Name: 神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ神経筋疾患のマウスモデルにおける呼吸筋活動と換気の繰り返し測定法。テレメトリーと筋電図を用いて、ALS進行中の自由に行動するマウスで呼吸機能を評価し、補償メカニズムを解明する。

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<li>Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+electrocardiogram+signal+from+surface+EMG+recordings+using+non-linearly+scaled+wavelets%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets).</a> J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).</li>
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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

ここに示された手順は同じ動物で何ヶ月にわたる呼吸筋の活動と換気の（送信機の初期外科的移植後の）非侵襲的な測定が可能になります。この技術は、麻酔したマウスにおける標準EMG技術に勝るいくつかの利点を有する：1）実験は、より少ないマウスを必要とし）の代わりに、異なる疾患段階で複数のマウスを使用する（病期を横切る単一のマウスに同じサイトからのデータを記録する能力を提供します。 2）データの解析は、より強力な統計的検定（ すなわち、代わりに別の実験群を比較する反復測定を使用して）を行うことができます。 3）EMGとWBPの同時録画は、換気のARMの活動の影響を直接評価することができます。そして4）実験は、睡眠/覚醒の異なる状態でマウスで実行することができます。健康なマウスが静止してARMの試合の非常に低い周波数を持っているので、また、この技術は、CAです病気10の初期の症候性段階でALSモデルマウスにおけるARM活動の周波数における小さな変化を検出するpable。この技術は実験的に制御強度で自然な行動時の筋線維の大きいが、未知の数の活動ではなく、以下の神経刺激を測定しかし、それは...

アクセサリー呼吸筋（腕が）高い需要（ 例えば、運動）の時代に換気を高め、絞り機能が損傷または疾患1、2次危険にさらされたとき、換気を維持するのに役立ちます。絞り機能の変化は十分にはるかに少ない筋萎縮性側索硬化症（ALS）の患者およびマウスモデル3、4、5、6、に記載されているが、ALSにおけるアームの活性または機能について知られています。しかし、一つの研究腕を募集ALS患者がないではない7と同様のダイヤフラム不全のものより良好な予後を持っていることが示唆されました。また、ARM活性がダイヤフラム麻痺8の場合には呼吸するのに十分です。これらの研究は、ARMの機能を強化するための戦略がbreathiを向上させる可能性があることを示します神経筋疾患、脊髄損傷、または絞り機能が損なわれている他の条件を患っている患者ではNG。しかし、呼吸のためのARM動員を制御するメカニズムは不明な点が多いです。病気や怪我の動物モデルで時間をかけて呼吸機能およびARM活性の変化を測定するための方法は、アームが募集されている方法を研究するだけでなく、ARM動員および換気を改善するための治療法を評価するために必要とされています。また、絞り機能の進行性の喪失と一致アームの増加した活性は、ALS 7、9、10のような神経筋疾患における疾患進行のために有用なバイオマーカーであり得ます。 このプロトコルは、（最初​​の手術後）非侵襲的にする方法を説明して繰り返し目覚め、行動マウスで呼吸筋や換気の活性を測定します。筋電の同期化の録音Y（EMG）、全身プレチスモグラフィー（WBP）、およびビデオは研究者は、ARM活性衝撃換気のどの変化を評価するために、被写体が静止し、または移動しているときを決定することを可能にします。この方法の主な利点は、EMGを測定するためのいくつかの代替方法は、麻酔を必要とする、および/または端末の手順11、12、13であるのに対し、それは、覚醒、行動マウスで行うことができることです。経時的な覚醒マウスにおけるEMG活動の記録は、マウスを捕捉システム14、15にワイヤにより係留されるEMGリードの慢性注入によって達成されてもよいです。マウスを係留する通常の移動や動作に干渉する可能性があり、標準のプレチスモグラフィーチャンバーと互換性がないため、記載された方法は、無線で収集システムにEMG信号を送信する遠隔測定装置を使用します。送信することができますバッテリ電力を節約するために磁石をオンまたはオフにし、数ヶ月にわたってEMG活動の繰り返し測定を可能にします。このプロトコルは、容易に異なる筋肉につながるEMGを挿入することによって、追加の呼吸器または非呼吸筋の活動を測定するように適合させることができます。あるいは、2点のリードの一方はスリープ状態を評価するために、または発作活動16を識別するために、EEG活性を測定するために使用することができます。この技術は、正常ALSのマウスモデルにおける疾患の進行を通して、安静時のARM活性の変化を測定し、健康なマウス10でARMの活動を駆動する重要な神経細胞を識別するために使用されてきました。

<table><tbody><tr><td>B6.CG-TG (SOD1*G93A)1 Gur/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>プレチスモグラフィーチャンバー</td><td>Buxco 呼吸器製品/データサイエンス インターナショナル</td><td>601-1425-001</td><td></td></tr><tr><td>テレメトリーレシーバー (モデル RPC-1)</td><td>データサイエンスインターナショナル</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>バイアスフローポンプ (モデルBFL0500)</td><td>データサイエンスインターナショナル</td><td>601-2201-001</td><td></td></tr><tr><td>ACQ-7000 USB</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-P3P-7002XS</td><td></td></tr><tr><td>Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix</td><td>Data Sciences International</td><td>271-0117-001</td><td></td></tr><tr><td>New Ponemah Analysis System</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-POST-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Ponemah Physiology Platform Acquisition software v5.20</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-P3P-520</td><td></td></tr><tr><td>Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-URP100W</td><td></td></tr><tr><td>Configured Ponemah Software System</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-P3P-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Analysis Module (URP)</td><td>Data Sciences International</td><td>PNM-URP100W</td><td></td></tr><tr><td>Universal Amplifier</td><td>Data Sciences International</td><td>13-7715-59</td><td></td></tr><tr><td>Sync Board</td><td>Data Sciences International</td><td>271-0401-001</td><td></td></tr><tr><td>Sync Cable</td><td>Data Sciences International</td><td>274-0030-001</td><td></td></tr><tr><td>トランスデューサー圧力 Buxco</td><td>Data Sciences International</td><td>600-1114-001</td><td></td></tr><tr><td>Flow Meter</td><td>Data Sciences International</td><td>600-1260-001</td><td></td></tr><tr><td>F20-EETスターターキット</td><td>に含まれるマグネットとラジオData Sciences International</td><td>276-0400-001</td><td></td></tr><tr><td>Axis P1363 ビデオカメラ&nbsp;&nbsp;</td><td>Data Sciences International</td><td>275-0201-001</td><td></td></tr><tr><td>Terg-A-Zyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-821-785</td><td>酵素洗剤</td></tr><tr><td>Actril</td><td>Minntech Corporation</td><td>78337-000</td><td>化学滅菌</td></tr><tr><td>立体解剖顕微鏡 (モデル MEB126)</td> <td>ライカ</td><td>10-450-508</td><td></td></tr><tr><td>サーボ制御加湿器/乳児保育器</td><td>オーメダ オハイオケアプラス</td><td>6600-0506-803</td><td></td></tr><tr><td>TL11M2-F20-EETトランスミッターデータ</td><td>サイエンスインターナショナル</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#2椎弓切除鉗子-標準チップ/ストレート/ 12 cm(x2)&nbsp;</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>11223-20</td><td>ワイヤーの取り扱い用</td></tr><tr><td>デュモン #2 椎弓切除鉗子 - 標準チップ/ストレート/12 cm (x2)</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>11223-20</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ナローパターン鉗子-鋸歯状/湾曲/12 cm</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>17003-12</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ - タフカット/ストレート/シャープ/12.5 cm/6 mm カッティングエッジ</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>組織分離ハサミ - ストレート/ブラント-ブラント/11.5 cm</td><td>ファイン サイエンティフィック インスツルメンツ</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>ファイン ハサミ - タフ カット/カーブ/シャープ - シャープ/9 cm&nbsp;</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>14058-11</td><td>ワイヤーの切断と爪の切り取り用</td></tr><tr><td>メスハンドル #3</td><td>世界の精密機器</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>ファインサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>10010-00</td><td>リードキャップの準備用</td></tr><tr><td>ポリソーブ編組吸収性縫合</td>糸 <td>コビデン</td><td>D4G1532X</td><td>送信機のリード線を巻くため</td></tr><tr><td>グルチャー&nbsp;</td><td>株式会社ゾエティス</td><td>6606-65-1</td><td>シアノアクリレート接着剤</td></tr><tr><td>3 mL シリング スリップ チップ - Soft</td><td>Vitality Medical</td><td>118030055</td><td></td></tr><tr><td>25 G 針 (x2)</td><td>Becton Dickinson and Co.</td><td>305-145</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ アプリケーター</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>100-9175</td><td></td></tr><tr><td>アンディス イージーカット バリカンセット</td><td>アンディス</td><td>049-06-0271</td><td>電気カミソリ ターゲットで販売</td></tr><tr>イ<td>ソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>29404</td><td>麻酔&nbsp;</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール70%</td><td>プライオリティケア1</td><td>MS070PC</td><td></td></tr><tr><td>デルマクロル2%メディカルスクラブ(クロロヘキシジン2%)</td><td>バトラーシャイン</td><td>55482</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液ヘン</td><td>リーシャインアニマルヘルス</td><td>48272</td>潤滑剤眼<td>軟膏</td></tr><tr><td>真空グリース</td>ダ<td>ウコーニングコーポレーション</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターブランケット</td><td>JorVet</td><td>JOR784BN</td><td></td></tr></tbody></table>

神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

アクセサリー呼吸筋は、絞り機能が損なわれたときに換気を維持するのに役立ちます。同時に、非麻酔に換気を測定しながら以下のプロトコルは、自由にマウスを行動、アクセサリー呼吸筋活動の数週間または数ヶ月にわたって繰り返し測定するための方法を記載しています。技術は、無線送信機の外科的移植を含み、電極の挿入は、これらの吸息筋の筋電活動を測定するために斜角と僧帽筋につながります。換気は、全身プレチスモグラフィにより測定され、動物の動きを映像によって評価され、筋電図活動と同期しています。筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルにおける筋活動と換気の測定は、このツールは、時間の経過とともにどのように呼吸筋活動の変化を調査するために使用することができ、換気の筋活動の影響を評価する方法を示すために提示されています。記載されている方法は、電子ことができますasily他の筋肉の活性を測定したり、病気やけがの追加のマウスモデルに付属呼吸筋の活動を評価するために適合させます。

記載されたプロトコルは、遠隔測定装置を移植すると、SOD1（G93A）ALSモデルマウスの斜角と僧帽EMG、WBP、およびビデオを記録するために使用しました。動物が非アクティブである期間（ 例えば、移動しません）ビデオ録画を使用して識別し、WBPトレース（ 図3A）における運動関連活性の欠如によって確認されました。非アクティブ期間は、REMまたは非REM睡眠に費やされる時間、ならびに時間まだ起き費やさなく（ 図3A）が挙げられます。この非アクティブ時間の間EMG活性は、少なくとも3の連続する整流及び統合（30以上MS）値は、ベースラインEMGレベルよりも少なくとも50％増加した（ 図4）と振幅を持っていた試合のように採点しました。 （映像によって評価）（プレチスモグラフィーにより測定）ため息又はスニッフィング中に発生した活性の発作、または随意運動を解析（ 図3B-C）から除外しました。 EAのSOD1（G93A）マウス半...

本稿では、移植された遠隔測定装置を介して全身プレチスモグラフィと電と疾患の進行を自由に行動、筋萎縮性側索硬化症（ALS）のマウスモデルにおいて換気および呼吸筋活動の繰り返し測定のための方法を紹介します。

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

本手順の全体的な目的は、疾患の進行に伴い、呼吸筋活動と換気量を繰り返し測定することです。これは、選択した筋肉に筋電図リードを挿入したテレメトリーデバイスを外科的に植え込んだ後に行われます。この手法を用いることで、疾患や外傷による横隔膜機能の低下に対し、補助呼吸筋がどのように補完的に作用するかという重要な疑問を明らかにすることができます。この手法の主な利点は、疾患の進行を通じて、同一の自由行動下のマウスにおいて換気量と呼吸筋活動を測定できることです。本法はALSの診断および治療に関する知見を提供できるだけでなく、他の神経筋疾患や脊髄損傷のモデルにも適用可能です。まず、EMG電極リードを準備します。電線専用のハサミを使用して遠位リードをトリミングし、標的筋肉まで届くようにリードを約3 cm残します。次に、メスを使用して、電線自体を切断しないように注意しながら、プラスチック被覆を0.5 cm剥がします。その後、電線処理工具を用いて、リードの端を元の長さの4〜5倍に伸ばします。リードの露出したワイヤーを、長さ0.5 centimetersになるようにカットします。次に、あらかじめ取り外しておいたプラスチックケーシングから0.25 centimeterのチューブを切り出し、ワイヤー端を覆うためのリードキャップを用意します。マウスに麻酔をかけた後、足指および尾部を挟み、反応がないことを確認して、マウスが完全に麻酔状態にあることを確かめてください。その後、マウスを手術セットに移動させ、手術中に麻酔を維持するためにノーズコーンを装着します。手術中に目が乾燥するのを防ぐため、眼用潤滑剤（眼軟膏）を塗布します。回復過程において、マウスがリードを抜いたり、引っ掻いて傷を作ったりする可能性を減らすため、手術部位と同側の爪を切ります。マウスの耳と肩の間の手術部位を剃毛します。次に、手術部位を消毒剤とイソプロパノールで交互にスワブします。植え込みを開始するために、前肢を同側の足の方へ引き、肩甲骨を尾側に移動させ、斜角筋および僧帽筋への手術経路を確保します。鈍的な曲がったピンセットを用いて、手術部位と同側の前肢を後方に保持し、テープで固定します。新しいサージカルグローブに交換した後、メスを使用して肩から耳にかけて2 cmの斜切開を加えます。次に、両手にラミネクトミーピンセットを持ち、脂肪体を引き戻し、僧帽筋と広頸筋を広げて、胸鎖乳突筋と斜角筋を覆う筋膜を露出させます。淡色の胸鎖乳突筋と横隔神経を指標にして、斜角筋を特定します。横隔神経は斜角筋と並行に走行し、胸鎖乳突筋はそれより下方に位置することに注意してください。斜角筋は、僧帽筋の下で頸椎から肋骨に向かって斜めに走行しています。生体電位リードを前斜角筋に挿入します。前斜角筋は横隔神経に隣接して走行する筋肉として識別できます。次に、組織剥離用剪刀の先端をマウスの皮膚下に挿入し、送信機の幅よりもわずかに大きなポケットが形成されるまで広げて、送信機用のポケットを作成します。ポケット内を温めた滅菌生理食塩水で洗浄してください。次に、平らな面を筋肉に接するようにして送信機を挿入します。送信機が平らに配置され、電線がねじれることなく、ポケットから互いに平行に出るように位置を調整してください。送信機から斜角筋および僧帽筋までリード線を伸ばし、2組の生体電位リード線が互いに平行に、平らに配置されるようにします。次に、椎弓切除鉗子を用いて、前斜角筋を周囲の筋肉から分離します。その後、25ゲージの針を斜角筋の筋線維に対して垂直に刺入します。針の先端にリード線を1本挿入し、針を筋肉から引き抜きます。このとき、リード線の絶縁体までが筋肉内に留まるようにしてください。どの色のリードをどの筋肉に挿入したかを記録します。リードへの接着剤の塗布を容易にするため、21ゲージの針にシアノアクリレート系接着剤を1滴つけます。次に、リードが挿入されている筋肉に近い電線の露出端に接着剤を塗布します。リードキャップをワイヤーに沿って素早くスライドさせ、リードキャップと筋肉の間にワイヤーが露出しないようにします。キャップより遠位側の余分なワイヤーをカットし、リードキャップとワイヤーの末端にシアノアクリレート接着剤を1滴塗布します。固定を解除する前に、接着剤が重合するまで時間を置きます。次に、同じ筋肉内の最初のリードと平行に、反対極性のリードを同様の手順で挿入します。このリードは、最初のリードから1〜2mm離して配置してください。ここに示すように、斜角筋のすぐ前方に位置する僧帽筋にリードを挿入する手順を繰り返します。次に、ワイヤリードが固定されていること、および動物がリードを引っ張ることなく身体を動かせるだけの十分な余裕があることを確認します。その後、前肢を固定しているテープを慎重に剥がします。脂肪組織を筋肉の上に引き戻し、挿入したリードを覆います。次に、切開線が一致するように皮膚フラップを慎重に寄せ合わせます。湾曲鉗子で皮膚フラップの一部をつまみ、そのラインに沿ってシアノアクリレート系接着剤を少量塗布します。動物がまだ麻酔下にある間に、術後の疼痛を緩和させるため、カルプロフェン 0.1 milliliters を皮下注射します。動物をノーズコーンから取り出し、動物が覚醒してケージ内を自発的に動き回るまで、あらかじめ加温しておいたインキュベーター内の清潔なケージに入れます。EMGおよびプレチスモグラフィーを記録する前に、マウスをプレチスモグラフィーチャンバーに少なくとも1時間入れて順化させます。記録を開始する前で校正を終えた後、埋め込み済みの動物から1インチ以内に強力な磁石を近づけて、送信機をオンにします。レシーバー前面の赤色ランプが点灯すると、トランスミッターがオンの状態であることを示します。「Acquisition」と表記されたプルダウンメニューから「Start Acquisition」を選択し、データ収集を開始してください。記録時間は実験によって異なりますが、一般的なプレチスモグラフおよびEMGの記録時間は1〜3時間です。データ収集が完了したら、マグネットを用いて送信機をオフにし、動物をホームケージに戻します。以下は、生後98日目の発症前SOD-1(G93A)マウスから得られた、斜角筋および僧帽筋のWBPおよびEMG波形です。動物が安静状態にある期間を解析に使用します。赤枠内は、発症前のマウスに特徴的な、EMGバーストを伴わない安静時のEMG波形を示しています。赤枠外の波形は、動物が移動している際に典型的に見られる、プレチスモグラフィー波形、筋活動、およびEMG波形における大きく不規則なピークを示しています。この画像は、生後126日の発症したSOD-1(G93A)マウスにおいて、安静時にEMGバーストが認められた際のWBPおよび僧帽筋のEMG波形を示しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、35分で完了させることができます。本手順に従ってインプラントを装着した動物を用いることで、疾患または外傷モデルにおける副呼吸筋活性を向上させる薬剤の有効性を評価することが可能になります。

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Medicine

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