Name: 定量的質量分析のための脂肪滴の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ脂肪滴の分離法を用いた定量的質量分析で、HCVなどの病原体複製における脂質滴の役割を解明する方法です。6〜7時間で完了し、ケラチン汚染を防ぎながら正確なタンパク質解析が可能です。

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私たちは、JC1のためのR. Bartenschlager（ハイデルベルク大学）構築、のHuh7.5細胞用のCMライス（ロックフェラー大学）、J・マクローチラン（医学研究評議会ウイルス学ユニット）JFH1のための構築、T.脇田の（国立研究所に感謝しますHCVccレポーター構築物のための感染症、JFH1日本）、及びB・ウェブスターおよびワック・グリーン（ウイルス学および免疫学のグラッドストーン研究所）。この作業はDFG（HE 6889 / 2-1（EH）、INST 337 / 15-1 2013およびINST 337 / 16-1 2013（HS））からの資金によって支援されました。ハインリック・ペット研究所、実験ウイルス学のためのライプニッツ研究所は無料とハンブルクのハンザ同盟都市と健康の連邦省によってサポートされています。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていました。

細胞培養物中のアミノ酸と安定同位体標識（SILAC）のためのメディアの調製注記：ここでは、SILACのタンパク質定量キット- 13 C 6 L-アルギニン塩酸をSILAC標識のために使用した50mgのを補充したDMEM。透析ウシ胎児血清（FCS）をSILACタンパク質定量キットを備えています。 <ol><li> DMEM培地の各ボトルから50ミリリットルを除去し、透析FCSを50mLを加えます。 </li><li> 13 C 6 L-リジン二塩酸及び13 C 6 L-アルギニン塩酸培地1mL中の50mgの50mgを溶解します。完全に混合し、DMEM + FCS培地にアミノ酸を追加します。 </li><li> 1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および1×L-グルタミン代替を追加します。 0.45μmのフィルターを用いて培地を滅菌フィルター。 「重い」SILAC媒体としてのボトルにラベルを付けます。 </li><li> L-アルギニン塩酸50mgのとL-リジン二塩酸50mgを用いて1.3 - 「光」培地を調製するために、繰り返し1.1ステップ。 」などのボトルにラベルを付けます光」SILAC媒体。 </li></ol> 2. SILAC標識およびアミノ酸取り込みコントロール<ol><li>トリプシン処理細胞（1×トリプシン-EDTA）および「重」SILAC培地及び「光」を有するものでよく、培地2mlを含む6ウェル培養プレートの2つのウェルにいずれかを1×10 5のHuh7.5細胞を分割SILAC媒体。 </li><li>培養少なくとも6継代のために細胞（スプリット比：1：6）。 6回の継代後、「重い」は、アミノ酸の取り込みは95％以上であるべきです。 </li><li>収穫「重い」の1×10 6個の細胞-及び「光」標識細胞集団は、取り込み効率を分析します。 1×PBSで細胞を洗浄し、160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li> MS-バッファー（150mMのNaCl、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した50mMトリス-HCl pH7.4、および1mM EDTA）の150μLに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間細胞をインキュベートします。溶解C4℃で超音波処理することによりells。 注：以下は、ここで使用する超音波処理の設定です：タイマー、ホールド。出力制御、8。デューティ・サイクル80％; 2×30パルス。 </li><li> 11,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。上清を新しいチューブに移し、洗剤互換タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。 </li><li> 95℃で沸騰し、6×試料緩衝液（375 mMトリス - 塩酸、pH6.8の25.8％グリセロール、123 mg / mlとSDS、600 / mlのブロモフェノールブルー、60μL/ mLのβメルカプトエタノール）を用いてタンパク質の75μgのを混ぜますC 5分間、約1時間バッファ180 Vで（3.02グラム/ Lトリス塩基、18.8グラム/ Lグリシン、および1g / L SDS）を実行し、または製造業者によればSDSでSDS-PAGEによってタンパク質を分離指示。 </li><li>コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。各レーンから同じタンパク質バンドを切り出します。トリプシンでタンパク質を消化し、MS analysiで取り込み効果を分析S、22記載の方法。 </li></ol> SILAC標識のHuh7.5細胞の3脂質液滴分離<ol><li> 21記載されているように、37°Cで4時間ウイルスストック（ 例えば、JC1 NS5AB-mKO2-BSD、MOI 1）でインキュベートすることによって（ すなわち 、「光」は、アミノ酸で標識されたもの）HCVレポーターウイルスでの細胞の集団を感染。 注：JC1 NS5AB-mKO2-BSDは 21先に説明し、重複NS5A-NS5B切断部位との間のブラストサイジン耐性遺伝子（BSD）、続いて感染率を監視するための蛍光レポーター（モノマーKusabiraオレンジ2、mKO2）を担持するHCVウイルスです、 23。 HCVとの仕事はBSL2 +（USA）またはS3 **（ドイツ）バイオセーフティーレベルの封じ込めと実践が必要です。代わりにHCVの感染、細胞が異なる病原体に感染させることができます。 </li><li> HCVに感染した「光」細胞と非感染＆＃を展開34;重い」は、細胞培養物の継代時に、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）でアリコートを修正し21記載の蛍光マーカータンパク質（ 例えば、mKO2）のフローサイトメトリーによってHCV感染率を決定し、。 JC1 NS5AB-mKO2-BSDの HCV株を使用する場合、HCV陽性細胞を選択するために、「光」の媒体には10μg/ mLのブラストサイジンSを追加します。感染率は、NOTE脂肪滴の分離のための90％よりも高くなければなりません。 </li><li> 1 D脂質滴分離に先立って、PBS、トリプシン処理で細胞を洗浄し、「軽い」および「重い」培地中で再懸濁し、そしてノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を数えます。シード150cm 2の細胞培養皿中の各集団の7×10 6個の細胞。 「光」と「重い」細胞集団あたり少なくとも5つの料理を準備します。培地/皿O / Nの30ml中の細胞。 </li><li>培地を除去し、1×PBSで細胞を洗浄。 1Xで細胞を剥離細胞スクレーパーを用いてPBS。 </li><li>ノイバウアーカウントチャンバーを使用して、両方の細胞集団をカウントし、50mLの遠心分離管に等しい細胞数をプールします。 160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li> PBSを除去し、スクロース緩衝液（0.25Mのスクロース、1mMのEDTA、および1mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した）1mLに細胞ペレットを再懸濁します。タイトフィットダウンスホモジナイザーに細胞懸濁液を移し、氷上で200ストロークで細胞を溶解。 注：トリパンブルー染色を使用して、完全な細胞溶解を確認してください。 </li><li> 1.5mLの微量遠心管に溶解物を移す1,000×gで、4℃で10分間、核および細胞破片をスピンダウン。 </li><li>遠心分離後、入力制御として-20℃でポスト核フラクションの25μL（PNS）のアリコートを格納します。 </li><li> 4mLのTOT;脂質滴の洗浄緩衝液（〜3 mLの遠心チューブ（11×60 mm）での底およびオーバーレイにPNS画分の残りを置きAL）（50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）、100mMの塩化カリウム、1mMのEDTA、および1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド）。 </li><li> 10万XGと4℃で2時間遠心します。 （ - 脂肪滴の量に応じて500μL、約250）管の上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収。遠心チューブ（11×60 mm）の中の脂質滴画分を置き、脂肪滴の洗浄緩衝液（〜3.5 mLを、4mLの合計）とのオーバーレイ、および遠心分離工程を繰り返します。 </li><li>チューブの上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収し、新しい1.5mLの微量遠心管に脂肪滴を転送します。 21,000×gで、4℃で20分間の脂肪滴の洗浄バッファーとスピンの500μLを追加します。 注：脂肪滴は、バッファの先頭に浮かぶ白いバンドとして表示されます。 </li><li>ゲルローディングピペットチップを使用して、下にある洗浄緩衝液を除去し、この洗浄工程を3回繰り返します。 </li><li>ゲルローディングピペットチップを使用して洗浄緩衝液の最終除去した後、NP-40溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH7.4、150mMのNaCl、1％NP-40の10μLと脂肪滴画分の5μLを混合、）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。タンパク質の少なくとも35μgのは、MS分析のために必要とされています。 </li><li> -20℃で脂肪滴の画分を保管してください。 </li><li> 4×ローディング色素と脂質滴画分の対応するボリュームを混ぜます。感染性物質を扱う場合には、ウイルスを不活性化するために氷上で1時間インキュベートします。 95℃で5分間沸騰させます。 </li><li>メーカーのプロトコルに従って、SDS-PAGEを使用してタンパク質を分離。コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。ゲルからのすべてのタンパク質バンドを切り出します。トリプシン後のゲル内消化24 &lt;/ SUP&gt;、サンプルを蒸発させ、0.1％ギ酸でそれらを溶解します。 LC-MS / MSによって分析します。 注：ここで、LC-MS / MS分析四重極飛行時間型質量分析計（Q-TOF）または線形トラップ四重極（LTQ）オービトラップ質量分析計で行いました。両方の機器は、ナノUPLCシステムへESIソースに結合されました。データ分析およびLC-MS / MSは、21、22に記載のように行ったQ-TOF上及びオービトラップ質量分析計で分析します。人間のケラチンでサンプルを汚染しないように細心の注意を払います。常にケラチンフリーピペットチップやチューブを使用しています。ケラチンのない化学物質と層流フードの下でバッファを準備します。使用方法の前に、蒸留水とエタノールとのすべての表面とデバイスを清掃してください。常に手袋と白衣を着用してください。 </li></ol>脂質液滴純度の4分析<ol><li>脂肪滴画分1のアリコートを希釈：2と入力画分をNP-40のLysで1:10（ステップ3.9参照）バッファです。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。 </li><li> 6×サンプルバッファーでタンパク質の等量を混合し、感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。 SDS-PAGEを続行し、90分間80 Vでタンクブロッティングによってニトロセルロース膜にタンパク質を移します。 注：（TBS-T（10mMのトリス-HCl pH7.6の、150mMのNaCl、および0.05％のTween20）中の5％脱脂粉乳粉末）をブロッキング緩衝液中で膜をブロッキングした後、脂肪滴のマーカーに対する抗体と共にインキュベートする（ 例えば、PLIN1、PLIN2、又はPLIN3）および二次HRP結合抗体によって、続いて他の細胞内区画（ 例えば、CALR、のMnSOD、またはチューブリン）のマーカー。タンパク質の検出のための化学発光を使用してください。 </li></ol>

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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

ここで、我々は、ウイルス感染のような多様な培養条件下で脂質滴、に関連するタンパク質の濃縮および枯渇を比較するために、定量的脂質滴プロテオーム解析のための脂質滴を分離するためのプロトコルを記述しています。別の方法として、プロテオーム解析は、全ピーク強度に基づくラベルフリー定量化を行うことができます。この方法には、ダイナミックレンジの制限がなく、代謝の問題を回避します。 SILACアプローチの利点は、サンプルが前脂肪滴の分離をプールすることであり、したがって、結果は、サンプル調製、消化、およびLC-MS / MS分析における誤差とは無関係です。私たちは、定量性の高い脂肪滴のプロテオーム解析のためにこの方法をお勧めします。 脂質の濃縮または枯渇としてMS分析で観察された液滴関連タンパク質は、quantitativによる発現レベルの分析を、タンパク質発現の誘導または抑制を反映することができ電子RT-PCRおよび（好ましくは）ウェスタンブロッティングをお勧めします。さらに、2つの方法は、脂質滴中の特定のタンパク質の濃縮または枯渇を確認するために使用することができる：BODIPYまたはLD54...

<html>脂肪滴は、埋め込まれたタンパク質1、リン脂質の単層によって囲まれた中性脂質（トリグリセリド（TG）とコレステロールエステル（CE））のコアからなる細胞小器官高度に動的な細胞質（および核）です。すべての細胞型は、脂肪滴を生成し、彼らはサイズ、脂質組成、およびタンパク質の装飾が異なります。脂質滴はエネルギーおよび膜前駆体リザーバとして、またはタンパク質沈着物として含む、多様な機能を果たします。また、脂質の摂取を介して、それらは脂肪毒性から細胞を保護し、放出脂質シグナル伝達分子として、およびタンパク質分解および小胞体に関与している（ER）ストレス応答2。そのため、タンパク質のホストは、脂肪滴に結合し、他の細胞小器官で自分の世代、劣化、人身売買、との相互作用を支配します。このうち（PLIN1-5） 善意の脂肪滴結合タンパク質のファミリーであるペリリピンF &quot;&gt; 3。 脂肪滴の生合成は、おそらくER常駐酵素は、中性脂質のレンズ、最近酵母4にうまく視覚化されたプロセスを形成し、膜二重層内に蓄積中性脂質の合成を触媒するERで開始します。曲げ膜と上昇ホスファチジン酸およびジアシルグリセロールレベルは、その後、脂肪滴生成5のために必要とされるコア中性脂質および遮蔽リン脂質の同時合成として、リン脂質生合成に関与するタンパク質を誘引すると考えられています。 ERに存在する膜貫通ドメインを保有する酵素は、このプロセスを触媒します。大きな脂肪滴への拡張は、両親媒性ヘリックスを抱い脂質合成酵素の異なるクラスの活動を必要とし、これ脂肪滴にERから移動することができます。脂質小滴からの脂質の動員はtriglyceridの局所活性化を介して起こりますEおよびジアシルグリセロールリパーゼは、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL）及びホルモン感受性リパーゼ（HSL）、またはそのようなマクロやmicrolipophagy又は異なるオートファジー経路では、オートファジー6を媒介シャペロン。脂肪滴は、（β酸化および脂質合成のための）、ミトコンドリアおよびERのような他の細胞小器官、（脂質合成及びタンパク質輸送のため）だけでなく、リソソーム、エンドソーム、および細胞内細菌7によって誘導された小胞と相互作用します。確かに細菌、ウイルス、およびさえ寄生虫は複製と持続性のための脂肪滴、それらの間のHCV 8をターゲットにしています。 HCV感染は、毎年9あたり0.5程度万人が死亡を占め、世界的に肝臓に関連する罹患率および死亡率の主要な原因の1つです。 HCV感染の真の数は不明であるが、最近の推定値は130することを示唆している - 1.5億人が慢性的に感染しています。ませんvaccineが存在するが、最近承認された直動抗ウイルス薬は劇的標準のインターフェロンベースの治療に比べて治療応答を高めます。しかし、世界的に、患者の治療は可能性が高いため、新しい治療法の非常に高いコストに制限されます。慢性的にHCVに感染したすべての個人の約半数は、脂肪肝疾患（脂肪症）、肝細胞における脂肪滴の過剰な​​蓄積によって特徴付けられる状態を開発します。興味深いことに、脂肪滴も推定されるウイルスアセンブリサイト10、11として、HCV複製のためなどの重要な細胞小器官を浮上しました。 HCV感染細胞では、ウイルスタンパク質のコアおよびNS5Aはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1（DGAT1）の阻害剤として、トリグリセリドの生合成に依存するプロセスにおける脂肪滴に局在する脂肪滴と後続のHCV粒子の産生12へ輸送を損ないます</sup&gt;、13、14、15。また、コアまたはNS5Aのいずれかの脂質小滴結合ドメインにおける変異は、HCVアセンブリ16,17を抑制する。コアおよびNS5Aは次に密接脂質滴16に関連付けられた膜に、他の全てのウイルスタンパク質、ならびにウイルスRNA複製複合体を動員します。すべてのウイルスタンパク質の協調行動は、感染性ウイルスの子孫10、11の成功の生産のために必要とされます。構造タンパク質はウイルス粒子の一部であり、そして非構造タンパク質は、このプロセスに必要なタンパク質 - タンパク質相互作用を促進します。興味深いことに、 真正脂肪滴結合タンパク質PLIN3 / TIP47は、HCV RNA複製およびビリオン18の放出の両方のために必要とされる、19 <suP&gt;、20。これらの最近の進歩にもかかわらず、特にHCV複製の後期段階中のウイルス - 宿主相互作用のメカニズムの詳細については、不明確なままであり、脂肪滴の正確な機能は不明です。 ここで、我々は、関連するタンパク質の定量的質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。この方法を使用して、我々は、HCV感染の間の脂肪滴のプロテオームにおける大きな変化を発見し、脂肪滴で分画さを共同で効率的なHCVの成熟21のために必要とされる宿主タンパク質としてアネキシンA3を特定しました。

<table><tbody><tr><td>SILACタンパク質定量キット - DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>89983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>13C6 L-アルギニン-HCl 50&nbsp;mg</td><td>サーモフィッシャー</td><td>88210</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1</td><td>Roth GmbH</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Blue 5x Concentrate</td><td>Roth GmbH</td><td>A152.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS-トリス-グリシン - Buffer</td><td>Geyer Th. GmbH &株式会社KG&nbsp;</td><td>A1415,0250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Life Technologies GmbH&nbsp;</td><td>350500038&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P4333-100ml&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>D8537&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>T3924-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1149,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultrapure&nbsp;&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1086,5000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1103,0250</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P8340-5ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-スクロース BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3935,1000</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl) 37% 純度 Ph. Eur., NF</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0625</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&nbsp;</td><td>〒500-0116&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>AppliChem GmbH</td><td>151339</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1112</td><td></td></tr>ブロ<tr><td>モフェノール</td><td>ブルーAppliChem GmbH</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4338</td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td>Invivogen</td><td>アリBL-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1039</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0999リン酸</td><td></td></tr><tr><td>カリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>221309</tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P3786&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem</td><td>A1694</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪粉粉粉</td>乳 <td>AppliChem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>抗ADFP/ADRP&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab52355</td><td></td></tr><tr><td>M6PRB1/TIP47 100 & マイクロ;g</td><td>abcam</td><td>ab47639</td><td></td></tr><tr><td>カルレティキュリン、pAb 200 &micro;g</td><td>Enzo Life Science GmbH&nbsp;</td><td>ADI-SPA-600-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗β;-チューブリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ・ケミー社&nbsp;</td><td>T6074 200&micro;l &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアブソリュート(EtOH)</td><td>Geyer Th. GmbH &株式会社KG&nbsp;</td><td>A3678,0250 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MnSOD</td><td>Enzo Life Science GmbH&nbsp;</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス HRP</td><td>サーモフィッシャー ピアス</td><td>32430</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ HRP</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;Pierce</td><td>32460</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906836</td><td></td></tr><tr><td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>12015196001</tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>655 180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>テルモ シリンジ 1 mL</td><td>テルモ</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>フィルトロプール BT 50、500 mL、0.45 &micro;m&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>83.1823.100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX プレキャストゲル、Any kD 分離ゲル</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&nbsp;</td><td>〒456-9034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>料理ナンクロン150/20&nbsp;</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社&nbsp;</td><td>10098720 - 168381&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>neoLab Migge GmbH&nbsp;</td><td>C-8120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、50 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>227261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SafeSealチューブRNaseフリー&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>72,706,400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超透明遠心分離管 11 x 60 mm</td><td>Beckman Coulter GmbH&nbsp;</td><td>344062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>吸引針</td><td>トランスコデント</td><td>6482</td><td></td></tr><tr><td>バイオスフィアフィル。ヒント1000&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>70.762.211&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>バイオスフィアフィル。Tip 200</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>70.760.211&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>バイオスフィアフィル。ヒント10</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>70.1130.210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダウンスティッシュグラインダーFisher</td><td>Scientific GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11883722 全ガラス製ティッシュグラインダー用乳棒</td><td>Fisher Scientific GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>10389444</tr><tr><td>Orbitrap Fusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort、Thermoblock 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5355&nbsp;000.127</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell、Mini Trans-Blot Module、PowerPac Basic Power Supply、&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>165-8033</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン 3 マルチキャスティングチャンバー</td><td>BioRad</td><td>165-4110</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 電源</td><td>Biorad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424</td><td></td></tr>オプ<tr><td>ティマL-90K</td><td>ベックマンコールターGmbH&nbsp;</td><td>365670</td><td></td></tr><tr><td>SW 60 Ti</td>ローターベ<td>ックマンコールターGmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>335649</tr><tr><td>Infinite M1000 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> (英語)

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

脂肪滴は、ビリオンの形態形成の推定場所として、さまざまな病原体の様々な、最も顕著にC型肝炎ウイルス（HCV）の複製に不可欠です。定量的脂肪滴のプロテオーム解析は、にローカライズや、ウイルス感染などの条件の下での脂肪滴からずれているタンパク質を同定するために使用することができます。ここでは、我々が正常にHCV感染後脂肪滴プロテオームの変化を特徴づけるために使用されているプロトコルを記述します。私たちは、細胞培養（SILAC）中のアミノ酸と安定同位体標識化を使用するので、質量分析により、タンパク質を定量するために「重い」アミノ酸と細胞の1人の人口の完全なプロテオームにラベルを付けます。脂肪滴の単離のために、2つの細胞集団（ すなわち、HCVに感染/「光」は、アミノ酸及び非感染コントロール/「重」アミノ酸）1に混合される：1と低張性緩衝液中で機械的に溶解しました。核とセルDを除去した後低速遠心分離によってebrisは、脂肪滴関連タンパク質は、等張緩衝液で3回の洗浄工程に続いて二つの連続超遠心分離工程により濃縮されます。脂肪滴画分の純度は、異なる細胞内コンパートメントを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析されます。脂肪滴関連タンパク質は、次いでクマシー染色に続いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離されています。トリプシン消化後、ペプチドを、液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化 - タンデム質量分析（LC-ESI-MS / MS）により定量化されます。この方法を使用して、我々はプロまたは抗ウイルスの宿主因子を表すことができ、HCV感染の際に脂肪滴に動員するタンパク質を同定しました。私たちの方法は、このような病原体による感染症、環境ストレス、または薬物治療として、異なる細胞および培養条件の多様に適用することができます。

脂肪滴は、ビリオンアセンブリの推定上のサイトとして、HCV感染に不可欠であるが、ビリオンの形態形成および出口の分子メカニズムは不明な点が多いです。そのプロセスに関与する新規ホスト依存因子を同定するために、我々は、HCV感染細胞21（ 図1A）の定量的な脂質滴プロテオーム解析を行いました。我々は、脂質滴を精製するためのプロトコルを確立し、日常的に脂肪滴結合タンパク質PLIN2 / ADRPとPLIN3 / TIP47そのような微小管のためのβチューブリンなどの他の細胞区画のマーカーの枯渇の強い濃縮を検出し、ミトコンドリアのためのMnSODまたはER（ 図1B、C）のためのカルレティキュリン/カルネキシン。我々は確実のHuh7.5細胞（ 図1D）で脂質滴とcofractionateと、同位体標識を用いて、タンパク質、具体的に補充され同定されたタンパク質のリストをコンパイルまたはHCV感染細胞（ 図1E）</str...

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

定量質量分析のために脂質滴を単離する総合的な目的は、例えばC型肝炎ウイルスなどの病原体の複製におけるこれらのオルガネラの機能を理解することにあります。この手法を用いることで、病原体がなぜ複製のために脂質滴に結合するのかという、感染症分野における重要な問いに答えることができます。脂質滴の単離は6〜7時間で完了します。この手順の間、ケラチンの混入を避けることが重要です。まず、DMEM培地の各ボトルから50 millilitersを取り除き、50 millilitersの透析済みウシ胎児血清を加えます。次に、1 milliliterの培地に、13C標識リシン50 milligramsと13C標識アルギニン50 milligramsを溶解させます。十分に混ぜ合わせ、DMEMにFCSを添加した培地にアミノ酸を加えます。次に、PenStrepとグルタミン代替品を添加します。0.45 micronフィルターを用いて培地を滅菌ろ過し、ボトルにheavy SILAC培地とラベルを貼ります。ライト培地を調製するには、アルギニン 50 milligrams とリシン 50 milligrams を用いて、これらの手順を繰り返します。ボトルに「ライト SILAC 培地」とラベルを貼ります。細胞をトリプシン処理し、6ウェル培養プレートの2つのウェルに分注します。一方のウェルに2 mLの重SILAC培地を、もう一方に2 mLの軽SILAC培地を分注します。細胞を少なくとも6代まで継代します。6代後には、重アミノ酸の取り込み率が95%以上に達しているはずです。取り込み効率を分析するため、重標識および軽標識の細胞集団からそれぞれ100万個の細胞を回収します。1X PBSで細胞を洗浄した後、160 ×g、4 °Cで5分間遠心分離してペレット化します。細胞ペレットを150 µLのMS-bufferに再懸濁します。次に、細胞を氷上で30分間インキュベートします。次に、4 °Cで超音波処理を行い、細胞を溶解させます。11,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。上清を新しいチューブに移し、界面活性剤耐性のあるタンパク質定量アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。次に、75 µgのタンパク質を6×サンプルバッファーと混合します。95 °Cで5分間加熱後、SDSランニングバッファーを用い、180 Vで約1時間、SDS-PAGEによりタンパク質を分離します。クマシー染色後、目的のタンパク質バンドを切り出し、MS分析により導入効率を解析します。ライト細胞集団を、C型肝炎レポーターウイルスを含む線維質ストックとともに37°Cで4時間インキュベートし、感染させます。HCV感染ライト細胞および非感染ヘビー細胞を、テキストプロトコルに従って増殖させます。ブラストシジン耐性遺伝子を持つHCV株を使用する場合は、ライト培地に10 µg/mLのブラストシジンSを添加し、HCV陽性細胞を選択します。脂質滴の分離の1日前、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理を行い、対応するライトまたはヘビー培地に再懸濁します。ノイバウエル血球計数器を用いて細胞数をカウントします。その後、各集団の細胞700万個を150平方センチメートルの細胞培養ディッシュに播種します。軽細胞および重細胞の各集団につき、少なくとも5枚のディッシュを用意します。1枚あたり30 millilitersの培地を用いて、細胞を一晩培養します。翌日、培地を除去し、1X PBSで細胞を洗浄します。セルスクレーパーを用いて、1X PBS中で細胞を剥離させます。前述と同様に両方の細胞集団をカウントした後、等数の細胞を50 milliliter遠心チューブに回収します。160 times g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。PBSを除去し、セルペレットを1 mLのスクロース緩衝液に再懸濁します。細胞懸濁液を密閉型のOunceホモジナイザーに移し、氷上で200回ストロークして細胞を溶解します。次に、溶解物を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、1,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して、核および細胞残渣を沈殿させます。遠心分離後、ポスト核画分（PNS）の25 µLを分注し、インプットコントロールとして-20 °Cで保存します。残りのPNS画分を遠心管の底に留め、約3 mLの脂質滴洗浄バッファーを上層に加えます。100,000 ×g、4 °Cで2時間、遠心分離を行います。遠心分離後、曲がった鈍端カニューレを用いて、チューブ上部の浮遊脂質滴画分を回収します。次に、脂質滴画分を遠心管に入れ、脂質滴洗浄バッファーを上層に加え、遠心分離ステップを繰り返します。グラジエントの上部から脂質滴を回収するには経験が必要です。また、分画が大きいほど容易になります。練習には脂肪細胞を使用することができます。あるいは、細胞にオレアートを添加して、脂質滴の量を増やすことも可能です。再度、曲がった鈍端カニューレを用いて、チューブ上部の浮遊脂質滴画分を回収します。回収した脂質滴を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、500 microlitersの脂質滴洗浄バッファーを加えます。その後、サンプルを21,000 times g、4 degrees Celsiusで20分間遠心分離します。ゲルロード用ピペットチップを用いて下層の洗浄バッファーを除去し、洗浄ステップを3回繰り返します。最後に洗浄バッファーを除去した後、タンパク質含有量を測定するため、5 µLの脂質滴画分を10 µLのNP 40溶解バッファーと混合します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるためにサンプルを氷上で1時間インキュベートしてください。この時点で、脂質滴画分を-20 °Cで保存できます。次に、少なくとも35 µgのタンパク質に相当する量と4xローディングダイを混合します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるため、混合物を氷上で1時間インキュベートしてください。サンプルを95 °Cで5分間沸騰させる。その後、テキストプロトコルに記載されている通り、SDS-PAGEおよびクマシー染色を行い、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）用のサンプルを調製する。脂質滴の純度を分析するために、脂質滴分画の分注量をNP 40溶解バッファーで1〜2倍に希釈する。入力コントロール分画を、同一のバッファーを用いて10倍に希釈します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるため、サンプルを氷上で1時間インキュベートしてください。次に、界面活性剤耐性のあるタンパク質定量法を用いて、タンパク質レベルを測定します。次に、同量のタンパク質を6xサンプルバッファーと混合し、感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるためサンプルを氷上で1時間インキュベートします。最後に、SDS-PAGEを行い、タンクブロッティングを用いて80 Vで90分間、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。ここに示しているのは、核後画分および脂質滴画分の代表的なウェスタンブロット分析です。ウェスタンブロットにより、脂質滴画分において脂質滴マーカータンパク質であるperilipin twoおよびperilipin threeが濃縮されており、他の細胞区画のマーカーが枯渇していることが明確に示されています。核除去上清画分および脂質滴画分は、さらにクマシーブルー染色および銀染色で分析することが可能です。このヒートマップは、解析した細胞の脂質滴画分で同定されたタンパク質のペプチド数とタンパク質カバレッジ率を示しています。最終的なヒートマップは、HCV感染によって脂質滴の1日あたりの状態がどのように変化するかを示しています。増加した脂質滴結合タンパク質は赤色で、減少した脂質滴結合タンパク質は青色で示されています。この方法の主な利点は、細胞の分取および脂質滴の単離を行う前に細胞を混合するため、細胞溶解および単離工程で発生し得る誤差を最小限に抑えられることです。

lipid-droplet-isolation-for-quantitative-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI /...

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

このプロトコールは、細胞からの遊離およびエステル化された生理活性脂肪酸の抽出および分析を実証します。脂肪酸は、安定同位体希釈、キラル液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気化学イオン化、多重反応モニタリング質量分析(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)を用いて正確に定量されます。...

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

グラム陰性菌からのリポ多糖（LPS）のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメ​​カニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。...

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。...

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

ここでは、提案する定量化および複数反応モニタリングを用いた各スフィンゴミエリン種を対象に、プロトコルと MS、MS、MS...

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

このプロトコルは、脂質液滴分離と老舗の小胞体分離キットを使用して、マウス肝臓から精製法を確立します。...

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。...

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Shotgun 質量分析ベースのリピドミクスは、さまざまなげっ歯類組織からの 1...

げっ歯類組織のショットガンリピドミクス

本研究では、高速液体クロマトグラフィーと蒸発光散乱検出器(ELSD)を組み合わせた脂質ナノ粒子(LNP)RNAデリバリーシステムにおける4成分の定量分析法を確立します。この方法は、良好な分離、高感度、および高効率を備えています。...

エバポレイト光散乱検出器と組み合わせた液体クロマトグラフィーによる脂質ナノ粒子RNA送達系の4成分の決定

このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。...

バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

学ぶ脂肪滴の分離法を用いた定量的質量分析で、HCVなどの病原体複製における脂質滴の役割を解明する方法です。6〜7時間で完了し、ケラチン汚染を防ぎながら正確なタンパク質解析が可能です。

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

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