ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

この技術の全体的な目的は、CRISPR/Cas9によって誘導された挿入欠失変異クローンをハイスループットにジェノタイピングすることです。この手法は、選択したSAILモデルにおいて特定の遺伝子をノックアウトした際の表現型への影響など、遺伝学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、最小限から高スループットまでのスクリーニングが可能であり、汎用性が高いことです。

この手法はヒトのがん遺伝学に関する知見を提供できるだけでなく、ヒトの幹細胞や初代細胞、あるいは非ヒト由来の細胞などの他の系にも適用可能です。私たちは、ショートタンデムリピート（STR）タイピングアッセイを実施していた際に、初めてこの手法を考案しました。手順を開始するには、蛍光ラベル付きCas9とシングルガイドRNAを共発現させるプラスミドを、選択した細胞にトランスフェクションします。

細胞をトリプシン処理し、蛍光標識されたクローンを約3,500個選択します。これらのクローンを、ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した8 mLの増殖培地を用いて、10 cmディッシュに500個、1,000個、2,000個の分量で播種します。細胞を5% CO2雰囲気下、37 °Cでインキュベートし、単一細胞コロニーが肉眼で確認できるまで5日ごとに培地を交換します。

次に、約5 µLの増殖培地を用いて、個々のコロニーを200 µLピペットで吸引します。各コロニーを、200 µLの増殖培地が入った個別のウェルに分注します。各混合液を繰り返しピペッティングし、細胞を再懸濁させます。

細胞が50～90%のコンフルエンスに達するまで、前述の条件下でインキュベートします。ウェルから過剰な培地を除去し、各ウェルに0.05%トリプシンEDTA（フェノールレッド不含）を25 µL加えます。細胞を37 °Cで7分間インキュベートします。

次に、ピペッティングを繰り返し、トリプシン処理した細胞を再懸濁します。顕微鏡下でウェルを確認し、細胞がウェル壁から剥離していることを確かめます。個々のクローンの複製（レプリケート）を調製するため、各細胞懸濁液を5 µLずつ、空の96ウェル培養プレートに移します。

各ウェルに200 µLの増殖培地を加えます。次に、空の96ウェルPCRプレートの各ウェルに10 µLの溶解バッファーを分注します。各細胞懸濁液からさらに5 µLを、この96ウェルプレートに移します。

プレートを軽く遠心分離し、液体がウェルの底に集まるまで待ちます。各細胞懸濁液の残りの15 µLに、200 µLの増殖培地を加えます。元の懸濁液と複製サンプルは、後にクローンのノックアウト状態を確認するため、培養条件下で保存します。

次に、サーマルサイクリングを用いて溶出バッファー中で細胞を完全に溶解させます。溶解物を短時間遠心分離します。溶解物を40 µLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。

希釈したライセートをボルテックスし、短時間遠心分離します。蛍光PCRを行う前に、溶解させた野生型細胞を用いて、ラベルなしのプライマー数ペアを設計し、その特異性を検証してください。最適なプライマーペアを特定し、フルオロフォア標識フォワードプライマーおよびラベルなしリバースプライマーを入手します。

精製ゲノムDNAを使用した場合とは結果が異なる可能性があるため、ボルテックス処理した細胞を用い、自作の溶解バッファーで溶解させてプライマーの特異性を必ず確認してください。ラベル付けしたプライマーを使用し、希釈した溶解液を3 µL加えて、20 µL系で蛍光PCR反応を行い、標的領域を増幅させます。増幅産物5 µLを1%アガロースゲルで電気泳動し、PCR増幅産物のサイズと相対量を確認してください。

サンプル調製を開始するには、ヌクレアーゼフリー水を用いて、野生型およびCRISPR/Cas9標的DNAのアンプリコンを約2.5 nanograms per microliterの濃度に希釈します。希釈した野生型DNAサンプルと標的DNAサンプルを等量ずつ混合します。96ウェルPCRプレートの各ウェルに、脱イオンホルムアミドと染色済みサイズスタンダードの29:1混合液を9 microliters、および混合したアンプリコンを1 microliterずつ分注します。

プレートをしっかりと密閉し、PCRサーモサイクラーを用いてサンプルを95 °Cで3分間加熱します。加熱後すぐに、プレートを氷上で3分間冷却します。その後、ジェネティックアナライザーを用いてキャピラリーゲル電気泳動を行います。

電気泳動の完了後、データを解析ソフトウェアにインポートしてプロットします。適切な染料チャンネルでデータを確認し、サイズスタンダードの品質を検証してください。その後、非標的野生型コントロールおよび標的クローンの染料チャンネル値をtxt形式でエクスポートします。

このファイルから、ダイの識別子、サンプルファイル名、フラグメントサイズ、およびピーク高さの値を表計算ソフトにインポートします。各サンプルにおいて、標的クローンと非標的の野生型コントロールとの間のフラグメントサイズの差を算出します。3塩基対の倍数ではないインデル変異を持つクローンを特定します。

保存したリプリケートから選択したクローンを連続的に拡大培養します。サンガーシーケンシングおよびウェスタンブロット解析を行い、クローンのジェノタイプを決定し、ノックアウトの状態を確認します。肝細胞癌細胞株HEPG2を対象に、Nap1L1遺伝子に対するCRISPR/Cas9コンストラクトを用いて標的化を行いました。

非標的の野生型アレルおよびCRISPR/Cas9標的アレルを、それぞれ緑色および青色の蛍光色素で標識したプライマーを用いてPCR増幅しました。特異的に最適化した蛍光PCRプロトコルを用いることで、標的クローンの増幅産物を高収量で得ることができました。個々のクローンのサンプルにおいて、緑色および青色の蛍光色素間の干渉は見られませんでした。

キャピラリーゲル電気泳動により決定したフラグメントサイズの解析から、ここに示す2つのクローンにおいて、それぞれ1塩基および10塩基の欠失が認められた。サンガーシーケンシングの結果は、キャピラリーゲル電気泳動の解析結果と一致していた。ウェスタンブロット解析により、選択したクローンがNAP1L1を発現していないことが確認された。

この手順を行う際は、扱うサンプル数が多いため、各サンプルに注意深くラベルを貼ること、また、フルオロフォア標識アンプリコンは光に敏感であるため、光への曝露時間を最小限に抑えることが重要です。本手順の後、定量RT-PCR、ウェスタンブロット解析、サンガーシーケンシングなどの他の手法を行うことで、目的遺伝子が完全にノックアウトされているかなど、さらなる疑問に対する検証が可能です。このビデオを視聴することで、蛍光PCRとキャピラリーゲル電気泳動を組み合わせ、CRISPR/Cas9誘発変異クローンを高スループットにジェノタイピングする方法について十分に理解できるはずです。