組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究

この手順の全体的な目的は、タンパク質のX線結晶構造解析や酵素反応速度論などの生物物理化学的研究を促進するために、非病原性細菌から組換えタンパク質を調製することです。本手法は、予備的な生物物理学的特性解析のために、非病原性細菌を用いて目的の組換えタンパク質をどのように調製するかという重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、細胞培養インキュベーターや分光光度計などの一般的な機器を備えたあらゆる研究室で、目的タンパク質の生物物理学的特性解析が行えることです。

本手順を開始するために、テキストプロトコルに従ってライゲーション反応液を調製します。調製したライゲーション反応液 3 µL を、50 µL の化学的コンピテント E.coli DH5 alpha 細胞を含むチューブにピペットで分注します。ピペットを用いて、溶液を穏やかに混合してください。

溶液を氷上で30分間冷却します。次に、42 °Cで45秒間のヒートショックを行います。その後、1 mLのLB培地を加え、37 °Cで250 rpmで激しく振盪しながら、細胞を45分間培養します。

形質転換細胞100 µLを、100 µg/mLのカナマイシンを添加したLBアガープレートに塗布します。37 °Cで18時間インキュベートします。滅菌チップを用いて、プレートからコロニーをピックアップします。

添加物を加えた3 mLのLB培地中で、18°C、250 rpmの激しい振盪条件下で18時間、細胞を培養します。その後、テキストプロトコルに記載されている手順に従ってプラスミドDNAを調製し、ヌクレオチド配列を確認します。E.coli BL21株に再形質導入した後、滅菌チップを用いてコロニーを選択し、150 µg/mLのカナマイシンを含む10 mLのLB培地に接種します。

37 °Cで、250 rpmの激しい振盪を加えながら18時間インキュベートします。次に、10 mLのオーバーナイト培養液を1 LのLBおよびカナマイシン培地に移します。600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.7に達するまで、37 °Cで培養します。

次に、培養液を氷冷水に15分間浸します。最終濃度が1 mMになるようにIPTGを培養液に添加します。さらに18 °Cで16〜18時間インキュベートします。

その後、4°Cで30分間、5,000 ×gで遠心分離します。上清を慎重に除き、10 mMイミダゾールを含む50 µLのPBSで細胞を再懸濁します。

次に、テキストプロトコルの詳細に従い、氷上で細胞を2回溶解します。細胞溶解液を清浄にするため、4℃で30分間、25,000 ×gで遠心分離します。その後、50 mLのコニカルチューブに、3 mLのニッケルビーズと10 mMイミダゾールを含むPBS 47 mLを混合します。

2.5 x 10 cmのガラス製クロマトグラフィーカラムに、余剰のバッファーを重力流で流し、平衡化したビーズを沈降させます。ピペットを使用して、上清をカラムに転移させます。回転盤を用い、20 rpmで4°Cにて2時間インキュベートします。

その後、上清を重力によって落とします。10 millimolar imidazoleを含む100 millilitersのPBSを用いて、ニッケルビーズを3回洗浄します。次に、250 millimolar imidazoleを含む5 millilitersのPBSを加え、RBC 1531タンパク質を溶出させます。

テキストプロトコルに記載されている手順に従い、溶出液 15 µL を SDS-PAGE で分析します。回収した分画を透析チューブにピペッティングします。チューブを、4 °C で保存した 4 L のトロンビン切断適合バッファーを含むビーカーに入れ、一晩静置します。

翌日、ピペットを用いて分画物を15 milliliterのコニカルチューブに移します。テキストプロトコルに記載されている通り、280 nanometersでの吸光度を測定し、タンパク質濃度を推定します。次に、50 microlitersのRBC 1531タンパク質を複数のチューブに移します。

各チューブに異なる量のトロンビンを添加し、20 °Cで3時間インキュベートします。必要最小限のトロンビン量を決定した後、15 mLチューブに10 mgのタンパク質と60 unitsのトロンビンを添加します。20 °Cで3時間インキュベートします。

次に、トロンビン消化後のタンパク質を遠心ろ過チューブに移します。4 °Cで 3,000 ×g で遠心分離し、液量を 5 mL 未満まで濃縮します。その後、濃縮したタンパク質を準備したサイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用します。

1本あたり0.5 millilitersで、溶出画分を60本回収します。テキストのプロトコルに従い、各画分の15 microlitersを15%SDS Pageゲルで電気泳動します。その後、RBC 1531タンパク質を含む画分を合わせます。

まず、混合した分画を遠心ろ過チューブに移します。4 °Cで3,000 ×gで遠心分離し、タンパク質を約18.5 mg/mLに濃縮します。次に、96ウェル座った滴結晶化プレートの各ウェルに、各結晶化スクリーニング溶液を50 µLずつ加えます。

濃縮タンパク質溶液0.5 µLをシッティングベッドに添加します。別途、タンパク質溶液とウェル溶液0.5 µLを混合します。プレートを透明な粘着フィルムで覆います。

18 °Cでインキュベートし、蒸気拡散を行う。光学顕微鏡を用いて、20倍から40倍の倍率でドロップを走査し、2〜3週間にわたって結晶形成を毎日観察する。NTP基質を調製した後、それぞれを96ウェルプレートに加える。

ピペットを使用して、各ウェルに20 µgのRBC 1531タンパク質を加え、混合します。プレートに蓋をして、37 °Cで30分間インキュベートします。その後、プレートを70 °Cのウォーターバスに15分間移し、RBC 1531による触媒反応を停止させます。

次に、各ウェルに S.cerevisiae 無機ピロホスファターゼを 1 µL 加えます。20 °C で 30 分間インキュベートします。その後、呈色させるため、反応プレートにモリブデン酸溶液を 16 µL 加えます。

15分後、690ナノメートルにおける吸光度を測定します。本研究では、B系列BC1531遺伝子のタンパク質産物を分子レベルで特性解析します。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、トロンビン消化試験を行います。

RBC 1531からアフィニティータグを完全に除去するために必要な最小量は、0.3 unitsのトロンビンであることが確認されました。消化後、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、タグフリータンパク質を約99%の純度まで精製しました。その後、サイズ排除クロマトグラフィーによりオリゴマー状態を推定しました。

RBC 1531は約84 mLで溶出されるため、その分子量は55 kDaと推定されます。単量体の計算上の分子量は約13 kDaです。したがって、RBC 1531は四量体として会合していると考えられます。

次に、座滴蒸気拡散法を用いて結晶化スクリーニングを行います。1 Mのクエン酸ナトリウムおよび20%ポリエチレングリコール 3,000、および0.1 Mのカコジル酸ナトリウムおよび1 Mのクエン酸ナトリウムにおいて、2日後に結晶が確認されました。その後、NTPase活性を測定します。

RBC 1531を介した加水分解反応にモリブデン酸塩を添加しても、目に見える色の変化は認められません。しかし、ピロホスファターゼを添加すると、色が濃い青色に変化します。その後、690ナノメートルにおける吸光度とNTP濃度を非線形回帰を用いて解析します。

RBC 1531酵素の最大速度は0.75、ミカエリス定数は10 micromolarであると決定されています。この手順を行う際は、タンパク質サンプルを遅滞なく調製すること、およびタンパク質の結晶化を妨げたり、酵素アッセイに誤差を導入したりする不純物を含む分画を廃棄することが重要です。この手法の開発により、酵素学およびその他のタンパク質科学分野の研究者が、ほとんどの研究室に備わっている分光光度計を用いて目的のタンパク質を特性評価することが可能となりました。

この手法は、組換えタンパク質の調製、結晶化スクリーニング、および酵素動力学に関する一般的な概念への洞察を提供しますが、関心のある他のタンパク質の生物物理化学分析にも適用可能です。タンパク質は極めて不安定な場合があるため、取り扱いには十分注意してください。サンプルを氷上に保持する、あるいは長期保存のために-80°Cで冷凍保存するといった注意策が推奨されます。

このビデオを視聴することで、X線結晶構造解析による構造決定のためのタンパク質結晶を得るために、非病原性細菌から組換えタンパク質を調製する方法、および比色法を用いて酵素活性を特性評価する方法について十分に理解できるはずです。