Name: ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶナノインプリントリソグラフィーによるバイオセンサー製造法。心筋トロポニンIを血清中で10-400 pg/mLの臨床的関連濃度で検出し、ポイントオブケア診断に応用可能です。複雑な光学系を不要とする優れた光学透過原理を活用しています。

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AP には、教授 T Venkatesan、ディレクター、NUS ナノサイエンス ・ ナノテクノロジー ・ イニシアティブ副大統領 (シンガポールの国民大学) (R-398-000-084-646) のオフィスのサポートが認めています。CLD は、サポートのシンガポール省の保健医療研究評議その臨床医科学者資金調達スキームの下でナノ材研/CSA/035/2012, とシンガポール国立大学を認めています。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

1. 作製センサーとデータの取得
<ol>
	<li>ニッケル鋳型の作製
	<ol>
		<li>負の電子ビームの 220 nm 厚層のコートにシリコンウエハ 4 で 600 μ m 厚に抵抗します。電子ビーム露光システムを用いたウェーハ用に設計されたナノホール配列を記述します。<ol>
			<li>フィールド サイズを 300 μ m ごとに 20 k の低 dotmap (N) とパターンの書き方を書いて電子ビームを加速する (A) (すなわち、そこ 4 億ドット各 300 μ m2の領域にマップされている、そしてかどうかは、電子ビームによって各ドットが公開か、パターン設計によって)。110 μ cm− 2レジストの eb レジスト被曝線量を設定および 800 の電流 (I) で書き込みペンシルバニア州 注記: 電子ビーム書面によって計算されたドット (Tドット) ごとに露出時間によって制御されます被曝線量 (D) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55597/55597eq1.jpg"> </img>。各露出のドットに電子ビーム住居時間は、110 μ cm− 2で被曝線量、0.5 μ s12です。配列をキャプチャ 1.8 mm2の面積は、300 μ m2分野フォーム 1 つ大きな、ゴールドのナノホール アレイに一緒にステッチの 36 パッチの合計があります。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>10 開発者向けに 4 インチのシリコンウェハーを浸すことによってレジストを開発 s とウェーハの空気で乾燥させます。</li>
		<li>シリコン基板上、金属は、ニッケル、銅、アルミニウムなどのシード層を入金します。</li>
		<li>ニッケル スルファミン酸ニッケル浴のめっきシステムでウェハを電気メッキします。2 つの手順でめっきを行います。最初の手順では、永続的な 95 分で 0.7 A dm− 2; の電流密度を使用して、これは完全にニッケル 28awd-4 を塗りつぶします。2 番目の手順では、125 分を持続させる最終的なニッケル金型厚さ 300 μ m に到達する 12 A dm− 2を使用 (20 nm)。PH 値は 3.5 3.8、52-54 ° C の温度であることを確認します。</li>
		<li>穏やかな機械的な力を適用することによって、シリコン基板からニッケル金型を区切ります。ポジ型フォトレジスト除去試薬一晩電子線レジスト残渣を洗い流すための約 100 mL でニッケル金型を浸します。</li>
		<li>3 h の 100 ° C でオーブンと乾燥、ニッケル鋳型をフィード ・ プラズマ エッチング システム 10 sccm で O2ガスと 100 W 3 分でそれをきれいに。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金ナノ構造の作製
	<ol>
		<li>コートでニッケル鋳型上の観察 1,1,2,2 偏光トリクロロシラン (FDT) の 150 μ L、80 ° C の自己組織化単分子膜 (SAM) コーティング マシン 注: これはナノイン プリントのステップの完了後 (「離」) フォトレジストから金型の分離を可能にする付着防止層を形成します。蒸発時間が 180 にする必要があります s、および反応時間は 900 をする必要があります s。</li>
		<li>28awd-4 の 4-10 バールの圧力、温度 40 ° C で 10 分間ナノ インプリンターを使用して光硬化性 NIL 300 nm 厚層を塗布したガラス基板に抵抗を捺印します。</li>
		<li>紫外線硬化システムおよび 75 mW cm-2 30 の紫外線露出に photocure ガラス基板上、フォトレジスト、金型を転送 s。 注: すべての手順に正しく従っている場合ニッケル型する必要があります簡単にする demolded フォトレジストから。</li>
		<li>反応性イオン エッチング (RIE) 装置 2 の 50 W の 10 sccm の O2ガス流れと、ガラス基板上のフォトレジストの空白 etch を実行 s インデント領域にガラスを公開します。</li>
		<li>電子ビーム蒸着機でガラス基板上にクロム (Cr) 金属接着用の 5 nm 厚層とプラズモン センサーのための金 (Au) の 100 nm 層を入金します。1 成膜速度を使用して、Cr の 2 Å の s− 1 Å s− 1 au。</li>
		<li>3 分 15 秒音声化ステップ アセトンで続いて用エッチング O2プラズマによるフォトレジストのリフトオフを実行します。</li>
		<li>サンプルを 5 mm × 5 mm チップにサイコロします。ナノホール アレイは、中央 2 mm × 2 mm のチップを占有します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>データの取得
	<ol>
		<li>白色光送信機の光ファイバーの終了を終了のビーム平行光がセンサーの表面 (ナノホール アレイ) に 90 ° で入射、光の測定を行う装置を設定します。 注: 光は全体ナノホール配列を介して送信されます。</li>
		<li>受信機光ファイバーの伝送信号を収集し、紫外可視分光計 300 に 1,000 の範囲内で動作を記録 nm。</li>
		<li>測定のノイズが低減する最終的なスペクトルを取得する 20 さん平均 100 フレームにフレームごとに集録時間を設定します。</li>
		<li>印刷ソフトウェアを使って、以前に識別された伝送のピーク (ローレンツ ベースのメソッドを使用して) に基づくデータを分析します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. センサー一括感度テスト
<ol>
	<li>1.39 に 1.31 からさまざまな RI の液晶セルに標準の RI 液体を入金します。</li>
	<li>標準の RI 液体センサー チップを浸し、白色光のビームに合わせます。透過スペクトルを得る。</li>
	<li>界面活性洗浄試薬と各データ測定後センサー チップをきれいにし窒素ガスで乾燥します。</li>
</ol>
3. センサー表面改質
<ol>
	<li>前の任意の化学修正連続脱イオン水、アセトン、イソプロパノール浸漬によってセンサー チップをきれい。乾燥窒素ガスのストリームで常温乾燥。</li>
	<li>0.4 mM 10-カルボキシ-1-複数と 1.6 mM 1-オクタンチ オール室温で 12 h のエタノール溶液にセンサー チップを孵化させなさい。 注: これは形成アミン反応性自己組織化単分子膜 (SAM)。</li>
	<li>徹底的に洗浄し、室温で乾燥エタノールを使用します。</li>
	<li>75 mM スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド (スルホ-NHS) と 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) の混合物を作る。15 分のこの混合物のチップを浸します。 注: これは SAM のカルボキシルをアクティブになります。</li>
	<li>センサー表面に pH 4.5 酢酸緩衝液で 200 μ g/mL 抗トロポニン抗体溶液 50 μ L をスポットし、30 分間インキュベートします。</li>
	<li>1 M エタノールアミン HCl 溶液中 15 分間でセンサー チップを浸すことによって未反応のエステルを非アクティブ化します。</li>
	<li>室温で乾燥窒素ガスのストリームで乾燥して脱イオン水でチップをすすいでください。</li>
</ol>
4. cTnI アッセイ
<ol>
	<li>表面に 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 溶液 100 μ L スポッティングして任意の非特異的結合をブロックします。</li></ol>15 分間インキュベートします。
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液に 3 回センサー チップをすすぐ。透過スペクトルを記録する測定セルにチップを挿入します。 注: これは参照スペクトルです。</li>
	<li>CTnI チップ表面に標準の 50 μ L をスポットし、30 分間、湿った環境で孵化させなさい。</li>
	<li>センサー チップ 3 回 PBS 溶液中をすすいで透過スペクトルを記録する測定セルに挿入します。 注: これはアフター結合スペクトルです。</li>
	<li>50 mM グリシン塩酸の (pH 2) 1 分のチップが水没し、すすぎ PBS 溶液中 3 回チップ表面を再生成します。再生のステップの成功を確認する PBS の透過スペクトルを測定します。</li>

5. 表面プラズモン共鳴 (SPR) 測定
<ol>
	<li>PBS T バッファーを用いた SPR に多重の SPR センサー チップを実行します。 注: PBS T バッファーの組成は 0.05%、150 mM の NaCl、20 mM リン酸 Na トゥイーン 20。PH は 7.4 です。</li>
	<li>手順 4 の説明に従って cTnI 標準と、抗体を使用します。</li>
	<li>EDC (0.2 M) とスルホ-NHS 5 分 50 μ g/mL の抗体 560 の 5 分の注入を実行 (0.05 M) の混合物との 1 M エタノールアミン HCl 溶液 5 分注入 6 使用可能なチャネルのうち 3 をアクティブにします。</li>
	<li>センサー チップを 90 ° 回転し、異なる濃度で cTnI 基準を注入 (75、30、7.5 2.5 ng/mL)。</li>
	<li>SPR 読み出しを介してリアルタイムでチップ上の相互作用のスポットで抗体の共役を観察します。</li>
	<li>1 分 50 mM グリシン塩酸 (pH 2) を注入することによりチップを再生成します。</li>
</ol>

<ol><li>Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6668/abs/391667a0.html">Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays.</a> Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).</li>
<li>Krishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030401801015589">Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission.</a> Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).</li>
<li>Yang, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+transmission+mediated+by+localized+plasmons+in+anisotropic%2C+three-dimensional+nanohole+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays.</a> Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., Moyer, P. J. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2355468?journalCode=apl">Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays.</a> Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).</li>
<li>Liu, H., Lalanne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+theory+of+the+extraordinary+optical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopic theory of the extraordinary optical transmission.</a> Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).</li>
<li>Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11468-009-9079-1">Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing.</a> Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).</li>
<li>Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+surface+plasmon+resonance+biosensing+with+large+area+of+gold+nanoholes+fabricated+by+nanosphere+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography.</a> Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).</li>
<li>Valsecchi, C., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+metallic+nanostructures+as+plasmonic+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors.</a> Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+nanofabrication%3A+molding%2C+printing%2C+and+other+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li>
<li>Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.200600882/abstract">Nanoimprint lithography: methods and material requirements.</a> Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).</li>
<li>Wong, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+high+yield+nanofabrication+of+precisely+designed+gold+nanohole+arrays+for+fluorescence+enhanced+detection+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers.</a> Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).</li>
<li>Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931716303975">Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication.</a> Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).</li>
<li>Wu, L., Bai, P., Li, E. P. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/josab/abstract.cfm?uri=josab-29-4-521">Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption.</a> JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).</li>
<li>Ding, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+a+cardiac+biomarker+in+human+serum+using+extraordinary+optical+transmission+%28EOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT).</a> PloS one. 10 (3), 0120974(2015).</li>
<li>Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanohole-based+surface+plasmon+resonance+instruments+with+improved+spectral+resolution+quantify+a+broad+range+of+antibody-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics.</a> Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).</li>
<li>Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+imaging+of+protein-protein+interactions+by+LSPR+detection+with+micropatterned+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles.</a> Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).</li>
</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

入射光とナノ構造の相互作用をシミュレートすると、試料の濃度の関数としてのシフトを記録できる (透過スペクトル) の適切なピークを識別することが可能になります。センサーの構造に関してバンドのローカリゼーションは試料を意味するそのシフトを追跡ことができます右のバンドを選択することが重要に注意してくださいすることが重要です。シミュレーションにより可視化を実現できます。これはまた analytes のバイオセンシングを可能にする最適構造の設計に重要です。ご覧のとおり、バンド I と III ゴールド ガラス インターフェイスのローカライズされ、したがって、バイオセンシングのため有用ではないです。著名な LSPR コンポーネントはバンド II 内部で観察できます。短いディケイの長さを示し、ナノホールの縁にローカライズされます。など、これは濃度の検出に使用されているにも適しています。全体の配列を介して作製したナノ構造体の品質が収集したスペクトルの質にも欠かせません。非一様構造は、工芸品をご紹介いたします。
散乱とやむを得ない吸収水性測定で工芸品を作成します。全体の信号雑音比も、水性媒体の存在に...

ナノホール アレイを用いた化学センサー異常な光透過 (EOT) の最初のレポートは Ebbesenら1998年1によって出版されたので多くの捜査の対象とされています。サブ波長サイズのナノホール構造体の周期的な配列に光が入射する、特定の波長の高度な転送が発生します。これには、ブロッホ波表面ポラリトン (BW SPP) および/または局所励起表面プラズモン (LSP)2と入射光のカップルとが発生します。
悪用された場合、このような周期配列を用いた、単純な基になる物理的な原則。または金属製界面近傍の分子の吸着は、ターンではスペクトルの透過帯の場所をシフト、金属との接触媒質の誘電を変更します。スペクトル自体は、ナノ工学、形状、サイズ、および分離距離3,4,5で調整できます。仕様では、EOT に基づくセンサー分子結合イベントの調査の間に特定の割り当て6,7、8を促進するスペクトルに特徴的なバンドがあります。これ市販の表面プラズモン共鳴 (SPR) プラットフォーム上の重要な利点です。
通常 EOT を利用したセンサーには、光源が平行光がセンサー面に入射するように光学的配置が含まれます。共重合体のテンプレートと干渉やナノ粒子リソグラフィーなどの大きなナノホール サーフェスを生成する技術は、再現性に乏しく9を持っています。正確に EOT 現象を示す大きな面を加工でこれらの制限により光学顕微鏡光源と検出器を適切に配置する必要があります。技術、ナノイン プリント高品質・ リソグラフィーを簡素化するには、(NIL)10が採用されました。これはチップにセンサー面を顕微鏡の必要性を削除する大規模なセンサー表面領域11 (mm スケール) の生産が可能。代わりに、このセンサーは、簡単に標準的な光ファイバケーブルと接続する可能性があります。
このナノホール アレイの伝送のピークは、可視近赤外領域 (NIR) に含まれている、ので、生体分子の水溶液環境のバインド イベントを検出に最適です。ナノホール アレイの光動作をシミュレートしました。結果は、標準屈折 (RI) の液体の研究を通じて確認されました。この配列は、心筋トロポニンの濃度を測定する使用された私 (cTnI) ひと血清の複雑背景下で。cTnI は急性心筋梗塞の診断のための臨床のゴールド スタンダードです。
このセンサーを使用して、検出し、臨床的に適切である 0.55 ng/ml 検出 (LOD) の制限でひと血清中 cTnI を定量化することが可能です。検出は、酵素免疫測定法 (ELISA) は、このドメインで最も一般的に使用される技術よりも速いです。さらに、センサー面が簡単に再生され、そのため再利用します。したがって、この作業は複雑な生体内バイオセンシングのための現実的なポイント ・ オブ ・ ケア (POC) 技術としてナノホール アレイの約束を示しています。

<table><tbody><tr><td>電子ビームリソグラフィーセットアップ</td><td>Elionix ELS 700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95662</td><td></td></tr><tr><td>EBレジスト</td><td>住友商事</td><td>NEB-22A2</td><td></td></tr><tr><td>現像試薬</td><td>Shipley Company</td><td>Microposit MF 321</td><td></td></tr><tr><td>電気めっき機</td><td>Technotrans AG RD 50</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォトレジスト剥離剤&nbsp;</td><td>ローム&ハース電子材料&nbsp;LLC</td><td>マイクロポジットリムーバー1165</td><td></td></tr><tr><td>エッチングシステム</td><td>トリオンファントム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘプタデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロデシル)トリクロロシラン&nbsp;</td><td>Gelest(ペンシルベニア州、米国)</td><td>78560-44-8</td><td></td></tr><tr><td>SAMコーター&nbsp;</td><td>株式会社ソロナ</td><td>AVC 150M</td><td></td></tr><tr><td>光硬化型NILレジスト</td><td>マイクロレジストテクノロジーGmbH</td><td>mr-UVCur21-300nm</td><td></td></tr><tr><td>光硬化システム</td><td>Dymax&nbsp;</td><td>2000年型フラッド</td><td></td></tr><tr><td>電子ビーム蒸着装置</td><td>デントンエクスプローラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外可視分光器&nbsp;</td><td>Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準屈折率液&nbsp;</td><td>Cargill Inc (Cedar Grove, USA)</td><td>18032</td><td></td></tr><tr><td>プロットソフトウェア</td><td>Origin</td><td>Origin Pro 9</td><td></td></tr><tr><td>10-carboxy-1-decanethiol&nbsp;</td><td>同人堂研究所(日本)</td><td>C385-10</td><td></td></tr><tr><td>1-オクタンチオール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>471386</td><td></td></tr><tr><td>スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド&nbsp;</td><td>BioRad (CA, USA)</td><td>1762410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-troponin antibody 560</td><td>Hytest (Finland)</td><td>4T21</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine-HCl solution</td><td>BioRad (CA, USA)</td><td>1762450</td><td></td></tr><tr><td>Surface Plasmon Resonance setup</td><td>BioRad XPR36 (Haifa, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplexed SPR chip</td><td>BioRad</td><td>GLC</td><td></td></tr><tr><td>Human cTnI standard</td><td>PhoenixPharmaceuticals</td><td>EK -311-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>BioRad (CA, USA)</td><td>1762221</td><td></td></tr></tbody></table>

ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

ポイント ・ オブ ・ ケア (POC) 設定の臨床的意義を持っているバイオセンシング プラットフォーム、アッセイの感度、再現性、およびひと血清の背景に検体を確実に監視する機能が重要です。
ナノイン プリント (NIL) リソグラフィは、センシン 1.5 mm × 1.5 mm ほど低コストで作製する使用されました。ナノホール各約 140 nm2の領域の忠実度の高い配列のセンサー面をしました。NIL の偉大な再現性では、チップに変化が少なく、12 の個別に製造面 1 チップ、1 測定戦略を採用することが可能。これらのナノイン プリントの局在表面プラズモン共鳴 (LSPR) チップが確実にこのケースでは、人間の血清の流体の複雑な背景中 75 ng/mL に 2.5 から様々 な濃度で bioanalyte を測定する能力を広範囲にわたってテスト。NIL 可能このバイオ センサーは一般に利用できる実験室光源に簡単にインターフェイスできるので、順番、顕微鏡の必要性を排除する大きなセンシング分野の世代の高忠実性。これらのバイオ センサーを検出できます心筋トロポニン血清中 0.55 ng/ml 検出 (LOD) の制限で、感度の高い臨床的に適切であります。彼らはまた低いチップ ・ ツー ・ チップの差異 (作製プロセスの高品質) を示します。結果が広く使われている酵素免疫測定法 (ELISA) とけた違い-基づいた試金が LSPR ベース センシングプラット フォーム (すなわち、こうして小型化、多重化、それを作るの利点を保持する技術現実的な POC アプリケーション)。

図 1 aに測定の光のセットアップを示します。実際ナノホール配列のイメージは図 1 bで与えられます。検出プロセスを運転の物理学を理解するため COMSOL シミュレーション ソフトウェアは水溶液環境のプラズモニック フィールド分布をシミュレートするために使用されました。シミュレーションの結果から、実際の測定に関連していた。以前に発行された研究には、仮定しシミュレーション11,13で使用するパラメーターの詳細が含まれています。ナノホール配列は次のように、プラズモニック フィールドをシミュレートするために使用される物理的な寸法: p = 400 nm、D = 150 nm、および T = 100 nm。透過スペクトルを計算するとき、吸収と散乱効果はアカウント14にも取られます。シミュレートされ...

この作業では、異常な光透過の原理で動作する高品質センシング アレイを作製するナノイン プリント リソグラフィ法について説明します。バイオ センサーが低コスト、堅牢で、使いやすいと心筋トロポニンを検出することができます私は臨床的に関連性の高い濃度 (99thパーセン タイル カットオフ ∼10 400 pg/mL、アッセイによって) 血清で。

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

本手法の全体的な目的は、複雑な生物学的流体の背景中に存在するバイオマーカーを、精巧な光学系や電気系を必要とせず、ポイントオブケア設定において臨床的に関連のある濃度で測定することです。この手法は、異常透過に基づくバイオセンサーをポイントオブケアの場面で実現させるのに役立ちます。本手法の主な利点は、複雑な電気的または光学的な装置を一切必要としないことです。我々の実験において、本手法は臨床的に重要な濃度でバイオマーカーを確実に検出することができました。センサーチップの作製はクリーンルーム内で行われるため、撮影することができません。デモンストレーションのため、ここではその手順をアニメーションで提示します。ニッケルモールドを調製するため、厚さ 600 micron の 4 インチシリコンウェハー上に、厚さ 220 nanometer のネガ型電子ビームレジストを塗布します。電子ビームリソグラフィーシステムを用いて、設計したナノホールアレイをこのウェハー上に書き込みます。電子ビームの書き込み速度を上げるため、300 micron のフィールドサイズあたり 20,000 という低密度のドットマップでパターンを書き込みます。4インチのシリコンウェハを現像液に10秒間浸し、その後ウェハを空気中で乾燥させてレジストを現像します。シリコンウェハ上に、ニッケル、銅、またはアルミニウムなどの金属のシード層を堆積させます。次に、ニッケルスルファミン酸浴を備えためっき装置を用いて、2段階でウェハを電気めっきします。緩やかな機械的力を加えて、ニッケルモールドをシリコン基板から分離します。次に、ナノインプリンターを用いて、300 nm厚の光硬化性ナノインプリントリソグラフィレジストをコーティングした4インチガラスウェーハにナノパターンを転写します。その後、モールド、フォトレジスト、およびガラスウェーハをUV光硬化システムに移し、光硬化させます。すべての手順が正しく行われていれば、ニッケルモールドはフォトレジストから容易に脱型できるはずです。ガラス基板上のフォトレジストのブランクエッチングを行った後、電子ビーム蒸着機を用いて、ガラスウェハー上に金属密着のためのクロム層と、プラズモニックセンサのための金層を堆積させます。酸素プラズマエッチングで3分間フォトレジストのリフトオフを行い、続いてアセトン中で15秒間の超音波処理を行います。次に、サンプルを5 mm × 5 mmのチップ状に切断します。ナノホールアレイは、チップ中央の2 mm × 2 mmの正方形領域に配置されます。データを取得するために、送信側光ファイバーの端から射出される白色光ビームがコリメートされ、センサー表面に90度で入射するように光学測定装置をセットアップします。光をナノホールアレイ全体に透過させます。透過信号を受信光ファイバーで収集し、300から1,000ナノメートルの範囲で動作する紫外可視分光光度計で記録します。センサーのバルク感度試験では、屈折率が1.31から1.39まで異なる標準屈折率液体をリキッドセルに注入します。センサーチップを標準屈折率液体に浸し、白色光のビームに合わせて配置します。その後、透過スペクトルを取得します。測定ごとに、界面活性剤を含む洗浄剤でセンサーチップを洗浄し、窒素ガスで乾燥させてください。センサー表面の修飾を行うため、化学修飾の前に、センサーチップをイソプロパノール、アセトン、脱イオン水の順に浸漬して洗浄します。その後、乾燥窒素ガス気流中でセンサーチップを室温で乾燥させます。次に、センサーチップをエタノール溶液中で室温にて12時間インキュベートします。これにより、アミン反応性の自己組織化単分子膜が形成されます。インキュベーション後、エタノールを用いてチップを十分に洗浄し、室温で乾燥させます。次に、75 millimolar sulfo-NHSと15 millimolar EDCの混合液にチップを15分間浸します。これにより、自己組織化単分子膜のカルボキシル基が活性化されます。次に、pH 4.5の酢酸緩衝液で調製した200 µg/mLの抗トリポネント抗体溶液を50 µL、センサー表面にスポットします。30分間インキュベートした後、センサーチップを1 MのエタノールアミンHCl溶液に15分間浸し、未反応のエステルを不活性化させます。最後に、チップを脱イオン水で洗浄し、室温で乾燥窒素ガスを吹き付けて乾燥させます。センサーチップの表面に1%牛血清アルブミン溶液を100 microlitersスポットし、非特異的結合をブロックします。15分間インキュベートします。センサーチップをリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。チップを測定セルに挿入し、透過スペクトルを記録します。これがリファレンススペクトルとなります。次に、心筋トロポニンI標準液を50 µL、チップ表面にスポットします。チップを湿潤環境で30分間インキュベートします。センサーチップをPBS溶液で3回洗浄した後、測定セルに挿入し、透過スペクトルを記録します。これが結合後のスペクトルです。次に、チップを50 millimolar glycine HCLに1分間浸し、その後PBS溶液で3回洗浄してチップ表面を再生させます。再生ステップが成功したことを確認するため、PBS中で透過スペクトルを測定します。血清中の30 ng/mLのヒト心トロポニンと相互作用した際のバイオセンサーの透過スペクトルの変化を示しています。青色のプロットは相互作用前を、赤色のプロットは相互作用後を表しています。点線の円は、追跡されているバンドを示しています。ここでは、トロポニン濃度が 2.5 nanograms per milliliter、7.5 nanograms per milliliter、30 nanograms per milliliter、および 75 nanograms per milliliter のときのバンド2の波長シフトを示しています。エラーバーは標準偏差を表しています。このプロットは、ナノホールバイオセンサチップの再生後に観察されたバンドの波長シフトを示しています。バンド2の位置が元の位置に戻ることは、再生ステップが成功したことを示しています。習得すれば、適切に実施することで1時間以内に測定が可能です。本法でバイオアナライトを測定する際は、調製したばかりの試薬を使用することが重要です。消耗品をあらかじめ分注しておいてください。このビデオを視聴することで、異常光透過の原理に基づき、複雑な背景条件下でバイオアナライトをモニタリングできるバイオセンサの作製方法について十分な理解を得られるはずです。一般的に、この手法に不慣れな方は、顕微鏡を必要とせずにチップと光ファイバをインターフェースさせることが可能となる高忠実度のナノホールアレイの作製や、再現性の高い樹脂の選定に苦労することがあります。この手法により、医療現場で極めて重要となる連続測定が可能になります。チップの作製は、測定の再現性を確保する上で大きな役割を果たします。基本プラットフォームを維持したまま、本手法のさらなる改善は、分解能を高めて感度を向上させることや、信号処理手法を用いてより高いSN比を得ることで達成されます。この技術の意義は、ポイントオブケア設定において、血清という複雑な背景の中から複数のバイオアナライトをリアルタイムでモニタリングすることへと展開されます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ひと血清における心筋バイオマーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

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