神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定

本手順の全体的な目的は、疾患の進行に伴い、呼吸筋活動と換気量を繰り返し測定することです。これは、選択した筋肉に筋電図リードを挿入したテレメトリーデバイスを外科的に植え込んだ後に行われます。この手法を用いることで、疾患や外傷による横隔膜機能の低下に対し、補助呼吸筋がどのように補完的に作用するかという重要な疑問を明らかにすることができます。

この手法の主な利点は、疾患の進行を通じて、同一の自由行動下のマウスにおいて換気量と呼吸筋活動を測定できることです。本法はALSの診断および治療に関する知見を提供できるだけでなく、他の神経筋疾患や脊髄損傷のモデルにも適用可能です。まず、EMG電極リードを準備します。

電線専用のハサミを使用して遠位リードをトリミングし、標的筋肉まで届くようにリードを約3 cm残します。次に、メスを使用して、電線自体を切断しないように注意しながら、プラスチック被覆を0.5 cm剥がします。その後、電線処理工具を用いて、リードの端を元の長さの4〜5倍に伸ばします。

リードの露出したワイヤーを、長さ0.5 centimetersになるようにカットします。次に、あらかじめ取り外しておいたプラスチックケーシングから0.25 centimeterのチューブを切り出し、ワイヤー端を覆うためのリードキャップを用意します。マウスに麻酔をかけた後、足指および尾部を挟み、反応がないことを確認して、マウスが完全に麻酔状態にあることを確かめてください。

その後、マウスを手術セットに移動させ、手術中に麻酔を維持するためにノーズコーンを装着します。手術中に目が乾燥するのを防ぐため、眼用潤滑剤（眼軟膏）を塗布します。回復過程において、マウスがリードを抜いたり、引っ掻いて傷を作ったりする可能性を減らすため、手術部位と同側の爪を切ります。

マウスの耳と肩の間の手術部位を剃毛します。次に、手術部位を消毒剤とイソプロパノールで交互にスワブします。植え込みを開始するために、前肢を同側の足の方へ引き、肩甲骨を尾側に移動させ、斜角筋および僧帽筋への手術経路を確保します。

鈍的な曲がったピンセットを用いて、手術部位と同側の前肢を後方に保持し、テープで固定します。新しいサージカルグローブに交換した後、メスを使用して肩から耳にかけて2 cmの斜切開を加えます。次に、両手にラミネクトミーピンセットを持ち、脂肪体を引き戻し、僧帽筋と広頸筋を広げて、胸鎖乳突筋と斜角筋を覆う筋膜を露出させます。

淡色の胸鎖乳突筋と横隔神経を指標にして、斜角筋を特定します。横隔神経は斜角筋と並行に走行し、胸鎖乳突筋はそれより下方に位置することに注意してください。斜角筋は、僧帽筋の下で頸椎から肋骨に向かって斜めに走行しています。

生体電位リードを前斜角筋に挿入します。前斜角筋は横隔神経に隣接して走行する筋肉として識別できます。次に、組織剥離用剪刀の先端をマウスの皮膚下に挿入し、送信機の幅よりもわずかに大きなポケットが形成されるまで広げて、送信機用のポケットを作成します。ポケット内を温めた滅菌生理食塩水で洗浄してください。

次に、平らな面を筋肉に接するようにして送信機を挿入します。送信機が平らに配置され、電線がねじれることなく、ポケットから互いに平行に出るように位置を調整してください。送信機から斜角筋および僧帽筋までリード線を伸ばし、2組の生体電位リード線が互いに平行に、平らに配置されるようにします。

次に、椎弓切除鉗子を用いて、前斜角筋を周囲の筋肉から分離します。その後、25ゲージの針を斜角筋の筋線維に対して垂直に刺入します。針の先端にリード線を1本挿入し、針を筋肉から引き抜きます。このとき、リード線の絶縁体までが筋肉内に留まるようにしてください。

どの色のリードをどの筋肉に挿入したかを記録します。リードへの接着剤の塗布を容易にするため、21ゲージの針にシアノアクリレート系接着剤を1滴つけます。次に、リードが挿入されている筋肉に近い電線の露出端に接着剤を塗布します。

リードキャップをワイヤーに沿って素早くスライドさせ、リードキャップと筋肉の間にワイヤーが露出しないようにします。キャップより遠位側の余分なワイヤーをカットし、リードキャップとワイヤーの末端にシアノアクリレート接着剤を1滴塗布します。固定を解除する前に、接着剤が重合するまで時間を置きます。

次に、同じ筋肉内の最初のリードと平行に、反対極性のリードを同様の手順で挿入します。このリードは、最初のリードから1〜2mm離して配置してください。ここに示すように、斜角筋のすぐ前方に位置する僧帽筋にリードを挿入する手順を繰り返します。

次に、ワイヤリードが固定されていること、および動物がリードを引っ張ることなく身体を動かせるだけの十分な余裕があることを確認します。その後、前肢を固定しているテープを慎重に剥がします。脂肪組織を筋肉の上に引き戻し、挿入したリードを覆います。

次に、切開線が一致するように皮膚フラップを慎重に寄せ合わせます。湾曲鉗子で皮膚フラップの一部をつまみ、そのラインに沿ってシアノアクリレート系接着剤を少量塗布します。動物がまだ麻酔下にある間に、術後の疼痛を緩和させるため、カルプロフェン 0.1 milliliters を皮下注射します。

動物をノーズコーンから取り出し、動物が覚醒してケージ内を自発的に動き回るまで、あらかじめ加温しておいたインキュベーター内の清潔なケージに入れます。EMGおよびプレチスモグラフィーを記録する前に、マウスをプレチスモグラフィーチャンバーに少なくとも1時間入れて順化させます。記録を開始する前で校正を終えた後、埋め込み済みの動物から1インチ以内に強力な磁石を近づけて、送信機をオンにします。

レシーバー前面の赤色ランプが点灯すると、トランスミッターがオンの状態であることを示します。「Acquisition」と表記されたプルダウンメニューから「Start Acquisition」を選択し、データ収集を開始してください。記録時間は実験によって異なりますが、一般的なプレチスモグラフおよびEMGの記録時間は1〜3時間です。

データ収集が完了したら、マグネットを用いて送信機をオフにし、動物をホームケージに戻します。以下は、生後98日目の発症前SOD-1(G93A)マウスから得られた、斜角筋および僧帽筋のWBPおよびEMG波形です。動物が安静状態にある期間を解析に使用します。

赤枠内は、発症前のマウスに特徴的な、EMGバーストを伴わない安静時のEMG波形を示しています。赤枠外の波形は、動物が移動している際に典型的に見られる、プレチスモグラフィー波形、筋活動、およびEMG波形における大きく不規則なピークを示しています。この画像は、生後126日の発症したSOD-1(G93A)マウスにおいて、安静時にEMGバーストが認められた際のWBPおよび僧帽筋のEMG波形を示しています。

この手法を習得し、適切に実施すれば、35分で完了させることができます。本手順に従ってインプラントを装着した動物を用いることで、疾患または外傷モデルにおける副呼吸筋活性を向上させる薬剤の有効性を評価することが可能になります。