組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究バチルス保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG

この手順の全体的な目標は、非病原性細菌から組換えタンパク質を調製して、タンパク質のX線結晶構造解析や酵素動態などの生物物理学的化学研究を容易にすることです。この方法は、予備的な生物物理学的特性評価のために非病原性細菌を使用して目的の組換えタンパク質を調製する方法に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞培養インキュベーターや分光光度計などの一般的な機器を備えた任意の研究室で、目的のタンパク質の生物物理学的特性評価を行うことができることです。

この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているようにライゲーション反応を準備します。調製したライゲーション反応の3マイクロリットルを、50マイクロリットルの化学的にコンピテントな大腸菌DH5アルファ細胞を含むチューブにピペットで移します。ピペットを使用して、溶液を穏やかに混合します。

溶液を30分間氷結します。次に、摂氏42度で45秒間のヒートショック。その後、1ミリリットルのLB培地を加え、毎分250回転、摂氏37度で45分間激しく振とうしながら細胞を増殖させます。

100マイクロリットルの形質転換細胞を、1ミリリットルあたり100マイクログラムのカナマイシンを補充したLBオーガープレートに広げます。摂氏37度で18時間インキュベートします。滅菌チップを使用して、プレートからコロニーをピックアップします。

3ミリリットルのLB培地で細胞を増殖させ、摂氏18度、毎分250回転で激しく振とうし、18時間加熱します。次に、血漿DNAを調製し、テキストプロトコルに概説されているようにヌクレオチド配列を確認します。大腸菌BL21株を再形質転換した後、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、1ミリリットルあたり150マイクログラムのカナマイシンを含む10ミリリットルのLB培地を接種します。

摂氏37度で18時間インキュベートし、毎分250回転で激しく振とうします。次に、10ミリリットルの一晩培養物を1リットルのLBとカナマイシン培地に移します。600ナノメートルの光学密度が0.7に達するまで、摂氏37度で成長します。

次に、培養物を氷冷水に15分間浸します。IPTGを培養物に加え、最終濃度が1ミリモルになるようにします。摂氏18度でさらに16〜18時間インキュベー

この後、摂氏4度で30分間、Gの5,000倍で遠心分離します。上清を慎重に取り除きます。10ミリモルのイミダゾールを含む50マイクロリットルのPBSに細胞を再懸濁します。

次に、テキストプロトコルに詳述されているように、細胞を氷上で2回溶解します。Gの25, 000倍で摂氏4度で30分間遠心分離し、細胞溶解物を除去します。次に、3ミリリットルのニッケルビーズと47ミリリットルのイミダゾールを含む10ミリリットルのPBSを50ミリリットルの円錐管に混ぜます。

重力流しにより、追加のバッファーを流し、平衡化したビーズを2.5×10cmのガラス製クロマトグラフィーカラムに沈殿させます。ピペットを使用して、上清をカラムに移します。4°Cで2時間、紡績ホイールで毎分20回転でインキュベー

この後、上清が重力によって排出されるのを待ちます。100ミリリットルのイミダゾールを含むPBSを使用して、ニッケルビーズを3回洗浄します。次に、250ミリモルのイミダゾールを含む5ミリリットルのPBSを適用して、RBC 1531タンパク質を溶出します。

テキストプロトコルに概説されているように、SDSページを介して15マイクロリットルの溶出を分析します。収集したフラクションを透析チューブにピペットで移します。チューブを4リットルのトロンビン切断適合バッファーが入ったビーカーに入れ、摂氏4度で一晩中入れます。

翌日、ピペットを使用してフラクションを15ミリリットルの円錐管に移します。280ナノメートルで吸光度を測定し、テキストプロトコルに概説されているタンパク質濃度を推定します。次に、50マイクロリットルのRBC 1531タンパク質をいくつかのチューブに移します。

各チューブに異なる量のトロンビンを加え、摂氏20度で3時間インキュベートします。必要なトロンビンの最小量を決定した後、15ミリリットルのチューブに10ミリグラムのタンパク質と60単位のトロンビンを追加します。摂氏20度で3時間インキュベートします。

次に、トロンビン消化されたタンパク質を遠心フィルターチューブに移します。摂氏 4 度で G の 3 、 000 倍で遠心分離し、容量を 5 ミリリットル未満に減らします。この後、濃縮タンパク質を調製したサイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用します。

チューブあたり0.5ミリリットルで60個の溶出画分を収集します。テキストプロトコルで概説されているように、15%SDSページゲルで各フラクションの15マイクロリットルを実行します。次に、RBC 1531タンパク質を含む画分を組み合わせます。

まず、結合した画分を遠心フィルターチューブに移します。摂氏4度でGの3, 000倍で遠心分離し、タンパク質を1ミリリットルあたり約18.5ミリグラムに濃縮します。次に、各結晶化スクリーニング溶液50マイクロリットルを96ウェルシッティングドロップ結晶化プレートのウェルに加えます。

0.5マイクロリットルの濃縮タンパク質溶液を座っているベッドに加えます。タンパク質溶液を0.5マイクロリットルのウェル溶液と別々に混合します。プレートを透明な粘着フィルムで覆います。

18°Cでインキュベートし、蒸気拡散させます。光学顕微鏡を使用して、液滴を20〜40倍の倍率でスキャンし、結晶形成を2〜3週間毎日監視します。NTP基板を調製した後、それぞれを96ウェルプレートに加えます。

20マイクログラムのRBC 1531タンパク質をピペットを使用して各ウェルに加え、混合します。プレートを蓋で覆い、摂氏37度で30分間インキュベートします。この後、プレートを摂氏70度の水浴に15分間移し、RBC 1531を介した触媒反応を停止します。

次に、各ウェルに1マイクロリットルのS.cerevisiae無機ピロホスファターゼを追加します。摂氏20度で30分間インキュベートします。次に、16マイクロリットルのモリブデン酸溶液を反応プレートに加えて色を現像します。

15分後、690ナノメートルの光学密度を読み取ります。この研究では、B重篤なBC1531遺伝子のタンパク質産物が分子レベルで特徴付けられます。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、トロンビン消化トレイルを行います。

0.3単位のトロンビンは、RBC 1531からアフィニティータグを完全に除去するために必要な最低量であると考えられています。消化後、タグフリータンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して約99%の純度まで精製されます。次に、オリゴマーの状態をサイズ排除クロマトグラフィーによって推定します。

RBC1531は約84ミリリットルで溶出するため、その分子量は55キロダルトンと推定されます。モノマーの計算分子量は約13キロダルトンです。したがって、RBC1531は四量体として集合する。

その後、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化スクリーニングを行います。結晶は、1モルのクエン酸ナトリウムと20%ポリエチレングリコール3, 000、0.1モルのカコジル酸ナトリウムと1モルのクエン酸ナトリウムで2日後に見られます。この後、NTPase活性が決定されます。

RBC 1531媒介加水分解反応にモリブデン酸を添加した後、目に見える色の変化は見られません。しかし、ピロホスファターゼを加えると、深い青色に色が変わるのが見えます。次に、690ナノメートルの光学密度とNTP濃度を非線形回帰を使用して分析します。

RBC 1531酵素は、0.75で最大速度を持ち、10マイクロモルのミカエリ定数を持つことが決定されています。この手順を試行する際には、タンパク質サンプルを遅滞なく調製し、タンパク質の結晶化を妨げたり、酵素アッセイでエラーを引き起こしたりする不純物を含む画分を廃棄することが重要です。この技術の開発後、この技術は、酵素学やその他のタンパク質科学の分野の研究者が、ほとんどの研究室で装飾されている分光光度計を使用して関心のあるタンパク質を特徴付ける道を開きました。

この方法は、組換えタンパク質の調製、結晶化スクリーニング、および酵素動態の一般的な考え方についての洞察を提供しますが、私たちが関心のある他のタンパク質の生物物理学的化学分析にも適用できます。タンパク質は非常に不安定な場合があるため、タンパク質を扱うときは注意が必要です。サンプルを氷の上に置いたままにしたり、80度で冷蔵して長期保存したりするなどの注意点が望まれます。

このビデオを見た後、X線結晶構造解析による構造決定のためのタンパク質結晶を得るために、非病原性細菌から組換えタンパク質を調製する方法と、比色法を使用して酵素活性を特徴付ける方法についてよく理解できるはずです。