定量的質量分析のための脂肪滴の分離

定量質量分析のために脂質滴を単離する総合的な目的は、例えばC型肝炎ウイルスなどの病原体の複製におけるこれらのオルガネラの機能を理解することにあります。この手法を用いることで、病原体がなぜ複製のために脂質滴に結合するのかという、感染症分野における重要な問いに答えることができます。脂質滴の単離は6〜7時間で完了します。

この手順の間、ケラチンの混入を避けることが重要です。まず、DMEM培地の各ボトルから50 millilitersを取り除き、50 millilitersの透析済みウシ胎児血清を加えます。次に、1 milliliterの培地に、13C標識リシン50 milligramsと13C標識アルギニン50 milligramsを溶解させます。

十分に混ぜ合わせ、DMEMにFCSを添加した培地にアミノ酸を加えます。次に、PenStrepとグルタミン代替品を添加します。0.45 micronフィルターを用いて培地を滅菌ろ過し、ボトルにheavy SILAC培地とラベルを貼ります。

ライト培地を調製するには、アルギニン 50 milligrams とリシン 50 milligrams を用いて、これらの手順を繰り返します。ボトルに「ライト SILAC 培地」とラベルを貼ります。細胞をトリプシン処理し、6ウェル培養プレートの2つのウェルに分注します。

一方のウェルに2 mLの重SILAC培地を、もう一方に2 mLの軽SILAC培地を分注します。細胞を少なくとも6代まで継代します。6代後には、重アミノ酸の取り込み率が95%以上に達しているはずです。取り込み効率を分析するため、重標識および軽標識の細胞集団からそれぞれ100万個の細胞を回収します。

1X PBSで細胞を洗浄した後、160 ×g、4 °Cで5分間遠心分離してペレット化します。細胞ペレットを150 µLのMS-bufferに再懸濁します。次に、細胞を氷上で30分間インキュベートします。

次に、4 °Cで超音波処理を行い、細胞を溶解させます。11,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。上清を新しいチューブに移し、界面活性剤耐性のあるタンパク質定量アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。

次に、75 µgのタンパク質を6×サンプルバッファーと混合します。95 °Cで5分間加熱後、SDSランニングバッファーを用い、180 Vで約1時間、SDS-PAGEによりタンパク質を分離します。クマシー染色後、目的のタンパク質バンドを切り出し、MS分析により導入効率を解析します。

ライト細胞集団を、C型肝炎レポーターウイルスを含む線維質ストックとともに37°Cで4時間インキュベートし、感染させます。HCV感染ライト細胞および非感染ヘビー細胞を、テキストプロトコルに従って増殖させます。ブラストシジン耐性遺伝子を持つHCV株を使用する場合は、ライト培地に10 µg/mLのブラストシジンSを添加し、HCV陽性細胞を選択します。

脂質滴の分離の1日前、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理を行い、対応するライトまたはヘビー培地に再懸濁します。ノイバウエル血球計数器を用いて細胞数をカウントします。その後、各集団の細胞700万個を150平方センチメートルの細胞培養ディッシュに播種します。

軽細胞および重細胞の各集団につき、少なくとも5枚のディッシュを用意します。1枚あたり30 millilitersの培地を用いて、細胞を一晩培養します。翌日、培地を除去し、1X PBSで細胞を洗浄します。

セルスクレーパーを用いて、1X PBS中で細胞を剥離させます。前述と同様に両方の細胞集団をカウントした後、等数の細胞を50 milliliter遠心チューブに回収します。160 times g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

PBSを除去し、セルペレットを1 mLのスクロース緩衝液に再懸濁します。細胞懸濁液を密閉型のOunceホモジナイザーに移し、氷上で200回ストロークして細胞を溶解します。次に、溶解物を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、1,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して、核および細胞残渣を沈殿させます。

遠心分離後、ポスト核画分（PNS）の25 µLを分注し、インプットコントロールとして-20 °Cで保存します。残りのPNS画分を遠心管の底に留め、約3 mLの脂質滴洗浄バッファーを上層に加えます。100,000 ×g、4 °Cで2時間、遠心分離を行います。

遠心分離後、曲がった鈍端カニューレを用いて、チューブ上部の浮遊脂質滴画分を回収します。次に、脂質滴画分を遠心管に入れ、脂質滴洗浄バッファーを上層に加え、遠心分離ステップを繰り返します。グラジエントの上部から脂質滴を回収するには経験が必要です。

また、分画が大きいほど容易になります。練習には脂肪細胞を使用することができます。あるいは、細胞にオレアートを添加して、脂質滴の量を増やすことも可能です。

再度、曲がった鈍端カニューレを用いて、チューブ上部の浮遊脂質滴画分を回収します。回収した脂質滴を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、500 microlitersの脂質滴洗浄バッファーを加えます。その後、サンプルを21,000 times g、4 degrees Celsiusで20分間遠心分離します。

ゲルロード用ピペットチップを用いて下層の洗浄バッファーを除去し、洗浄ステップを3回繰り返します。最後に洗浄バッファーを除去した後、タンパク質含有量を測定するため、5 µLの脂質滴画分を10 µLのNP 40溶解バッファーと混合します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるためにサンプルを氷上で1時間インキュベートしてください。

この時点で、脂質滴画分を-20 °Cで保存できます。次に、少なくとも35 µgのタンパク質に相当する量と4xローディングダイを混合します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるため、混合物を氷上で1時間インキュベートしてください。

サンプルを95 °Cで5分間沸騰させる。その後、テキストプロトコルに記載されている通り、SDS-PAGEおよびクマシー染色を行い、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）用のサンプルを調製する。脂質滴の純度を分析するために、脂質滴分画の分注量をNP 40溶解バッファーで1〜2倍に希釈する。

入力コントロール分画を、同一のバッファーを用いて10倍に希釈します。感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるため、サンプルを氷上で1時間インキュベートしてください。次に、界面活性剤耐性のあるタンパク質定量法を用いて、タンパク質レベルを測定します。

次に、同量のタンパク質を6xサンプルバッファーと混合し、感染性物質を扱う場合は、ウイルスを不活化させるためサンプルを氷上で1時間インキュベートします。最後に、SDS-PAGEを行い、タンクブロッティングを用いて80 Vで90分間、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。ここに示しているのは、核後画分および脂質滴画分の代表的なウェスタンブロット分析です。

ウェスタンブロットにより、脂質滴画分において脂質滴マーカータンパク質であるperilipin twoおよびperilipin threeが濃縮されており、他の細胞区画のマーカーが枯渇していることが明確に示されています。核除去上清画分および脂質滴画分は、さらにクマシーブルー染色および銀染色で分析することが可能です。このヒートマップは、解析した細胞の脂質滴画分で同定されたタンパク質のペプチド数とタンパク質カバレッジ率を示しています。

最終的なヒートマップは、HCV感染によって脂質滴の1日あたりの状態がどのように変化するかを示しています。増加した脂質滴結合タンパク質は赤色で、減少した脂質滴結合タンパク質は青色で示されています。この方法の主な利点は、細胞の分取および脂質滴の単離を行う前に細胞を混合するため、細胞溶解および単離工程で発生し得る誤差を最小限に抑えられることです。