神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

本記事の目的は、神経成長因子を封入した高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子の調製および特性評価方法を紹介することです。通常の高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子の調製には、簡便なホモジナイゼーションを用いました。この手順はシンプルであり、スケールアップが可能です。

さらに、ナノ粒子によって封入効率が大幅に向上し、ナノ粒子内でのNGFおよびAPOA1の保持も改善されました。未封入のNGFとNGFナノ粒子の分離、信頼性の高いin vitro半径測定試験の実施、およびNGFナノ粒子のバイオアベイラビリティの確認など、ナノ粒子の特性評価におけるさまざまな課題を克服しました。まず、1.5 mLマイクロセントリフュージチューブ内で10 µLのNGFと10 µLのプロタミンUSPを混合し、室温で10分間静置して複合体を形成させます。

次に、59 µLのホスファチジルコリンと11 µLのスフィンゴミエリンをガラスバイアルに加えます。さらに、4 µLのホスファチジルセリン、15 µLのコレステロールオレイン酸、および45 µLのコハク酸トコフェリルポリエチレングリコールを加えます。混合し、緩やかな窒素気流下で約5分間エタノールを蒸発させます。

すべての賦形剤がガラスバイアルの底に油状の薄膜を形成している必要があります。バイアルに1 mLの超純水を加え、室温で9,500 rpmで5分間ホモジナイズして、プロトタイプナノ粒子（NPs）を形成させます。その後、準備した複合体をプロトタイプNPsに加えます。

ガラスバイアルに小型攪拌バーを用い、懸濁液を37 °Cで30分間攪拌しながらインキュベートします。室温でさらに30分間攪拌し、NPを冷却します。冷却後、106 µLのアポリポタンパク質A-1を添加し、室温で一晩攪拌して、最終的なNGF HDL模倣NPを形成させます。

製造元の指示に従い、粒子解析装置を用いて粒子径およびゼータ電位を測定します。未充填のNGFをNGF HDL模倣ナノ粒子から分離し、NGFの封入効率を決定するために、架橋ゲルろ過クロマトグラフィーカラムを使用します。カラムの調製のため、15 millilitersのsepharose 4B CL懸濁液を50 milliliterのビーカーに移します。

ビーズ懸濁液を撹拌し、その一部をカラムに注ぎます。カラムを軽く叩いて気泡を取り除きます。溶媒を排出し、ビーズが沈殿するまで数分間待ちます。

残りの懸濁液を続けて加えます。カラムの内壁を洗浄し、ビーズをきれいにします。溶媒の液面が固定相の上端よりわずかに高い位置に来るまで、溶媒を排液します。

次に、20 mLの1Xリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄し、コンディショニングを行います。NGFの封入効率を測定するため、200 µLのNGF HDL模倣NPをカラムにロードし、1X PBSで溶出させます。前述と同様に、1 mLのフラクションを計12回分回収します。

製造元の指示に従って、8本の透析チューブを前処理します。50 mL遠心チューブに30 mLの放出培地を加えます。次に、シェーカーを用いて135 rpmの振盪速度で37 °Cまで加温します。

透析チューブを閉じ、放出溶媒の中に入れます。透析チューブの外側から放出溶媒を100 µL迅速に採取し、これを時間0のサンプルとします。採取したサンプルは、後の分析のため、直ちに-20 °Cで保存してください。

採取したサンプルの代わりに、100 µLの新鮮な放出培地を遠心チューブに加えます。その後、タイマーを開始します。1、2、4、6、8、24、48、および72時間後に、放出培地を100 µL採取し、それを100 µLの新鮮な培地で補充します。

採取したサンプルを直ちに-20°Cで保存し、後の解析に備えます。3分間のホモジナイズ後、プロトタイプナノ粒子の粒子径が均一となりました。最終的なNGFナノ粒子は、粒子径170 nmで、狭い単分散の粒度分布を示しました。

未負荷のNGFとナノ粒子は、ゲルろ過カラムによって完全に分離されました。ナノ粒子は分画2から4に溶出されました。ELISA測定により、遊離NGFは分画7から分画10に溶出されたことが示されました。

NGFの算出された封入効率は約66%でした。ここでNGFナノ粒子のin vitro放出を示します。放出媒体にPBSとBSAを添加することで、遊離NGFは85%以上の回収率で透析膜を通過しました。対照的に、NGFナノ粒子は緩やかな放出プロファイルを示し、72時間で約10%のNGFがナノ粒子から放出されました。NGFナノ粒子は、遊離NGFと同程度にPC12細胞の神経突起伸長を刺激しました。

50 ng/mLの投与量において、両群ともに顕微鏡下で神経突起の伸展が明確に観察されました。NGFナノ粒子は、マウスの肝臓、腎臓、および脾臓におけるNGFの血漿中濃度を大幅に増加させ、取り込みを減少させました。HDL模倣ナノ粒子がNGFを補助し、in vivoにおける安定性の長期的な半減期を可能にしました。

適切に実施すれば、均質化法を用いることで、単分散ナノ粒子を3分で調製することが可能です。この手順を行う際は、緩やかな窒素気流を用いて溶媒を蒸発させ、均質化後に容器の壁面に脂質の残留物が付着していないことを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、均質化法を用いたHDL模倣ナノ粒子の作製方法および、NGF封入ナノ粒子の特性評価方法について十分に理解できるはずです。