電圧クランプ

この手順の全体的な目的は、Xenopus oocyte（アフリカツメガエル卵母細胞）で発現させた膜タンパク質に蛍光性非天然アミノ酸を導入し、ボルテージクランプ蛍光光度法を用いて、タンパク質の機能と構造変化を同時に決定することです。この手法は、膜タンパク質の構造・機能相関の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。ボルテージクランプ蛍光光度法を用いることで、構造変化とタンパク質機能を直接的に相関させることができます。

蛍光性非天然アミノ酸標識を導入することで、従来の標識における制限を克服することが可能になりました。具体的には、標識部位への到達可能性や、内因性結合部位によるバックグラウンド標識などの問題です。この技術の意義は、従来の電位固定蛍光計測法では到達できなかったドメインのプローブ解析が可能になったことで、膜タンパク質の生物物理学的理解を深められる点にあります。

アフリカツメガエル（Xenopus）の卵母細胞を外科的に採取した後、SOS溶液で卵母細胞を3回洗浄します。大きく健康な卵母細胞を個別に選び、注入前に、抗生物質と5%馬血清を添加したBarth溶液中で18 °Cで少なくとも4時間インキュベートします。DNAの核内注入を行う場合は、卵母細胞を損傷させることなく核に到達できるよう、細長く鋭い注入チップを準備してください。

次に、注入チップにオイルを満たし、ナノインジェクター装置に注入チップを取り付けます。続いて、実体顕微鏡下でナノインジェクターを設置し、ピンセットでチップの先端を折ります。その後、チップの先端内に気泡が残らなくなるまで、オイルを排出します。

続いて、実体顕微鏡下でParafilm上にnuclease-free waterで調製した0.1 µg/µLのpAnapを1 µL滴下し、注入チップにDNAを満たします。次に、抗生物質を添加したBarth溶液が入ったメッシュ付き注入ディッシュに卵母細胞を移します。卵母細胞の核は動物極に位置しているため、注入チップを動物極の中心に向け、チップの先端が動物半球の中心付近に達するように刺入します。

次に、pAnap溶液9.2 nanolitersを各卵母細胞の核に注入します。その後、抗生物質と5% horse serumを添加した2 millilitersのBarth's solution中で、18 degrees Celsiusで6〜24時間インキュベートし、Anap特異的なtRNAおよびtRNA合成酵素を十分に発現させます。ここで再びナノインジェクターを準備しますが、今回は注入用チップをDNA注入時ほど細くする必要はありません。

ここからは、Anapの光退色を防ぐため、赤色光の下でのみ作業を行ってください。1 mM Anapを1 µLと、1〜2 µg/µLのmRNAを1 µLをParafilm上で直接混合し、その混合溶液を注入チップに充填します。チップを膜直下の植物極に刺し、pAnapを注入する各卵細胞に混合溶液を46 nL注入します。

次に、卵母細胞を遮光ボックスに入れるか、フラスコをアルミホイルで包んで光から保護します。抗生物質と5%馬血清を添加したBarth溶液中で、18 °Cで2〜3日間インキュベートします。Barth溶液は毎日新鮮なものに交換し、コンタミネーションを防ぐために死滅した卵母細胞を除去してください。

このセットアップでは、切開された電圧クランプ装置が蛍光顕微鏡セットアップに組み込まれています。記録チャンバーはスライダー上に設置されており、卵細胞を配置するための標準的な実体顕微鏡と、蛍光測定を行うための顕微鏡の間で移動させることができます。フォトダイオード検出システムが蛍光顕微鏡のCマウント出口ポートに接続されており、光電流の読み出し値はデジタル信号プロセッサの2番目の入力チャンネルに接続されています。

蛍光励起の光源として、100W、12Vのハロゲンランプを使用します。励起は、励起光源と顕微鏡の間に設置されたメカニカルシャッターによって制御されます。アクティベーションは、デジタル信号プロセッサからのTTLパルスを介してトリガーされます。このパルスは記録ソフトウェア内でタイミング調整されており、記録開始の約100ミリ秒前にシャッターが開くよう設定されています。また、フィルターキューブタレットに適切なフィルターキューブが装着されている必要があります。

2色VCFを行う場合は、記録の直前に、調製した卵母細胞を5 µM TMR maleimideを含む標識溶液中で15分間インキュベートします。その後、記録前に標識溶液で卵母細胞を3回洗浄し、過剰な色素を除去します。この時点で、タンパク質は2種類の異なる蛍光色素で特異的に標識されています。

卵母細胞を動物極が上を向くように固定し、透過処理を行った後、チャンバーを顕微鏡にスライドさせ、4倍対物レンズを用いて卵母細胞に焦点を合わせます。次に、電圧感知V1電極で卵母細胞を刺入します。その後、40倍水浸対物レンズに切り替えます。

上を向いている動物極に焦点を合わせます。その後、赤色灯を消します。フィルターキューブ回転盤とフォトダイオードに接続された光学出力ポートを回して、Anapフィルターキューブを選択します。

次に、ハロゲンランプを最大強度で点灯させ、シャッターを2〜5秒間開いて、卵細胞由来の背景蛍光強度を測定します。その後、クランプをオンにし、バス/ガードスイッチを「active」に切り替え、ヘッドステージのノブを回して膜電位をコマンド電位に調整します。続いて、記録ソフトウェアで保持電位、ステッププロトコル、パルス数およびパルス幅を選択します。

次に、電圧依存性電流とAnapの蛍光強度を記録します。2色VCFの場合、キューブタレットを回してTMRフィルターキューブを選択します。Anapで行った手順と同様にTMRのバックグラウンド蛍光を測定し、電圧依存性電流とTMRの蛍光強度を同時に記録します。

この図は、Shaker変異体を発現する同一の卵母細胞を用いてステッププロトコルにより得られたAnapおよびTMRの蛍光信号を示しています。L382ストップW434F背景に、外部溶液からアクセス可能なシステインを導入し、TMRマレイミドで標識することで、同一タンパク質の異なる領域におけるリアルタイムの動きを同時にプローブすることが可能です。蛍光電圧関係は、定常状態の蛍光強度を電圧に対してプロットすることで得られます。

このビデオを視聴することで、Xenopus卵母細胞に蛍光性非天然アミノ酸を発現させる方法、および1色または2色のボルテージクランプ蛍光測定法を実施する方法について十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、従来の電気生理学実験とほぼ同等の時間を要しますが、卵母細胞の核にDNAを注入するという追加の手順が必要になります。この手順を行う際は、非天然アミノ酸が存在しない状態でのリーク発現を確認することが重要であることを忘れないでください。

リーク発現量は、タンパク質内でのストップコドンの挿入部位によって異なるため、すべての変異についてこの操作を行う必要があります。この手法により、多くの制御機構が機能するタンパク質の細胞質側における構造変化を研究することが可能になります。