電圧クランプアフリカツメガエル蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

この記事では、マレイミド色素の代わりに蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を用いて、イオンチャネルの構造的再配列を調べる従来の電圧クランプ蛍光光度法（VCF）の強化について説明します。この手順には、 アフリカツメガエル卵母細胞DNA注入、RNA / fUAA共注入および同時電流および蛍光測定が含まれる。

この手順の全体的な目標は、Xenopus卵子で発現する膜タンパク質に蛍光非天然アミノ酸を導入し、電位クランプ蛍光測定を使用してタンパク質の機能と構造再配列を同時に決定することです。この手法は、膜タンパク質の構造機能関係の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ボルテージクランプ蛍光測定法を用いることで、構造再構成とタンパク質の機能を直接相関させることができます。

これに蛍光性非天然アミノ酸標識を追加すると、標識に関する以前の制限を克服するのに役立ちます。これはかつて、ラベリング部位のアクセシビリティと、内因性結合部位によるバックグラウンドラベリングのアクセシビリティでした。この手法の意味するところは、従来の電位クランプ蛍光測定法ではアクセスできなかったドメインをプローブできるようになったため、膜タンパク質の生物物理学的理解を深めることにつながります。

Xenopus卵子を外科的に切除した後、SOS溶液で卵子を3回洗浄します。大きくて健康な卵子を個別に選択し、注射前に抗生物質と5%ウマ血清を添加したバルト溶液で摂氏18度で少なくとも4時間インキュベートします。DNAの核内注入は、卵子を傷つけずに核に到達できるように細長い注入先を用意します。

次に、インジェクションチップにオイルを充填し、インジェクションチップをナノインジェクターデバイスに取り付けます。次に、ナノインジェクターを実体顕微鏡の下に取り付け、先端の端を鉗子で折っていきます。その後、先端の内側に気泡が溜まらなくなるまでオイルを排出します。

その後、ステレオスコープの下のパラフィルムにヌクレアーゼフリー水に1マイクロリットルあたり0.1マイクログラムのpAnapを置き、注入チップにDNAを充填します。次に、卵子を抗生物質を添加したバルト溶液を含むメッシュ入り注射皿に移します。卵子の核は動物極に位置しているため、注入先端を動物極の中心に向け、先端が動物半球の中心近くに達するように突き刺します。

次に、9.2ナノリットルのpAnap溶液を各卵子の核に注入します。その後、抗生物質と5%ウマ血清を添加した2ミリリットルのバルト溶液で卵子を18°Cで6〜24時間インキュベートし、Anap特異的tRNAおよびtRNA合成酵素の強力な発現を可能にします。さて、再度ナノインジェクターを準備しますが、今回は注入チップがDNA注入用ほど細くする必要はありません。

この点からは赤色光のみで作業し、Anapの光退色を防ぎます。1ミリモルのAnapを1マイクロリットルのAnapと1マイクロリットルのmRNAあたり1〜2マイクログラムの1マイクロリットルを直接パラフィルムに混合し、注入チップに混合溶液を充填します。膜のすぐ下の植物極に先端を突き刺し、pAnapを注入した各卵子に46ナノリットルの混合溶液を注入します。

次に、卵子を遮光箱に入れるか、フラスコをアルミホイルで包んで、卵子を光から保護します。抗生物質と5%ウマ血清を添加したバルト溶液で摂氏18度で2〜3日間インキュベートします。毎日新しいBarthの溶液と交換し、汚染を避けるために死んだ卵子を取り除きます。

このセットアップでは、カットオープン電圧クランプ装置が蛍光顕微鏡セットアップに統合されています。記録チャンバーはスライダーに取り付けられており、卵子を配置するための標準的なステレオスコープと蛍光測定を行うための顕微鏡の間を移動できます。フォトダイオード検出システムは蛍光顕微鏡のCマウント出口ポートに接続され、光電流の読み出しはデジタル信号プロセッサの2番目の入力チャンネルに接続されます。

蛍光励起の光源として、100ワット、12ボルトのハロゲンランプが使用されます。励起は、励起光源と顕微鏡の間の機械式シャッターによって制御されます。アクティベーションは、記録ソフトウェアでタイミングが調整されたデジタルシグナルプロセッサからのTTLパルスを介してトリガーされ、記録開始の約100ミリ秒前にシャッターが開き、フィルターキューブタレットに適切なフィルターキューブが必要になります。

2色VCFの場合、調製した卵子を標識溶液中の5マイクロモルTMRマレイミドで15分間インキュベートし、記録直前に行います。次に、卵子を標識溶液で3回洗浄し、余分な色素を取り除いてから記録します。この時点で、タンパク質は2つの異なる蛍光色素で特異的に標識されます。

卵子を装着した後、動物用ポールを上に向けて透過処理し、チャンバーを顕微鏡にスライドさせ、4倍対物レンズを使用して卵子に焦点を合わせます。次に、電位感知V1電極で卵子を突き刺します。次に、40X水浸対物レンズに切り替えます。

上を向いている動物のポールに焦点を合わせます。その後、赤いライトを消灯します。フィルターキューブタレットとフォトダイオードに接続された光出口ポートを回して、Anapフィルターキューブを選択します。

その後、ハロゲンランプを最高輝度で点灯し、シャッターを2〜5秒間開けて、卵子に由来する背景蛍光強度を読み取ります。その後、clをオンにしますamp、バス/ガードスイッチをアクティブに切り替え、ヘッドステージのノブを回して膜電位をコマンド電位に調整します。続いて、記録ソフトウェアでパルスの保持電位、ステッププロトコル、数、および長さを選択します。

次に、電圧依存電流とAnap蛍光強度を記録します。2色VCFの場合は、キューブタレットを回してTMRフィルターキューブを選択します。Anapについて説明したように、TMRのバックグラウンド蛍光を読み取り、電圧依存電流とTMR蛍光強度を同時に記録します。

この図は、Shaker変異体を発現する同じ卵子から得られたステッププロトコールを用いたAnapおよびTMR蛍光シグナルを示しています。L382ストップW434Fバックグラウンドに外部溶液からアクセス可能なシステインを添加し、TMRマレイミドで標識することにより、同じタンパク質の異なる領域でのリアルタイムな動きを同時にプローブすることが可能になります。蛍光電圧の関係は、電圧に対する定常状態の蛍光強度をプロットすることによって得られます。

このビデオを見れば、蛍光性の非天然アミノ酸をXenopusの卵子に発現させる方法と、1色または2色の電位クランプ蛍光測定を行う方法についてよく理解できるはずです。この技術を習得すると、従来の電気生理学実験とほぼ同じくらいの時間がかかるはずですが、卵子の核にDNAを注入する追加のステップがあります。この手順を試みるときは、不自然なアミノ酸がない場合に漏れ発現を確認することを忘れないでください。

これは、リーク発現の量がタンパク質内の終止コドンの挿入部位に依存するため、すべての突然変異に対して行う必要があります。この技術により、研究者は、多くの調節メカニズムが起こるタンパク質の細胞質部位の立体構造変化を研究することができるようになりました。