Name: ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いたCRISPR/Cas9ノックアウト変異体の遺伝子型判定法。高スループットスクリーニングでヒトや幹細胞など多様な細胞系に適用可能で、がん遺伝学研究における遺伝子機能解析に有用です。

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著者は、キャピラリーゲル電気泳動実験を助けるため女史タン市ミンさん、ヘレン・オング、博士ザオ・イ感謝したいと思います。この作業は、/ 2011分の1314 NMRCとMOE ACRFティア2基金助成金MOE2011-T2-1-051を付与NMRC / IRGによってサポートされていました。

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

選択のモデル細胞株に特異的な遺伝子のノックアウト遺伝子が特定の細胞のコンテキストで果たす役割を解明するためのルーチンとなっています。実際には、いくつかのゲノムワイドスクリーンはゲノム14、15、16に実質的に全ての公知のヒト遺伝子を標的とするためにCRISPR / Cas9システムを使用する現在利用可能です。これらの大規模スクリーン（又は関心のある個々の遺伝子の標的も小規模）を用いて、設計と同じ遺伝子の異なる遺伝子座を標的sgRNAsを利用することが重要です。使用異なるsgRNAs間で一貫性のある結果が明確遺伝子の枯渇の真の効果を降伏でしょう。このように、単一の遺伝子の標的を正確に使用される個々のsgRNAの各々からのクローンの多くの遺伝子型を決定するために大量の遺伝子型決定のステップを必要とするであろう。蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、彼の説明しました再は、正確にこのタスクを実行することができます。 <p class="jove_c...

逆遺伝的アプローチは、科学者たちは、細胞または生物全体のゲノム中の特定の変化の影響を解明することができました。例えば、特定の遺伝子の発現は、これは、細胞の又は上の機能に及ぼす影響を決定するために、遺伝子ノックダウン1、2（部分的還元）または遺伝子ノックアウト3、4（完全切除）によって減衰させることができます生物の発生。 遺伝子ノックアウト実験は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの配列特異的プログラマブルヌクレアーゼ、の導入以来、より簡単になってきました。しかし、定期的にクラスタ化されたのは比較的最近の特徴付けは短い回文構造の繰り返し（CRISPR）を散在/ Cas9システムは、世代を実行するために、世界中のすべての実験室のためのそれは非常に簡単になりましたEノックアウト実験。本質的に、CRISPR / Cas9システムは、2つの必須成分、認識し、ゲノム中の特定の配列、及びCas9呼ばれるエンドヌクレアーゼに塩基相補性を介して結合する単一ガイドRNA（sgRNA）、から成ります。ゲノムDNA上のsgRNA-Cas9複合体の特異的結合および作用の余波は、DNAの二本鎖切断です。これは、今度は、その後の非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）経路を介して修復される細胞内のDNA損傷応答機構をトリガします。 NHEJ修復メカニズム（ただしHRメカニズム）は、多くの場合、挿入/欠失（インデル）の変異が生じ、修理の現場でのヌクレオチドのランダムな挿入または削除になりますので、それがシフトするエクソンの読み枠を引き起こす可能性があります。これは、その後、翻訳とナンセンス媒介崩壊5、6の早期終了に伴う遺伝子のノックアウトをもたらすことができます7。 遺伝子ノックアウトにCRISPR / Cas9システムの導入によって得られる利便性にもかかわらず、標的細胞のクローンの遺伝子型決定は、特に、8、9の設定ハイスループットで、ボトルネックのままです。主要な固有の制限を受けるか、財政的に高価であり、いずれかの既存の技術。これらのクローンは同一の対立遺伝子を有しているので、例えば、10の二重鎖DNA中のミスマッチを検出する酵素アッセイでSURVEYORまたはT7E1アッセイは、野生型クローンおよびホモ接合変異体（対立遺伝子同一に変異させるクローン）を区別することができないので、彼らのDNA配列11に不整合が存在しません。また、高スループットの設定で、変異体クローンの遺伝子型決定におけるゴールドスタンダードと考えられているサンガー法の使用は、その高いコストのために望ましくありません。ここでは、DETを提示します他の既存の遺伝子型決定技術の制限を回避し、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループットスクリーニングを実施するのに特に有用であることができ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法、のailedプロトコル。このメソッドは、実行することが技術的に簡単で、時間とコストを節約できます。

<table><tbody><tr><td>HEPG2細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP プラスミド</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone ウォーター、分子生物学グレード</td><td>GE ヘルスケア</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA インサートオリゴヌクレオチド (センス)</td><td>AITbiotech</td><td>なし</td><td>配列: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR</td></tr> <tr><td>sgRNA インサートオリゴヌクレオチド (アンチセンス)</td><td>AITbiotech</td><td>なし</td><td>配列: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>非標識PCR増幅フォワードプライマー</td><td>AITbiotech</td><td>なし</td><td>配列: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3';このプライマーは、PCR増幅対立遺伝子の配列決定にも使用されます</td></tr><tr><td>6-FAM標識蛍光PCRフォワードプライマー</td><td>AITbiotech</td><td>なし</td><td>配列:5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX</td></tr><tr><td>標識蛍光PCRフォワードプライマー</td><td>AITbiotech</td><td>なし</td><td>配列:5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>非標識PCR逆プライマー</td><td>AITbiotech</td><td>なし なし</td><td>配列: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di ホルムアミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ 色素サイズ 標準</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学式 96ウェル反応プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL 遺伝子分析装置</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 プログラム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 プログラム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 抗体 (N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Matrix Protein p84 抗体 [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure Sheep 抗マウス IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型crispr / cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光pcr-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

プログラマブル・ゲノム・編集ツールの開発は、特定のゲノム配列は、細胞および生物全体の機能に果たす役割を理解するための逆遺伝学の使用を容易にしました。この原因は、途方もなくCRISPR / Cas9システム - 研究者が対象で、他のもののうち、ノックアウト、するために、ゲノムやトランスクリプトームを操作ノックダウン、または遺伝子にノックすることを可能にする汎用性の高いツールの最近の導入によって助けられています方法。遺伝子をノックアウトするために、CRISPR / Cas9媒介二本鎖切断は、切れ目サイトでのヌクレオチドのフレームシフトの原因挿入または欠失を導入する非相同末端結合DNA修復経路を募集します。しかし、個々のガイドRNAは、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があり、これらを除外するために、複数のガイドRNAの使用が必要です。ターゲットのこの多様性はまた、今度はEFの使用を頼むれ、クローンの大量スクリーニングが必要であることを意味しノックアウトクローンの遺伝子型を決定するために、ハイスループット技術をficient。現在のジェノタイピング技術のいずれかは、それゆえ、高スループットのために、彼らは不適当、固有の限界に苦しむやコスト高を招きます。ここでは、詳細テンプレートとして粗細胞溶解物からのゲノムDNAを使用する蛍光PCRを用いて、次いで、キャピラリーゲル電気泳動によりPCRフラグメントを解決するためのプロトコル。この技術は、断片間に1つの塩基対の違いを区別するのに十分に正確であり、従って、標的遺伝子のコード配列におけるフレームシフトの有無を示すに十分です。この正確な知識を効果的に確認シーケンシング工程の必要性を排除し、ユーザーがプロセスに時間とコストを節約することができます。また、この技術は、ここで他の場所に示すように、多数の遺伝子に対するガイドRNAによって標的様々な組織起源の種々の哺乳動物細胞を遺伝子型決定に汎用性であることが証明されました。

ここで説明する蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動技術は、外来DNAの送達に適している実質的に任意の細胞株におけるゲノムの任意のターゲッティング可能な領域に適用可能であることが予想されます。我々は以前、大腸癌細胞株12における三つの遺伝子を標的とすることにより、その適用を実証しています。ここで、我々は肝細胞癌細胞株の遺伝子型決定でその有効性を示し、CRISPR / Cas9を対象とHEPG2は、1と同様にヌクレオソームタンパク質1（NAP1L1）遺伝子に対して構築します。実際に、我々は正常に多数の他の遺伝子12、13を対象とする非ヒト哺乳動物細胞系を含む種々の他の細胞を、遺伝子型蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を利用しています。 実験ワイズ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動tec...

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

この技術の全体的な目的は、CRISPR/Cas9によって誘導された挿入欠失変異クローンをハイスループットにジェノタイピングすることです。この手法は、選択したSAILモデルにおいて特定の遺伝子をノックアウトした際の表現型への影響など、遺伝学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、最小限から高スループットまでのスクリーニングが可能であり、汎用性が高いことです。この手法はヒトのがん遺伝学に関する知見を提供できるだけでなく、ヒトの幹細胞や初代細胞、あるいは非ヒト由来の細胞などの他の系にも適用可能です。私たちは、ショートタンデムリピート（STR）タイピングアッセイを実施していた際に、初めてこの手法を考案しました。手順を開始するには、蛍光ラベル付きCas9とシングルガイドRNAを共発現させるプラスミドを、選択した細胞にトランスフェクションします。細胞をトリプシン処理し、蛍光標識されたクローンを約3,500個選択します。これらのクローンを、ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した8 mLの増殖培地を用いて、10 cmディッシュに500個、1,000個、2,000個の分量で播種します。細胞を5% CO2雰囲気下、37 °Cでインキュベートし、単一細胞コロニーが肉眼で確認できるまで5日ごとに培地を交換します。次に、約5 µLの増殖培地を用いて、個々のコロニーを200 µLピペットで吸引します。各コロニーを、200 µLの増殖培地が入った個別のウェルに分注します。各混合液を繰り返しピペッティングし、細胞を再懸濁させます。細胞が50～90%のコンフルエンスに達するまで、前述の条件下でインキュベートします。ウェルから過剰な培地を除去し、各ウェルに0.05%トリプシンEDTA（フェノールレッド不含）を25 µL加えます。細胞を37 °Cで7分間インキュベートします。次に、ピペッティングを繰り返し、トリプシン処理した細胞を再懸濁します。顕微鏡下でウェルを確認し、細胞がウェル壁から剥離していることを確かめます。個々のクローンの複製（レプリケート）を調製するため、各細胞懸濁液を5 µLずつ、空の96ウェル培養プレートに移します。各ウェルに200 µLの増殖培地を加えます。次に、空の96ウェルPCRプレートの各ウェルに10 µLの溶解バッファーを分注します。各細胞懸濁液からさらに5 µLを、この96ウェルプレートに移します。プレートを軽く遠心分離し、液体がウェルの底に集まるまで待ちます。各細胞懸濁液の残りの15 µLに、200 µLの増殖培地を加えます。元の懸濁液と複製サンプルは、後にクローンのノックアウト状態を確認するため、培養条件下で保存します。次に、サーマルサイクリングを用いて溶出バッファー中で細胞を完全に溶解させます。溶解物を短時間遠心分離します。溶解物を40 µLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。希釈したライセートをボルテックスし、短時間遠心分離します。蛍光PCRを行う前に、溶解させた野生型細胞を用いて、ラベルなしのプライマー数ペアを設計し、その特異性を検証してください。最適なプライマーペアを特定し、フルオロフォア標識フォワードプライマーおよびラベルなしリバースプライマーを入手します。精製ゲノムDNAを使用した場合とは結果が異なる可能性があるため、ボルテックス処理した細胞を用い、自作の溶解バッファーで溶解させてプライマーの特異性を必ず確認してください。ラベル付けしたプライマーを使用し、希釈した溶解液を3 µL加えて、20 µL系で蛍光PCR反応を行い、標的領域を増幅させます。増幅産物5 µLを1%アガロースゲルで電気泳動し、PCR増幅産物のサイズと相対量を確認してください。サンプル調製を開始するには、ヌクレアーゼフリー水を用いて、野生型およびCRISPR/Cas9標的DNAのアンプリコンを約2.5 nanograms per microliterの濃度に希釈します。希釈した野生型DNAサンプルと標的DNAサンプルを等量ずつ混合します。96ウェルPCRプレートの各ウェルに、脱イオンホルムアミドと染色済みサイズスタンダードの29:1混合液を9 microliters、および混合したアンプリコンを1 microliterずつ分注します。プレートをしっかりと密閉し、PCRサーモサイクラーを用いてサンプルを95 °Cで3分間加熱します。加熱後すぐに、プレートを氷上で3分間冷却します。その後、ジェネティックアナライザーを用いてキャピラリーゲル電気泳動を行います。電気泳動の完了後、データを解析ソフトウェアにインポートしてプロットします。適切な染料チャンネルでデータを確認し、サイズスタンダードの品質を検証してください。その後、非標的野生型コントロールおよび標的クローンの染料チャンネル値をtxt形式でエクスポートします。このファイルから、ダイの識別子、サンプルファイル名、フラグメントサイズ、およびピーク高さの値を表計算ソフトにインポートします。各サンプルにおいて、標的クローンと非標的の野生型コントロールとの間のフラグメントサイズの差を算出します。3塩基対の倍数ではないインデル変異を持つクローンを特定します。保存したリプリケートから選択したクローンを連続的に拡大培養します。サンガーシーケンシングおよびウェスタンブロット解析を行い、クローンのジェノタイプを決定し、ノックアウトの状態を確認します。肝細胞癌細胞株HEPG2を対象に、Nap1L1遺伝子に対するCRISPR/Cas9コンストラクトを用いて標的化を行いました。非標的の野生型アレルおよびCRISPR/Cas9標的アレルを、それぞれ緑色および青色の蛍光色素で標識したプライマーを用いてPCR増幅しました。特異的に最適化した蛍光PCRプロトコルを用いることで、標的クローンの増幅産物を高収量で得ることができました。個々のクローンのサンプルにおいて、緑色および青色の蛍光色素間の干渉は見られませんでした。キャピラリーゲル電気泳動により決定したフラグメントサイズの解析から、ここに示す2つのクローンにおいて、それぞれ1塩基および10塩基の欠失が認められた。サンガーシーケンシングの結果は、キャピラリーゲル電気泳動の解析結果と一致していた。ウェスタンブロット解析により、選択したクローンがNAP1L1を発現していないことが確認された。この手順を行う際は、扱うサンプル数が多いため、各サンプルに注意深くラベルを貼ること、また、フルオロフォア標識アンプリコンは光に敏感であるため、光への曝露時間を最小限に抑えることが重要です。本手順の後、定量RT-PCR、ウェスタンブロット解析、サンガーシーケンシングなどの他の手法を行うことで、目的遺伝子が完全にノックアウトされているかなど、さらなる疑問に対する検証が可能です。このビデオを視聴することで、蛍光PCRとキャピラリーゲル電気泳動を組み合わせ、CRISPR/Cas9誘発変異クローンを高スループットにジェノタイピングする方法について十分に理解できるはずです。

using-fluorescent-pcr-capillary-gel-electrophoresis-technique-to

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

CRISPR/Cas9は、遺伝子と遺伝的要素の破壊を生み出す堅牢なシステムです。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して哺乳類細胞株のゲノム欠失を効率的に作成するためのプロトコルについて説明します。...

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

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高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

学ぶ蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いたCRISPR/Cas9ノックアウト変異体の遺伝子型判定法。高スループットスクリーニングでヒトや幹細胞など多様な細胞系に適用可能で、がん遺伝学研究における遺伝子機能解析に有用です。

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

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