ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

この技術の全体的な目標は、複雑な体液の背景に存在するバイオマーカーを、精巧な光学的または電気的セットアップを必要とせずに、ポイントオブケア環境で臨床的に関連する濃度で測定することです。この方法は、ポイントオブケアシナリオで異常な透過に基づくバイオセンサーを現実のものにするのに役立ちます。この手法の主な利点は、複雑な電気的または光学的なセットアップを必要としないことです。

私たちの実験では、臨床的に関連性のある濃度でバイオマーカーを確実に検出することができました。センサーチップの製作はクリーンルーム内で行い、撮影することはできません。デモンストレーションのために、ここでは手順をアニメーションで表しています。

ニッケルモールドの調製のために、厚さ600ミクロンの4インチシリコンウェーハ上に、厚さ220ナノメートルの負電子ビームレジストの層をコーティングします。このウェーハ上に、設計したナノホールアレイを電子ビーム露光装置で書き込みます。電子ビームの書き込みを加速するために、300ミクロンのフィールドサイズごとに20, 000の低ドットマップでパターンを書き込みます。

レジストを現像するには、4インチのシリコンウェーハを現像液に10秒間浸漬し、ウェーハを空気中で乾燥させます。シリコンウェーハ上にニッケル、銅、アルミニウムなどの金属のシード層を堆積させます。次に、スルファミン酸ニッケル浴内のめっきシステムでウェーハを2つのステップで電気めっきします。

ニッケルモールドをシリコン基板から分離するには、穏やかで機械的な力を加えます。次に、ナノインプリンタを用いて、300ナノメートルの光硬化型ナノインプリントリソグラフィレジストを塗布した4インチのガラスウェハにナノパターンをインプリントします。モールド、フォトレジスト、ガラスウェーハをUV光硬化装置に移し、光硬化させます。

すべての手順が正しく行われていれば、ニッケルモールドはフォトレジストから簡単に離型できます。ガラスサブストレート上のフォトレジストのブランクエッチングを行った後、ガラスウェーハ上に、電子ビーム堆積装置で金属接着用のクロム層とプラズモニックセンサー用の金層を堆積させます。酸素プラズマエッチングによるフォトレジストのリフトオフを3分間行い、続いてアセトン中で15秒間のソノフィケーションステップを行います。

次に、サンプルを5mm×5mmのチップにさいの目に切ります。ナノホールアレイは、チップの中央、2ミリメートル×2ミリメートル四方を占めます。データを取得するには、送信機の光ファイバーの端から出る白色光のビームが柱状になり、センサー表面に90度入射するように光学測定を行うように装置を設定します。

光はナノホールアレイ全体を通して透過されます。送信信号を受信機の光ファイバーで収集し、300〜1, 000ナノメートルの範囲で作動する紫外可視分光計で記録します。センサーのバルク感度テストでは、屈折率が1.31から1.39まで変化する液体セルに標準の屈折率液体を堆積させます。

センサーチップを標準屈折率液に浸し、白色光線に合わせます。次に、透過スペクトルを取得します。各測定後にセンサーチップを界面活性洗浄試薬で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。

センサー表面の改質については、化学修飾を行う前に、イソプロパノール、アセトン、および脱イオン水に順次浸漬してセンサーチップを洗浄します。その後、センサーチップを乾燥窒素ガスの蒸気で室温にして乾燥させます。次に、センサーチップをエタノール溶液中で室温で12時間インキュベー

これにより、アミン反応性の自己組織化単分子膜が形成されます。インキュベーション後、エタノールを使用してチップを室温で十分にすすぎ、乾燥させます。次に、チップを75ミリモルのスルホnヒドロキシスクシンイミドと15ミリモルEDCの混合物に15分間浸します。

これにより、自己組織化単層のカルボキシリック基が活性化されます。次に、Ph 4.5アセテートバッファーで作製した200マイクログラム/ミリリットルの抗トリポネント抗体溶液のうち50マイクロリットルをセンサーの表面にスポットします。30分間インキュベートした後、センサーチップを1モルのエタノールアミンHCL溶液に15分間浸漬して、非反応性エステルを失活させます。

最後に、チップを脱イオン水ですすぎ、室温で乾燥窒素ガスの流れで乾燥させます。センサーチップの表面に100マイクロリットルの1%ウシ血清アルブミン溶液を見つけて、非特異的結合をブロックします。15分間インキュベートします。

センサーチップをリン酸緩衝生理食塩水で3回すすぎます。チップを測定セルに挿入して、透過スペクトルを記録します。これが参照スペクトルです。

次に、チップの表面に50マイクロリットルの心筋トロポニン1標準を見つけます。チップを湿った環境で30分間インキュベートします。センサーチップをPBS溶液で3回すすいだ後、測定セルに挿入して透過スペクトルを記録します。

これが結合後のスペクトルです。次に、チップを50ミリモルグリシンHCLに1分間浸し、PBS溶液で3回すすぎ、チップの表面を再生します。PBSの透過スペクトルを測定して、再生ステップの成功を確認します。

血清中のヒト心筋トロポニン1ミリリットルあたり30ナノグラムと相互作用したときのバイオセンサーの透過スペクトルの変化が示されています。青いプロットはインタラクション前を表し、赤いプロットはインタラクション後を表します。点線の円は、追跡されているバンドを示します。

ここに示されているのは、トロポニン濃度が 2.5 ナノグラム/ミリリットル、7.5 ナノグラム/ミリリットル、30 ナノグラム/ミリリットル、75 ナノグラム/ミリリットルでのバンド 2 の波長の変化を示しています。エラーバーは標準偏差を表します。このプロットは、ナノホールバイオセンサーチップの再生後に観測されたバンドの波長のシフトを示しています。

バンド 2 の位置を元の位置に戻すと、再生ステップが成功したことを示します。一度習得すれば、適切に行えば1時間で測定を行うことができます。この方法でバイオアナライトを測定する際には、調製したばかりの試薬を使用することが重要です。

消耗品は必ずお買い求めください。このビデオを見れば、並外れた光透過の原理で動作し、複雑な背景に対してバイオアナライトを監視できるバイオセンサーの製造方法について十分に理解できるはずです。一般に、この方法に不慣れな個人は、顕微鏡を必要とせずにチップを光ファイバーとインターフェースすることを可能にする高忠実度のナノホールアレイを生成することが困難であり、再現性のある樹脂を選択することで苦労するでしょう。

この技術により、医療現場で重要な連続測定を行うことができます。チップの製造は、測定の再現性を確保するのに大いに役立ちます。基本的なプラットフォームは同じままで、この手法のさらなる改善は、感度を向上させるより良い解像度の技術を使用することと、信号処理方法を使用してより良い信号対雑音比を達成することによってもたらされます。

この技術の意味するところは、ポイントオブケア環境で、血清の複雑な背景に対して複数のバイオアナライトをリアルタイムでモニタリングすることにまで及びます。