完します。以前に、PEI / MNPベクトル特性は、線維芽細胞およびヒト間葉系幹細胞15、16を用いて送達効率（ すなわち、のpDNAおよびmiRNA）及び安全性の点で調整しました。 本稿において、miRNA修飾細胞の生成のためのPEI /のMNPのアプリケーションに関する詳細なプロトコールは、17に記載されています。この目的のために、HUVECを用い、in vitroでの血管新生のために確立されたモデルを表しています。彼らは、トランスフェクトするために挑戦していると毒性影響18、19の影響を受けやすいですお尻= &quot;外部参照&quot;&gt; 20。また、我々は彼らの標的化、細胞間コミュニケーション、およびMRI検出を含むin vitroでのこのような細胞を、評価するためのアルゴリズムを提供します。

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>Sephadex G-25 中ニン</td></tr><tr><td>ヒドリン試薬溶液 2%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader Model 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere 常磁性粒子</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filter</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &micro;m</td></tr><tr><td>Libra 120 透過型電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>加速電圧 120&nbsp;kV</td></tr><tr><td>サファイアX線検出器</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プラスチック</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA ラベル ITキット</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV型 Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>内皮増殖培地、EGM-2</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156 &CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>抗PECAM-1抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS カラム</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>近赤外生細胞/死細胞染色キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 色素標識 Pre-miR ネガティブコントロール</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>原稿の「Cy3-miR」または「Cyanine-miR3」</td></tr><tr><td>Pre-miRNA Precursor Molecules - Negative Control&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td>"<td>scr-miR" 原稿</td></tr><tr><td>Anti-has-miR92a-3p 合成阻害剤&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>4% solution in PBS</td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA isolation Kit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 逆転写キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-92a TaqMan assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>Mature miRNA Sequence:UAUUGCACUUGCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>日本ジェネティクス</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan アッセイ</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan アッセイ</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA 内在性コントロール</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7.1 テスラ動物 MRI システム</td><td>ブルカー コーポレーション</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>国立衛生</td><td></td>研究所 <td>血管新生アナライザー (NIH)</td></tr> <tr><td>MPS デバイスで</td>アップグレード <td>ブルカー バイオスピン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab ソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リングネオジムマグネット&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 mm; 残留電流は~1.3&nbsp;T、保磁力 &ge;955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 イメージングキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 試薬</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>バンデリン 電子</td><td>タイプ: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmir修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

現在までに、心血管疾患（CVD）のために利用できる外科および薬理学的治療は限られており、多くの場合、姑息されています。同時に、遺伝子や細胞療法は、CVD処理のための非常に有望な代替的なアプローチです。しかし、遺伝子治療の広範な臨床応用を大幅に適当な遺伝子送達系の欠如によって制限されます。適切な遺伝子送達ベクターの開発は、細胞療法における現在の課題に対する解決策を提供することができます。特に、このような負傷者の臓器における限ら効率と低い細胞保持などの既存の欠点は、移植前に、適切な細胞工学（ すなわち、遺伝）によって克服することができます。提示プロトコルは、ポリエチレンイミン超常磁性ナノ粒子（PEI / MNP）に基づく送達ベクターを使用して、内皮細胞の効率的かつ安全な過渡変形を記載しています。また、セルの特性評価のためのアルゴリズムおよび方法が定義されています。成功intracelluヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）へのマイクロRNA（MIR）のLAR送達は、細胞生存率、機能、または細胞間通信に影響を与えることなく達成されました。また、このアプローチは、導入された外因性のmiRに強い機能的な効果を引き起こすことが証明されました。重要なことに、このMNPベースのベクターの適用は、磁気ターゲットと非侵襲的MRIトレースの可能性を伴って、細胞磁化を確実にします。これは、MRIで非侵襲的に監視することができる磁気誘導、遺伝的に操作された細胞治療のための基礎を提供することができます。

提案されたプロトコルの主な目的は、磁気応答性のmiR-改変細胞を生成し、それらの正確な特性（ 図1）を行うことです。その結果、磁気選択および誘導およびMRIで検出可能に反応効率的にトランスフェクトされた細胞は、得られるべきです。 まず、単離されたHUVECの同一性は、内皮マーカーCD31（PECAM）（ 図2A）を有する典型的な染色によって、適切な基底膜マトリックス（ 図2B）に管を形成する能力によって確認しました。得られた細胞は、miRは非常に効率的にPEI / MNPによって導入され始めました。顕微鏡検査は、すべてのセルがタグ付けされたmiR（Cy3の）24時間トランスフェクション後（ 図3A）の信号に対して陽性であったことを実証しました。重要なことには、全く細胞死は、未処理細胞（ 図3B）</st...

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

本手順の全体的な目的は、microRNAによる細胞改変と細胞の磁性化を同時に実現する手法を紹介することです。この手法は、移植前の細胞の遺伝子工学的な改変など、再生医療分野における主要な課題を解決することができます。microRNAによる効率的な細胞修飾に加えて、酸化鉄を用いた修飾も可能となりました。これにより、磁場を印加することで、目的部位における細胞保持能を高めることができます。細胞治療は心疾患の治療において非常に有望ですが、細胞保持率の低さが課題となっており、細胞生存率を早急に改善させる必要があります。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、トランスフェクション複合体の調製に向けてヒト臍帯静脈内皮細胞の培養を行ってください。トランスフェクションの48時間前に、適切なサイズのプラスチック製細胞培養ウェルプレートにHUVECを播種します。このとき、播種密度は成長表面1平方センチメートルあたり約13,000細胞としてください。次に、新鮮なmiR/ポリエチレンイミン/超常磁性酸化鉄ナノ粒子を調製します。まず、細胞増殖表面1平方センチメートルあたり2.5 picomolesのmicroRNAと5%グルコース溶液を用いて希釈し、最終濃度を0.125 picomoles/µLにします。次に、PEIを等量の5%グルコース溶液で希釈します。希釈したPEIをmicroRNA溶液に加え、得られた混合物を30秒間ボルテックスします。次に、miR/PEI混合物を室温で30分間インキュベートします。MNPを室温の超音波洗浄機付きウォーターバスで少なくとも20分間ソニケーションします。次に、適切な量のMNP溶液を調製済みのmiR/PEI混合液に加えます。30秒間ボルテックスした後、室温で30分間インキュベートします。続いて、調製したmiR/PEI/MNP混合液を、細胞の培養基に直接、滴下して加えます。トランスフェクションの6時間後に、この混合液を新鮮な培地と交換します。本文のプロトコルに記載されているベクター安全性の解析後、共焦点顕微鏡および超解像構造照明顕微鏡を用いて、トランスフェクション複合体の細胞内局在を確認し、特性評価を行います。そのために、前述と同様に、24ウェル培養プレートのウェルに配置したゼラチンコート済みガラスカバースリップ上にHUVECを播種します。3色で標識したmiR/PEI/MNPを細胞にトランスフェクションし、5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、37°Cで24時間インキュベートします。カバーガラスを、まず2%ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次いでPBSのみで洗浄します。4%パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて37°Cで15分間インキュベートし、細胞を固定します。PBSで洗浄した後、標準的なプロトコルに従ってDAPIで核を染色します。次に、過剰な染料を除去するため、シェーカーを用いてPBSで細胞を15分間、3回洗浄します。準備したカバーガラスを適切な封入剤を用いて顕微鏡スライドガラスに載せ、顕微鏡観察に使用する前に、スライドガラスを少なくとも1時間乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているSIM設定を用いて、63倍の油浸対物レンズで画像を撮影します。in vitroでの細胞標的化および模擬動的条件については、まず前述の手順に従ってHUVECを24ウェルプレートにトランスフェクトします。24時間インキュベートした後、細胞を洗浄します。次に、PBSで希釈したEDTAを1×分量加え、細胞を37 °Cで4分間インキュベートしてから細胞を回収します。回収した細胞を300 ×gで10分間遠心分離します。1ウェルから得られた細胞ペレットを、1 mLの新鮮な培地と混合します。そして、細胞を12ウェルプレートの1つのウェルに移植します。小さな磁石をテープで局所的に固定します。培養プレートをシェーカーに設置し、細胞懸濁液を150 RPMで12時間インキュベートして、動的な条件を模倣します。次に、細胞を洗浄し、4% PFAを用いて固定します。DAPIで核を染色します。z-stackモードで405および504ナノメートルの励起レーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞の接着を記録し、生データを取得します。解析用の画像を作成するために、最大強度投影（maximum intensity projection）画像処理を用います。磁気応答性細胞および非応答性細胞の定量解析を行うには、まず24ウェルプレートでHUVECsにトランスフェクションを行います。細胞を24時間インキュベートした後、前述の手順に従って細胞を洗浄し、回収します。各ウェルから得られた細胞ペレットを、加温した滅菌済みの細胞ソート用バッファー 500 µL で再懸濁します。この細胞懸濁液を、付属のマグネットで固定した磁気ソートカラムに適用します。その後、マグネットに固定したままのカラムを、新鮮な細胞ソート用バッファーで3回洗浄します。フロースルーを磁気非反応分画として回収します。マグネットからカラムを取り外し、プランジャーを用いて新しい細胞分取バッファーをカラムに押し通し、磁気反応性細胞分画を直ちに回収します。Mag-分画とMag+分画の両方を300 ×gで10分間遠心分離します。細胞ペレットをPBSで再懸濁した後、細胞数を計測し、トリパンブルー排除試験を用いて細胞生存率を評価します。臍帯から単離されるHUVECは、内皮マーカーであるCD31の発現と、基底膜マトリックス上での管腔形成によって特徴付けられます。miR/PEI/MNPをトランスフェクションしたHUVECは、すべてタグ付きmiRを取り込みます。そして、トランスフェクションの24時間後において、生存率に影響は見られません。さらに、超解像顕微鏡により、3色で標識されたトランスフェクション複合体が核周縁に局在していることが示されています。PEIの毒性は、miR/PEIをトランスフェクションした細胞の機能低下によって確認されます。重要な点として、MNPは細胞特性を回復させます。miR/PEI/MNPで修飾された細胞は、管腔形成において未処理の細胞と差がありません。さらに、これらの細胞は、光退色後蛍光回復（FRAP）によって明らかにされたように、細胞間のギャップ結合通信を維持しています。miR/PEI/MNP修飾細胞の懸濁液を回転シェーカー上に設置した培養プレートのウェルに播種すると、細胞は局所的に磁石を適用した領域に遊走し、接着する傾向があります。代表的な画像に、磁石適用領域における細胞増殖を示します。磁石を適用していない場合。そして、液体の流れが集中する培養ウェルの中心に細胞が凝集します。習得すれば、細胞のトランスフェクションは2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、磁性化を含む、血管内皮細胞を一過的に、かつ非常に効率的に改変する方法について十分な理解が得られるはずです。また、細胞産物の最終的な特性評価方法についても説明します。この手順を行う際は、細胞播種量、トランスフェクション複合体調製時の各コンポーネント量、インキュベーション時間、およびトランスフェクション後の洗浄ステップについて、指定された数値を遵守することが重要です。この手法は、他の罹患臓器を治療するための他の細胞型にも十分に転用可能であると考えています。この手順に従い、磁化修飾細胞を用いたin vivo研究を実施することができます。これにより、細胞の鉄負荷が目的部位での保持を確実にするために十分であるかという追加の疑問を解決できる可能性があります。また、in vivo MRIにおける検出限界を定義することも可能です。

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