Name: 眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶラットにおける慢性自己免疫ドライアイの誘導法。涙腺抽出物とオバルブミンを用いた皮下免疫化と結膜下・涙腺内投与により、涙機能障害とT細胞浸潤を再現し、治療薬の評価に活用できるモデルを構築する方法を解説する。

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著者たちは動物を扱う彼らの助けをしてくれたTin Min QiさんとVeluchamy Amutha Barathiさんとそのチームに感謝したいと思います。この研究は、NHIC-I2D-1409007、SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014、およびNMRC / CSA / 045/2012によって支持された。

動物は施設ガイドラインおよび眼および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って処理された。この試験プロトコールは、SingHealthのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。 1.涙腺抽出物の調製注：ラットをケタミン（75mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の腹腔内注射で麻酔した。適切な麻酔は、つま先のつまみと尾のつまみによって確認された。眼科用ゲルをラットの眼に適用して、各処置後の乾燥を防止した。麻酔したラットを遠赤外線下に置き、完全に回復するまで動物を温めた状態に保った。処置および回復時間の間、動物は研究者によって注意深く監視された。すべての材料および手術器具は使用前に無菌であった。実験の最後に、ペントバルビタール（80mg / kg）の腹腔内注射によってラットを安楽死させた。完全な安楽死は、心臓の脈拍の欠如および眼球に触れることによるまばたきの反射によって確認された。ラットを標準的な条件で収容した：室温、21〜23℃;相対湿度30-70％; 12時間（午前7時〜午後7時）交互に点灯します。 <ol><li> 安楽死させた雌Sprague-Dawleyラット（8週から16週の年齢範囲）を平らに置き、片方の耳をテーブルに向け、もう一方を上に向けます。露出した耳の下に10mmの切開部を、ばねのはさみで上下に作る。周囲の結合組織および排液管から涙腺を摘出して涙腺を除去する。 <ol><li>必要になるまで、腺を-80°Cで保存します。氷上で腺を解凍する。はさみで氷の上でできるだけ細かく刻む。涙腺あたり1xプロテアーゼ阻害剤を含む150μLのPBSを加える。 </li></ol></li><li>サンプルを氷上で20kHzで5分間音波処理し、10秒間、10秒間、30％振幅で超音波処理する。息子を遠心分離するサンプルを13,000 xgおよび4℃で20分間インキュベートした。 </li><li>上清をピペットで取り出し、新しいチューブに移す。 1.5 mLチューブに上清を分注し、-80°Cで保存します。製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ22でタンパク質濃度を測定する。 </li></ol>エマルジョンおよび百日咳毒素の調製<ol><li> 乳剤 <ol><li> Mycobacterium tuberculosis H37Ra 1mg / mLを含む完全フロイントアジュバント10mLに熱殺菌した結核菌 H37Ra 40mgを添加し、よく混合する。 注：最終的なフロイントの完全アジュバントには、5mg / mLの結核菌 H37Raが含まれています。 </li><li>オボアルブミンを秤量し、PBSに溶解し、2mg / mLオボアルブミンおよび10mg / mL涙腺抽出物を含む抗原混合物を調製する。各動物について200μLの注射容量を目指して、マスター混合物b動物番号に従ってください。 </li><li>不完全フロイントアジュバントまたはフロイント完全アジュバントを50mLチューブに移し、抗原混合物に対するアジュバントの量が1：1の比率になるようにする。アジュバントに抗原混合物を滴下しながら流し込みを起こさない最高速度でボルテックスする。すべての抗原を加えた後、ボルテックスを5分間続けます。 </li><li>エマルジョンを5mLシリンジに移し、シリンジコネクタを介して別の5mLシリンジと連結する。一方のシリンジからもう一方のシリンジにエマルションを押し込んで混合します。 注：エマルジョンは、水中に置かれたときに単一の液滴が球のままであれば、準備ができています。 4℃で一晩保存したばかりのエマルジョンまたはエマルジョンのみを使用してください。 </li></ol></li><li> 百日咳毒素 <ol><li> 50μgの百日咳毒素を500μLの水中に再構成して、100ng /μLの最終濃度にする。容器を30秒間ボテックスして、オキシンは完全に溶解する。 注：ろ過による滅菌は行わないでください。これは材料の損失を招きます。凍らせないでください。この溶液は、4℃で少なくとも6ヶ月間活性を維持する。 </li><li> 100ng /μLの百日咳毒素をPBSを用いて3ng /μLに希釈する。 100μLの希釈した百日咳毒素を、27G針の1mLルアーロック注射シリンジに移す。 </li></ol></li></ol> 3.ルイスラットの免疫化<ol><li> 0日目に、エマルジョンを数回混合する。完全なフロイントアジュバント中の涙腺抽出物1mgと卵白アルブミン200μgを含む200μLのエマルジョンを、27Gの針を有する1mLのルアーロックシリンジに分配する。麻酔をかけることなくラットの尾の基部にエマルジョンを皮下注射する。 注：注射の前にあらかじめ加温する必要はありません。各ラットを、1mgの涙腺抽出物および200μgのオボアルブミンで完全フロインドアジュバントウィットh 結核菌H37Ra500μg 。 </li><li> 14日目に、0日目と同じ様式で、涙腺抽出物1mgおよびオボアルブミン200μgを不完全フロインドアジュバントに含む200μLのエマルジョンを注射する.100μLのPBS中の300μgの百日咳毒素を腹腔内に注射する同じ日にラット毎に投与する。 </li></ol> 4.抗原特異的免疫細胞を回収し、局所炎症を引き起こすための抗原混合物を結膜下結膜および涙腺に注射する。 <ol><li>実験中のラットの数に基づいてオボアルブミンおよび涙腺抽出物の量を計算する。必要量のオボアルブミンを秤量し、ステップ1で調製した解凍涙腺抽出物と混合し、1mg / mLのオボアルブミンおよび1mg / mLの涙腺抽出物を含む抗原溶液を作製する。 </li><li>腹腔内注射によりケタミン（75mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）でラットを麻酔する。ピンチして適切な麻酔が達成されたことを確実にする（ すなわち、ピンチ後に反応的な動きが観察されない）ようにする。 5μLの抗原を眼の結膜下結膜に注入する。 20μLの抗原を涙腺に注入する。 </li></ol> 5.ドライアイの特徴の評価注意：ステップ5.1~5.3については、麻酔したラットを手袋をした手で平らな面の上に静かに置き、動かないようにする。 <ol><li> フェノールレッド糸で涙液量を測定する。 <ol><li> 1対の鉗子を使用して糸を保持し、もう1本はラットの下まぶたを引っ張る。下糸の近位コーナーに糸を1分間置き、糸を取り除く。 注記：涙は糸の濡れた部分を赤色にします。 </li><li>ミリメートルのマーキングが付いた定規の横の糸の濡れた部分の長さの画像を撮ります。ぬれた長さを10分の1秒まで測定する画像ソフトウェア（ 例えば、 ImageJ）を用いて、約1ミリメートル（mm） </li></ol></li><li> 角膜/涙の滑らかさを測定する。 <ol><li>ラットをリング照明装置とカメラを備えた実体顕微鏡の下に置く。 5μLの生理食塩水をラットの角膜に適用する。上下のまぶたを手袋をした指で5〜5回動かして生理食塩水を広げることで、受動的に点滅させます。 </li><li>角膜表面の中央にリングイルミネーターを1.6倍の倍率でピントを合わせます。 10秒後に写真画像を取得する。 注：リングイルミネータは、動物の角膜に2つの円形の行のドットイメージを投影します。歪みのないドットの規則的な間隔は、滑らかな角膜/涙層を示唆している。 </li></ol></li><li> フルオレセイン染色で角膜損傷を測定する。 <ol><li> 0.2μLの0.2％フルオレセインをラットの角膜に加える。手で触れた指で受動的にラットのまぶたを3回開いて閉じて、フルオレセイン色素を目の表面に広げます。 </li><li&gt; 1分後、1mLの生理食塩水を3mLシリンジ（針を付けずに）で引き、注射器を角膜の約2〜3mmの位置に置き、穏やかに食塩水を眼に送ります。 </li><li>バックグラウンドライトがオフになっている接眼レンズのコバルトブルーフィルター（ すなわち、 〜400 nm）の下で画像を取得します。 注：画像はその後、以前の出版物23から変更された評価システムによって分析された。 0から2までの緑色スポットの数、面積および強度を主観的に等級分けすることによって画像を分析した.0はそれらの不在を示し、1は50スポット未満の点陰性染色を示し、2は50スポットを超える点陰性染色を示す。 </li></ol></li><li>ペントバルビタール（80mg / kg）の腹腔内注射によりラットを安楽死させる。はさみで上下のまぶたをはずします。鉗子で眼周囲組織を押し下げることによって、眼球を固定し脱皮する。 tを切断して地球を解放する彼は外眼筋、視神経、および結膜炎結膜を含む。 </li><li>鉗子でラットの眼球の位置を固定し、赤道に沿って円周方向の切開でそれを開きます。水晶体と硝子体を取り除く。解剖した眼球を氷上の1.5mLチューブに入れる。 </li><li>ステップ1.1で説明したように、涙腺を採取する。解剖した眼球組織および涙腺を直ちに実験室に移し、フローサイトメトリー分析に備える。 </li><li>免疫細胞をコラゲナーゼおよびディスパーゼII消化法で単離した24,25 。フローサイトメトリーを使用して、眼球組織26の T細胞亜集団をプロファイリングする。 注：抗体のパネルは、抗CD45APC-シアニン7（OX-1）、抗CD3 BV421（1F4）、抗CD4 PE-シアニン7（OX-35）、抗CD45RC Alexa647（OX-22） -CD62 PE（HRL1）、抗CD44 FITC（OX-50）および生存細胞色素7-AADである。 CD45 + CD3 <supCD3 + CD45RC + CD45LC + ）、エフェクターメモリー（ TEM、 CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ）、および中央メモリー（T CM、 CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ）T細胞は、 。 </li></ol>

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著者は利害の対立がない。 LTは、Alcon、Allergan、Santen、BauschおよびLomb、Eyelens、およびEyedetecからの前払いおよび/または贈り物を受けた。

このプロトコルの重要なステップは、エマルジョンの均質性を保証することです。よく調製されたエマルジョンでは、抗原は完全に油でコーティングされ、注入された抗原の徐放および持続的な免疫刺激を確実にする。このプロトコルのもう1つの重要な特徴は、ルイスラットの使用である。ルイスラットは、他の株27よりも自己免疫疾患の発症に対して感受性が高い。 このプロトコルは、涙腺抽出物のみまたは組換えKlk1b22 20,21のいずれかを使用した、以前に公開された2つのプロトコルから変更されている。現在のプロトコールでは、オボアルブミン+涙腺抽出物が抗原として使用され、抗原特異的免疫細胞が眼球表面および涙腺に引き寄せられ、局所組織損傷を誘発する。ドライアイはゆっくりと発達し、最初の免疫感作の48日後に約85％に達する。抗原への挑戦48日目に眼および涙腺が乾いた目を悪化させ、70日目まで慢性を確実にする。 Klk誘発性DEDモデルにおける組換えKlk1b22と比較して、現在のモデルで使用される涙腺抽出物およびオボアルブミンは、安価で入手しやすい。涙腺抽出物には、Klk以外にも自己免疫を誘導する可能性のある他のタンパク質が含まれているため、この抽出物はDED誘発時のKlk法よりも理論的に強力です。我々はまた、涙腺抽出物のみをラットに免疫した。これらの免疫したラットはDEDを発症したが、対照と比較して眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の有意な増加はなかった。 この手法の限界は、モデルを達成するのに70日かかることです。エフェクター記憶T細胞は、正常なラットの眼における主要なT細胞サブセットである。このモデルでは、自己免疫DEDは、眼球におけるCD3 +エフェクターメモリーT細胞の増加をもたらす。あの薬したがって、Kv1.3カリウムチャネルの選択的阻害剤などのエフェクター記憶T細胞を効果的に抑制することは、自己免疫DED28に対する治療上の利益を有し得る。

ドライアイ疾患（DED）は、涙および眼球表面の多因子性疾患であり、不快感、視覚障害および涙液膜不安定の症状をもたらし、眼表面の損傷を引き起こす可能性がある。これは、涙液膜の浸透圧の増加および眼表面1の炎症を伴う。 DEDに伴う症状は、燃焼、刺すような痛み、異物感、涙、眼の疲労、および乾燥である 2,3 。 DEDの2つの主な原因は、涙分泌腺による涙液産生の減少および涙液膜の過剰な蒸発である4 。シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、およびリウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を有する患者において、マイボーム腺に対する免疫損傷は、涙の安定に必須の脂質の発現を減少させる。また、眼球表面への免疫損傷は、表面濡れ性のために重要なムチンの存在。一緒に、これらのプロセスは累積的に慢性的なドライアイを引き起こす5,6,7 。 涙の補充および抗炎症療法は治療の主役です。しかしながら、DED（ すなわち、コルチコステロイドおよびシクロスポリン）の現在の抗炎症療法は、広く免疫抑制性であり、深刻な副作用をもたらす8,9,10 。自己免疫ドライアイを治療するための新規な免疫調節剤を試験するのに適した動物モデルが必要である。 特定の遺伝子欠損を有するマウス11,12,13 、特定の遺伝子を欠くマウス14,15、および免疫調節を過剰発現するトランスジェニックマウスory遺伝子は、自己免疫ドライアイのモデルとして用いられている16,17 。抗原誘発自己免疫動物モデルも、マウス18 、ウサギ19 、およびラット20,21 において報告されている。ここでは、慢性自己免疫ドライアイの抗原誘発モデルを記載する。このモデルは、以前の2つのモデルの変更です。 1つは涙腺抽出物を使用し、第2のものは涙腺20,21から自己抗原（ すなわち klk1b22）を使用した。 この疾患は、オボアルブミン、完全フロイントアジュバント、およびSprague-Dawleyラットの涙腺抽出物を含むエマルジョンを含む6〜8週齢のメスのLewisラット（ 図1 ）の皮下免疫によって誘導された。不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原による2回目の免疫化は、2週間後に投与した。抗原特異的免疫細胞を涙腺および眼表面に補充するために、涙腺抽出物およびオボアルブミン（1mg / mL）の混合物を、6〜7週目に結膜下結膜および涙腺に注入した（ 図1 ）。ラットの85％以上が初回免疫の70日後にドライアイの特徴的な特徴を発達させた。これらの特徴には、涙液産生の減少（ 図2 ）、角膜フルオレセイン染色の増加（ 図3 ）、および涙液の安定性低下（ 図4 ）が含まれる。フローサイトメトリーによる正常ラットの眼球におけるT細胞の免疫プロファイリングは、CD3 +エフェクターメモリーT細胞の優勢を明らかにする（ 図5および6 ）。自己免疫DEDを有するラットは、CD3 +エフェクターメモリーT細胞の増加およびナイーブおよび中央メモリーT細胞の対応する減少を示す（ 図6 </strong&gt;）。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermal Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>結核菌 H37Ra&nbsp;</td><td>ベクトン、ディキンソンと会社の</td><td>231141</td><td></td></tr>は<tr><td>、フロイントのアジュバント</td><td>を完成させる ベクトン、ディキンソンと会社</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>不完全なフロイントのアジュバント&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F5506-6X10ML</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7208-50UG</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインナトリウム溶液</td><td>Bausch&Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sonicator Sonics&nbsp;</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>フェノール赤糸</td><td>天津Jingming新技術開発有限公司</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>リングライトイルミネーター&カメラ付き実体顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロIV顕微鏡&nbsp;</td><td>フェニックス研究所NA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

眼球組織におけるエフェクター記憶t細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

ドライアイ疾患は、罹患率および健康管理の負担を引き起こし、生活の質を低下させる非常に一般的な状態である。自己免疫ドライアイ状態を治療するための新規な治療法を試験するためには、適切なドライアイ動物モデルが必要である。このプロトコルは、慢性自己免疫ドライアイラットモデルを記述する。ルイスラットを、涙腺抽出物、オボアルブミンおよび完全フロイントアジュバントを含むエマルジョンで免疫化した。不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原による2回目の免疫化を2週間後に行った。これらの免疫感作は、尾の基部に皮下投与した。眼表面および涙腺における免疫応答を高めるために、涙腺抽出物およびオボアルブミンを、初回免疫の6週間後に結膜下結膜および涙腺に注入した。ラットは、涙液の生成の減少、涙の安定性の低下、および角膜の損傷の増加を含むドライアイの特徴を発達させた。免疫プロフローサイトメトリーによるファイリングは、眼球におけるCD3 +エフェクター記憶T細胞の優勢を示した。

図1に実験デザインを示します。 48日目と70日目の両方で、ドライアイの臨床的特徴を、免疫したラットで評価する。涙の量は、フェノールレッド糸の湿った部分の長さによって表される。 図2は、コントロールおよびDEDラット由来のフェノールレッド糸の代表的な画像を示す。 DED群のフェノールレッド糸の長さは対照群よりも短く、涙液量が少ないことを示している。 フルオレセインは、損傷した角膜上皮に結合する。したがって、角膜の損傷は、角膜のフルオレセイン染色によって測定される。 DEDラットの角膜表面のフルオレセインスポットを0〜2に等級分けし、対照ラットと比較した。 DEDを有するラットは、対照ラットよりもフルオレセイン染色を有し（ 図3 ）、角膜損傷を示唆している。 角膜の滑らかさDEDおよび対照ラットにおいて、リングイルミネータによって評価した。角膜表面が滑らかで、高い涙の安定性を有する場合、眼球表面上のイルミネータリングのイメージは丸く、完全である。画像の歪みは、角膜平滑性の低下および不安定な涙液膜を示す。リングの歪み度を0から2に等級付けした.DED群ではリング歪みのレベルが高くなり（ 図4 ）、涙の安定性が低いことが示された。 ラットは、ドライアイの少なくとも2つの臨床的特徴が異常である場合、ドライアイを有すると定義される。 24匹の免疫したラットのうち、21匹のラットが48日目にDEDを発症した。その結果は、70日目に評価した場合に一貫していた。 フローサイトメトリー分析は、正常ラット眼球組織における優勢なT細胞サブセットがエフェクター記憶T細胞であることを示す（ 図5 ）。 DEDラットの眼球では、CD3の約70％+ T細胞はエフェクター記憶T細胞であるが、対照ラットではこの数は約50％である。 DEDラットの眼球は、対照ラットの眼球より有意に高いエフェクター記憶T細胞を有する（ 図6 ）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> 図1：実験デザインの概略図 LG：涙腺; DED：ドライアイ疾患; CFA：フロイント完全アジュバント; IFA：不完全フロイントアジュバント。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> 図2：フェノールレッドスレッドは引裂き量を測定します。フェノール赤色糸を両方のラットの目の近位角に1分間置いてから取り除く。 Representativ対照群とDED群の両方からのルーラーと一緒に、フェノールレッド糸の画像が示されている。 ImageJを用いてフェノールレッド糸の濡れた部分の長さを測定した。スケールバー= 1mm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> 図3：フルオレセイン染色によって測定された角膜上皮損傷の代表的な画像。各ラット角膜を0.2％フルオレセインで1分間染色し、少なくとも1mLの生理食塩水で洗い流した。画像は、コバルト青色光を有する目画像顕微鏡下で撮影した。第1列は、角膜の代表的な画像を示す。第2列は、DED特徴を有するラットからの角膜染色の代表的な画像を含む。緑色の蛍光スポットは、角膜上皮を示す<html> lダメージ。すべての画像は同じ色スケールで作成されています。フルオレセイン染色の定量は、緑色のスポットの面積および密度に従って行った。スケールバー= 1mm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> 図4：リングイルミネータの反射を示す代表的な角膜画像。ラットの角膜/涙の滑らかさは、リングイルミネータによって測定した。捕捉された画像におけるリングのひずみ度合いは、相対的な引き裂き安定性の尺度である。左の列は対照動物の代表的な画像を示し、右の列はドライアイの誘導後の代表的な画像を示す。スケールバー= 1mm。ank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> 図5：フローサイトメトリー分析から得られたドットプロット。眼球組織から単離したT細胞を抗体のパネルで染色した。 CD45 + CD3 + 7AAD -集団では、CD3 + 7-AAD - T細胞がゲートされた。 CD3 + 7-AAD - T細胞の中で、ナイーブ、中央記憶、およびエフェクター記憶T細胞集団を決定した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> 図6：眼球におけるT細胞亜集団プロファイル。 CD3 + CD45RC+ナイーブT細胞、CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L -エフェクターメモリーT（T EM ）細胞、およびCD3 + CD45RC - CD44 + CD62L +中央メモリーT（T CM ）細胞は、CD3 + T細胞のパーセンテージとして提示される。結果は3匹の対照ラットおよび6匹のDEDラットからのものである。単離された涙腺からのT細胞の分析からも同様の結果が得られた（データ示さず）。ペアのないスチューデントのt検定を統計的比較のために使用した。誤差バーはSDを表す。 * p &lt;0.05、** p &lt;0.01。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

この報告では、ラット涙腺抽出物、オボアルブミン、完全フロインドアジュバントのエマルジョンで免疫化した後、涙腺下涙腺および涙腺に涙腺抽出物およびオボアルブミンを注入することにより、Lewisラットにおいて慢性的な実験的自己免疫ドライアイを誘導する方法が記載されている6週間後。

眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

本手順の目的は、涙腺抽出物の皮下免疫および結膜下および涙腺内への注入を用いて、ラットに涙液機能不全と涙腺炎症の臨床的特徴を誘発し、自己免疫性ドライアイに対する治療法を評価することです。この手法は、自己免疫疾患においてT細胞を抑制する薬剤が有効であるかなど、ドライアイにおける重要な課題を明らかにすることに役立ちます。本技術の主な利点は、ヒトのドライアイに類似した眼疾患の徴候を再現できること、および涙腺や眼に浸潤するT細胞を定量化できることです。脾臓やリンパ節を解析できるため、この動物モデルの意義はリンパ球のトラフィッキングの理解にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな方は、ラットの小さな眼における変化を記録するための適切な器具が不足しているため、困難に直面すると考えられます。麻酔後のラットの眼は急速に乾燥し、瞬きも行われないため、特定の工程の習得が困難であり、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。規定のプロトコルに従って雌のSprague Dawleyラットを安楽死させた後、片方の耳をテーブルに付け、もう片方の耳を上にした状態で動物を平らに置きます。ハサミを用いて、露出している耳の下に上下方向に10 millimeterの切開を加えます。次に、周囲の結合組織および排泄管から剥離させることで、涙腺を取り出します。次に、ハサミを用いて、組織を氷上で可能な限り細かく刻みます。その後、涙腺1つにつき、1Xプロテアーゼ阻害剤を含むPBSを150 µL加えます。ソニケーターを10秒オン、10秒オフ、振幅30%に設定し、氷上で20 kHzで5分間、サンプルを超音波処理します。次に、超音波処理したサンプルを13,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。その後、上清を1.5 mLチューブに分注し、-80 °Cで保存します。5 mg/mLのMycobacterium tuberculosis H37Raを含む完全フロイントアジュバント、または不完全フロイドアジュバントを50 mLチューブに移し、アジュバントと抗原混合物の体積比を1:1にします。2 mg/mLのオバルブミンおよび10 mg/mLの涙腺抽出液を含む抗原混合物を、液が飛び散らない範囲での最高速度でボルテックスしながら、アジュバント溶液に一滴ずつ加えます。すべての抗原を添加した後、さらに5分間ボルテックスを続けます。エマルションを5 mLシリンジに移し、シリンジコネクターを用いて別の5 mLシリンジと接続します。次に、エマルションを一方のシリンジからもう一方のシリンジへ押し出し、混合させます。0日目に、コンプリートフロイントアジュバントに含まれる1 mgの涙腺抽出物と200 µgのオバルブミンを含むエマルション200 µLを、1 mLルアーロックシリンジに分注し、シリンジに27Gの針を装着します。麻酔を使用せずに、ラットの尾基部にエマルションを皮下注射します。その後、14日目に同様の手法で、不完全フロイントアジュバントに含まれる同抗原200 microlitersを注射します。同日に、PBS 100 microlitersに溶解した百日咳毒素300 nanogramsを腹腔内注射します。48日目に、必要量のオバルブミンを量り取り、PBSに溶解させます。次に、このビデオの前のステップで準備し、解凍した涙腺抽出液にオバルブミンを混合し、オバルブミン 1 mg/mL および涙腺抽出液 1 mg/mL を含む抗原溶液を作成します。ラットを麻酔した後、抗原 5 µL を眼の結膜下穹窿に注入します。次に、抗原20 µLを涙腺に注入します。麻酔したラットをテキストプロトコルに従って保持し、フェノールレッド糸を用いて涙量を測定します。一方のピンセットで糸を保持し、もう一方のピンセットでラットの下眼瞼を牽引します。下眼瞼結膜嚢の目頭側に糸を1分間配置し、その後、糸を取り除きます。次に、糸をミリメートル目盛りのある定規の横に置き、糸の濡れた部分の長さの画像を撮影します。角膜涙液の平滑性を測定するには、リング照明とカメラを備えた実体顕微鏡の下にラットを配置します。その後、ラットの角膜に生理食塩水を 5 µL 投与します。手袋を着用した指で、上眼瞼と下眼瞼を約5回パッシブに瞬かせ、生理食塩水を広げます。1.6倍の倍率で、リング照明を角膜表面の中央に合わせます。その後、10秒後に写真を撮影します。ラットの角膜に0.2%フルオレセインを2 µL添加し、フルオレセイン走査を用いて角膜損傷を測定します。手袋を着用した指で、ラットのまぶたを静かに3回開閉させ、眼表面にフルオレセイン染料を広げます。1分後、3 mLシリンジを用いて生理食塩水を1 mL吸引します。次に、シリンジを角膜の約2〜3 mm前方に配置し、眼球に生理食塩水を緩やかに注入します。背景光を消灯し、眼球イメージング顕微鏡のコバルトブルーフィルター下で画像を撮影します。本文のプロトコルに従ってラットを安楽死させた後、ハサミを用いて上下の眼瞼を除去します。外眼筋、視神経、および穹状結膜を切断して眼球を遊離させます。切開を加えて眼球を開きます。水晶体と硝子体を摘出します。次に、摘出した眼球を氷上の1.5 milliliterチューブに入れます。最後に、本ビデオの前述の手順に従って、涙腺を回収します。この図は、コントロール群およびDEDラットからのフェノールレッド糸の代表的な画像を示しています。DED群におけるフェノールレッド糸の染まり具合は対照群よりも短く、涙液量が少ないことを示しています。フルオレセインは損傷した角膜上皮に結合するため、損傷の程度を測定するために使用されます。本実験では、DEDラットの角膜表面におけるフルオレセイン染色のスポットを0から2の段階で格付けし、対照ラットと比較しました。DED罹患ラットは対照ラットよりもフルオレセイン染色の程度が強く、角膜損傷が示唆されます。ここで示されているように、角膜表面が平滑で涙液の安定性が高い場合、眼表面に映るイルミネータリングの像は真円で完璧になります。像に歪みがあることは、角膜の平滑性の低下と涙液層の不安定さを示しており、DED群ではより高度な歪みが観察されました。このフローサイトメトリー解析は、正常なラット眼球組織における主要なT細胞サブセットがエフェクターメモリーT細胞であることを示しています。DEDラットの眼球では、CD3陽性T細胞の約70%がエフェクターメモリーT細胞であるのに対し、対照群のラットではこの数値は約50%です。DEDラットの眼球は、対照群のラットよりもエフェクターメモリーT細胞が有意に多く含まれています。この手順に続き、他の種類の免疫細胞の染色を行うことで、さらなる疑問を検討することが可能です。例えば、自然免疫細胞やBリンパ球の染色を行うことができます。この手法の開発後、研究者が眼表面の免疫学を理解し、さらにヒトのドライアイやシェーグレン症候群を研究するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ラットにおいて自己免疫性ドライアイを誘発する方法と、その結果を確実に記録する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ラットに慢性的な実験的自己免疫性ドライアイ疾患を誘発する技術を示しています。自己抗原および外来抗原を含む抗原アジュバントエマルジョンを所定の間隔でラットに注射すると、同じ抗原を眼表面組織に注入することにより、免疫ラットに慢性眼の炎症が誘発されます。...

ラットに慢性実験的自己免疫性ドライアイを誘発する技術

麻酔を使用せずに、ラットの尾の付け根にエマルジョンを皮下注射します。次に、14日目に同様の方法で、同じ抗原と不完全なフロイントアジュバントを200マイクロリットル注入します。同じ日に、100マイクロリットルのPBSに300ナノグラムの百日咳毒素を腹腔内に注射します。...

このビデオは、自己免疫性ドライアイラットモデルで涙液量を決定するためのフェノールレッドスレッドテストを示しています。pHに敏感な酸性フェノールの赤い糸は、アルカリ性の涙に触れると色が変わります。フェノールレッド糸の変色の長さが短いほど、涙量の減少に相当します。...

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