眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

この手順の全体的な目標は、自己免疫性ドライアイの治療法を評価するための涙腺抽出物の皮下免疫および結膜下および涙内腺注射を使用して、ラットの涙液機能障害および涙腺炎症の臨床的特徴を誘発することです。この方法は、自己免疫疾患のT細胞を抑制する薬剤が有効かどうかなど、ドライアイの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、人間のドライアイと同様の眼疾患の兆候を生成し、涙腺と眼に浸潤するT細胞を定量化することです。

この動物モデルの意味は、脾臓とリンパ節を研究できるため、リンパ球の輸送の理解にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個々の人は、小さなラットの目の変化を記録するための適切な機器がないため、苦労します。ラットの眼が急速に乾燥し、麻酔後にまばたきがないため、特定の手順を学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

テキストプロトコルに従って雌のSprague Dawleyラットを安楽死させた後、片方の耳をテーブルに当て、もう片方の耳を上に向けて動物を平らに置きます。ハサミで、露出した耳の下に上 - 下に10ミリメートルの切開をします。次に、涙腺を周囲の結合組織と排液管から解剖して取り除きます。

次に、はさみを使用して、氷の上で組織をできるだけ細かく刻みます。次に、涙腺ごとに1Xプロテアーゼ阻害剤を含む150マイクロリットルのPBSを追加します。ソニケーターを10秒オン、10秒オフ、30%の振幅に設定して、サンプルを20キロヘルツの氷上で5分間超音波処理します。

次に、超音波処理されたサンプルを13,000倍のgおよび摂氏4度で20分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移します。次に、上澄みを1.5ミリリットルのチューブに分注し、摂氏マイナス80度で保存します。

結核菌H37Raまたは不完全なフロイントのアジュバントを1ミリリットルあたり5ミリグラムを含む完全なフロイントのアジュバントを50ミリリットルのチューブに移し、抗原混合物へのアジュバントの量が1対1の比率になるようにします。オボアルブミン1ミリグラムあたり2ミリグラムと涙腺抽出物10ミリグラム/ミリリットルを含む抗原混合物を、こぼれない最高速度でボルテックスしながら、アジュバント溶液に一滴ずつ加えます。すべての抗原を添加した後、5分間ボルテックスを続けます。

エマルジョンを5ミリリットルのシリンジに移し、シリンジコネクタを使用して別の5ミリリットルのシリンジとリンクします。次に、エマルジョンを一方のシリンジからもう一方のシリンジに押して混合します。ゼロ日目に、1ミリグラムの涙腺抽出物と200マイクログラムのオボアルブミンを完全なフロイントアジュバントに含んだ200マイクロリットルのエマルジョンを1ミリリットルのルアーロック注射器に分配し、注射器に27ゲージの針を装備します。

麻酔を使用せずに、ラットの尾の付け根にエマルジョンを皮下注射します。次に、14日目に、同様の方法で、不完全なフロイントのアジュバントに同じ抗原の200マイクロリットルを注入します。同じ日に、100マイクロリットルのPBSに300ナノグラムの百日咳毒素を腹腔内に注射します。

48日目に、必要量のオボアルブミンを秤量し、PBSに溶解します。次に、オボアルブミンをこのビデオの前半で調製した解凍した涙腺抽出物と組み合わせ、オボアルブミン1ミリリットルあたり1ミリグラム、涙腺抽出物1ミリグラムあたり1ミリグラムを含む抗原溶液を作ります。ラットに麻酔をかけた後、5マイクロリットルの抗原を眼の円蓋結膜下組織に注入します。

次に、20マイクロリットルの抗原を涙腺に注入します。テキストプロトコルに従って麻酔をかけたラットを保持しながら、フェノールレッドスレッドスレッドで涙液量を測定するには、1組の鉗子を使用して糸を保持し、もう1組の鉗子を使用してラットの下まぶたを引っ張ります。糸を下部円蓋の近位角に1分間置き、次に糸を取り外します。

次に、ミリメートルのマーキングが付いた定規の隣に糸を置き、糸の濡れた部分の長さをイメージします。角膜裂け目の滑らかさを測定するには、ラットをリングイルミネーターとカメラを備えた実体顕微鏡の下に置きます。次に、5マイクロリットルの生理食塩水をラットの角膜に塗布します。

手袋をはめた指で、上まぶたと下まぶたを約5回動かして受動的にまばたきをし、生理食塩水を広げます。1.6倍の倍率で、リングイルミネーターを角膜表面の中央に焦点を合わせます。次に、10秒後に写真画像を取得します。

フルオレセインスキャンを使用して、ラットの角膜に2マイクロリットルの0.2%フルオレセインを添加することにより、角膜の損傷を測定します。手袋をはめた指で、ラットのまぶたを受動的に3回開閉して、フルオレセイン色素を目の表面に広げます。1分後、3ミリリットルの注射器を使用して1ミリリットルの生理食塩水を抜きます。

次に、シリンジを角膜の約2〜3ミリメートル前方に配置し、生理食塩水を眼に優しく塗ります。背景光をオフにした状態で、眼球イメージング顕微鏡のコバルトブルーフィルターで画像を取得します。テキストプロトコルに従ってラットを安楽死させた後、ハサミを使用して上まぶたと下まぶたを取り除きます。

外眼筋、視神経、および円孔結膜を切断することにより、地球を解放します。眼球を開くために切開を行います。ガラス質のレンズを取り外します。

次に、解剖した眼球を氷の上の1.5ミリリットルのチューブに入れます。最後に、このビデオで前述したように、涙腺を収集します。この図は、コントロールラットとDEDラットからのフェノールレッドスレッドの代表的な画像を示しています。

DEDグループのフェノールレッドスレッドの長さはコントロールグループよりも短く、涙の量が少ないことを示しています。フルオレセインは損傷した角膜上皮に結合するため、損傷の程度を測定するために使用されます。この実験では、DEDラットの角膜表面上のフルオレセインスポットを0から2に等級付けし、対照ラットと比較しました。

DEDのラットは、対照ラットよりもフルオレセイン染色が多く、角膜の損傷を示唆しています。このように、角膜表面が滑らかで引裂き安定性が高い場合、眼球表面のイルミネーターリングのイメージは丸くて完璧です。画像の歪みは、DEDグループでより高い歪み度に観察されたように、角膜の滑らかさの低下と不安定な涙液膜を示しています。

このフローサイトメトリー解析は、正常なラット眼球組織における優勢なT細胞サブセットがエフェクターメモリーT細胞であることを示しています。DEDラットの眼球では、CD3陽性T細胞の約70%がエフェクターメモリーT細胞であるのに対し、対照ラットでは、この数は約50%であり、DEDラットの眼球は、対照ラットのものよりも有意に高いエフェクターメモリーT細胞を有する。この手順に続いて、他の種類の免疫細胞の染色を行い、追加の質問に答えることができます。

例えば、自然免疫細胞やBリンパ球を染色することができます。その開発後、この技術は、研究者が眼表面免疫学を理解し、さらにヒトのドライアイとシェーグレン症候群を研究する道を開きました。このビデオを見た後、ラットに自己免疫性ドライアイを誘発する方法と、結果の確固たる文書化を行う方法について十分に理解しているはずです。