ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

この技術の全体的な目標は、CRISPR/Cas9によって誘導される挿入欠失変異クローンをハイスループットで遺伝子型決定することです。この方法は、選択したSAILモデルで特定の遺伝子をノックアウトした場合の表現型効果など、遺伝学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、マルチフレキシブルなミニマルからハイスループットのスクリーニングがあることです。

この方法は、ヒトのがん遺伝学に関する洞察を提供するだけでなく、ヒト、幹細胞、初代細胞、またはヒト以外の起源の細胞など、他のシステムにも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ショートタンデムリピートまたはSTRタイピングアッセイを行ったときでした。手順を開始するには、選択した細胞にプラスミドをトランスフェクションし、蛍光標識cas9と単一ガイドRNAを共発現させます。

細胞をトリプシン化し、約3, 500個の蛍光標識クローンを選択します。クローンを500、1,000、および2,000細胞の一部に分けて、8ミリリットルのペニシリンストレプトマイシン補充増殖培地中の10センチメートル皿に播種します。細胞を摂氏37度の5%CO2雰囲気でインキュベートし、単一細胞コロニーが肉眼で見えるまで5日ごとに培地を交換します。

次に、個々のコロニーを約5マイクロリットルの成長培地を含む200マイクロリットルのピペットに吸引します。各コロニーを200マイクロリットルの成長培地を含む別々のウェルに移します。各混合物を上下に繰り返しピペットで動かし、細胞を再懸濁します。

細胞が50〜90%のコンフルエントに達するまで、前述の条件下で細胞をインキュベートします。ウェルから余分な培地を取り出し、フェノールレッドを含まない25マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAを各ウェルに加えます。細胞を摂氏37度で7分間インキュベートします。

次に、混合物を上下に繰り返しピペットで動かし、トリプシン処理した細胞を再懸濁します。顕微鏡でウェルを検査して、細胞がウェル壁から剥離したことを確認します。個々のクローンの複製を調製するには、各細胞懸濁液の5マイクロリットルを空の96ウェル培養プレートに移します。

各ウェルに200マイクロリットルの成長培地を追加します。次に、空の96ウェルPCRプレートのウェルに10マイクロリットルの溶解バッファーをロードします。各細胞懸濁液をさらに5マイクロリットルこの96ウェルプレートに移します。

液体がウェルの底に沈殿するまで、プレートを短時間遠心分離します。各細胞懸濁液の残りの15マイクロリットルに200マイクロリットルの成長培地を添加する。元の懸濁液と複製物をインキュベーション条件下で保存し、後でクローンのノックアウト状態を確認します。

次に、サーマルサイクリングを使用して、溶解バッファー中の細胞を完全に溶解します。ライセートを短時間遠心分離します。ライセートを40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で希釈します。

希釈した溶解物をボルテックスし、短時間遠心分離します。蛍光PCRを実施する前に、溶解した野生型細胞上の数組の非標識プライマーの特異性を設計し、試験してください。最適なプライマーペアを特定し、蛍光色素で標識されたフォワードプライマーと非標識リバースプライマーを入手してください。

精製されたゲノムDNAを使用した場合と結果が異なる場合があるため、ボルテックス細胞を使用してプライマーの特異性をテストし、自家製の溶解バッファーを使用して溶解してください。標識プライマーを使用して、希釈したライセート3マイクロリットルで20マイクロリットルの蛍光PCR反応を行い、標的領域を増幅します。PCRアンプリコンのサイズと相対量を評価するには、1%アガロースゲル上で5マイクロリットルのアンプリコンを分離します。

サンプル調製を開始するには、ヌクレアーゼフリー水を使用して、野生型およびCRISPR/Cas9標的DNAのアンプリコンをマイクロリットルあたり約2.5ナノグラムの濃度に希釈します。希釈した野生型DNAサンプルと標的DNAサンプルを等量混合します。96ウェルPCRプレートのウェルに、脱イオンホルムアミドと色素標識サイズ標準の29対1の混合物9マイクロリットルと、混合アンプリコン1マイクロリットルをロードします。

プレートをしっかりと密封し、PCRサーモサイクラーでサンプルを摂氏95度で3分間加熱します。加熱後すぐに、プレートを氷の上で3分間冷却します。ジェネティックアナライザーを用いてキャピラリーゲル電気泳動を行います。

電気泳動が完了したら、データを解析ソフトウェアにインポートし、データをプロットします。適切な色素チャネルでデータを確認して、サイズ標準の品質を確認します。次に、ターゲット化されていない野生型コントロールとターゲットクローンの色素チャネル値をtxt形式でエクスポートします。

このファイルから、色素の同定、サンプルファイル名、フラグメントサイズ、ピーク高さの値をスプレッドシートソフトウェアにインポートします。各サンプルのターゲットクローンと非ターゲット野生型コントロールとの間のフラグメントサイズの差を計算します。3塩基対の倍数ではないインデル変異を持つクローンを特定します。

保存した複製から選択したクローンを順次展開します。サンガーシーケンシングとウェスタン血液解析を実施して、クローンの遺伝子型を決定し、クローンのノックアウト状態を確認します。肝細胞がん細胞株HEPG2は、Nap1L1遺伝子に対するCRISPR/Cas9コンストラクトで標的とされました。

unターゲット野生型対立遺伝子とCRISPR/Cas9ターゲット対立遺伝子は、それぞれ緑色と青色の蛍光色素で標識されたプライマーを使用してPCR増幅されました。特別に最適化された蛍光PCRプロトコルを使用することにより、標的クローンのアンプリコンを良好な収率で取得しました。個々のクローンのサンプル内の緑色と青色の蛍光色素の間に干渉は観察されませんでした。

キャピラリーゲル電気泳動から決定されたフラグメントサイズの分析により、ここに示されている2つのクローンから1塩基対と10塩基対が欠失していることが明らかになりました。サンガーシーケンシングの結果は、キャピラリーゲル電気泳動解析と一致していました。ウェスタン血液分析により、選択したクローンはNAP1L1を発現していないことが確認されました。

この手順を試行する際は、多くのサンプルが関係しているため、サンプルを慎重にラベル付けすることを忘れず、また、蛍光色素標識アンプリコンは光感受性であるため、曝露時間を最小限に抑えることが重要です。この手順に続いて、定量的RT PCR、ウェスタン血液分析、サンガーシーケンシングなどの他の方法を実行して、目的の遺伝子が何であるかなどの追加の質問に答えることができますが、完全にノックアウトされます。このビデオを見れば、蛍光PCRとキャピラリーゲル電気泳動を組み合わせて、CRISPR/Cas9誘導変異クローンをハイスループットで遺伝子型決定する方法を十分に理解できるはずです。