Name: 慢性外傷性脳症モデルの新しい方法ショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエを用いた慢性外傷性脳症モデルの構築法。調整可能な衝撃装置で頭部に直接反復的な衝撃を与え、神経変性のメカニズムを研究します。この手法は神経科学分野の新たな研究手法として有用です。

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ストライク装置の組み立て（ 図1 ） <ol><li>プランジャーを1mLツベルクリンシリンジから取り出します。 1 mLのマークでバレルをカットします。 </li><li> 200μLのピペットチップからエアロゾルバリヤ（高さ3mm×直径4mm）を取り外し、インパクタとして使用する。インパクターをシリンジバレルの内側に置きます。ゆっくりとバレルをタップしてインパクターを先端に移動させ、平らな面がノズルの開口部を覆うようにします。 </li><li> ショウジョウバエ麻酔ステーションの二酸化炭素（CO 2 ）フローレギュレーターに接続されているプラ​​スチックチューブにバレルの先端を取り付けます。 </li><li>バレルを垂直に持ち、インパクタがバレルの底にとどまるように標準のクランプホルダースタンドにクランプします。 </li><li> 200μlのピペットチップをフライホルダーに変更します。 <ol><li>先端から4 mmをカットして直径0.8 mmの開口部を作り、フライヘッドのみを露出させます。 注：thoレックスとフライボディーの他の部分はピペットチップの内側に留まります。 </li></ol></li><li> 1000μLピペットチップと1 mLシリンジ針キャップを変更してコネクターを作成します。 <ol><li>先端の開口部から44mmの位置で切断します。 1ミリリットルシリンジ針キャップの長さを6 mmにして、1,000μLピペットチップの残りの部分にしっかりと押し込みます。 </li></ol></li></ol> 2.ストライク装置の動作<ol><li>フライパッドにCO 2を使用して、 2日齢の成人女性フライを麻酔する。 </li><li>細かい筆を使って軽くフライホルダーに移してください。フライヘッドが先端の外側に見えるように、ホルダーを静かにタップします。フライ・プローブがチップの外側に露出している場合は、鈍い1mLシリンジ・ニードルでチップの内側に静かに戻します。 注：フライポイコスをホルダーの内側に入れてください。さもなければ、ハエは吸う胸部の傷害によって死ぬかもしれない。 </li><li>フライホーを締めなさいフライヘッドが下向きになるように、コネクターでシリンジバレルに接続してください。 </li><li>ガス圧を100 kPaに設定します。実験計画に従って流量を調整する。 </li><li>インパクタがフライヘッドを一度叩くように、フローレギュレータのトグルスイッチを素早くオン/オフします。 </li><li>フライホルダーを持ち上げ、フライパッドの上に移動します。フライホルダーを逆さまにして軽く飛ばして、フライを出す。空のバイアルにフライを入れて回復させる。 </li></ol> 3.ビデオ支援移動追跡<ol><li>トラッキングアリーナを作るために、直径6cmのペトリ皿に透明なシリコンエラストマーを充填する。シリコンとフライパンの間に3mmのスペースを空けて、ハエが自由に歩いて飛行することができます。 </li><li>毎回擬似群または治療群のいずれかから4匹のハエを麻酔し、それらをアリーナに入れる。フライを22℃で1時間放置する。 </li><li>アリーナの上に電荷結合素子（CCD）カメラを置き、5分間記録する。</li><li> Ctraxソフトウェア（Caltechから自由に入手可能）を使用して、記録された移動軌跡を分析します。トラッキングされたデータをプログラミング言語（Matlabなど）互換の形式でエクスポートし、フレームあたりの移動距離に基づいてデータを分析します。各フライの平均歩行距離を計算し、それを他のすべての記録されたフライ/グループと組み合わせて、同じグループ内のファイルの集団が移動した平均累積距離を得る。 </li></ol>

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<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
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<li>Talavage, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally-detected+cognitive+impairment+in+high+school+football+players+without+clinically-diagnosed+concussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion.</a> J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).</li>
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この研究は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の教員スタートアップファンドであるLC

神経生理学的変化、神経病理学的特徴、および神経行動障害を含むCTEの特徴を忠実にモデル化する動物モデルは、疾患メカニズムの解明および診断および治療標的の開発に不可欠である。臨床的に関連するすべてのエンドポイントを模倣するのに、ヒト疾患の動物モデルは完全ではないことは理解できる。しかし、堅牢なCTEモデルは、次の3つの要件を満たす必要があると考えています。（1）頭皮に頭皮保護と頭蓋保護を施した頭部に直接的に衝撃を与えなければならない。 （2）衝突の際にヘッドを固定しないでください。急速な加減速や回転や直線的なヘッドの動きが許されます。 （3）実験デザインには、単回および反復レジメンの両方が含まれていなければならず、その影響は、組織浮腫、挫傷、または率直な出血などの目に見える損傷を与えることなく、本来軽度でなければならない。 ウーフルーツフライモデルは、ハエ13,14,15の外傷性脳損傷を引き起こす他の方法とは区別される。 Bead RuptorモデルとHIT装置の両方が、ランダムな衝撃位置と強度で怪我を負わせます。どちらの方法においても、標準的なプラスチック製バイアルまたは2mLスク...

慢性外傷性脳症（CTE）は、最近、アルツハイマー病などの他のタウオパシーとは別個の別個の神経変性障害として認識されている1 。アルツハイマー病や他の一般的なタウオパシーとは異なり、CTEはその名の通り、脳の外傷の病歴と密接に関連していると言えます。接触したスポーツアスリートでは、ボクサーやフットボールの選手、軍用退役軍人のようなもの2,3,4,5。それは頭に繰り返し震えと副交渉の打撃によって開始されると考えられています。患者は、アルツハイマー病、前頭側頭と重複する認知機能障害、気分および行動変化、および運動障害などの症状および徴候を示すことがある認知症、レヴィー小体認知症、およびパーキンソン病6 。対照的に、脳組織の死後検査は、皮質溝の深さにある小血管周囲の過剰リン酸化タウ蓄積の明確なパターンを示し、他の変性状態では見られない病理学的特徴である7 。しかしながら、これまでのところ、疾患発現につながる病因についてはほとんど知られていない。これは大部分が忠実な動物モデルが欠如していることに起因しており、最近ではげっ歯類モデルが作成されたばかりです5,8。これらのモデル生物は、費用重視のケアおよび比較的長い寿命の欠点を有し、神経変性疾患研究にはあまり適していない。 哺乳動物のそれと比較して、 ショウジョウバエなどの無脊椎動物は費用対効果の高いメンテナンスを備えた優れた代替品であり、遺伝的決定因子を解剖するための広範なツール、および比較的短い寿命9 。注目すべきことに、ハエとヒトの脳は、進化的に保存された分子および細胞経路、ならびに解剖学的類似点を共有している10,11,12。外傷性脳損傷を研究するための2つの巧妙なショウジョウバエモデルが以前に報告されている13,14 。 Katzenbergerらによって設計された最初の &quot;High Impact Trauma&quot;（HIT）装置は、金属ばね13,15の自由端に結合されたプラスチックバイアル内に自由に動く飛行機を含んでいた。プラスチック製のバイアルを直立させて離したときに、ポリウレタン製のパッドに当たって、バイアルの壁に跳ね返り、跳ね返りながら飛行機に外傷を与えました。対照的に、Barekatらは、異なる送達方法を設計したOmni Bead Ruptor-24ホモジナイザープラットフォーム14を用いて行った 。ハエはCO 2で不能化され、ホモジナイザーに固定された2mLスクリューキャップ管に入れられ、予めプログラムされた振盪条件に供された。組織ホモジナイザーシステムを使用することの1つの利点は、実験者が傷害の強度、傷害の持続時間、および傷害の回数を調節することができることである。しかし、両方のレジームにも同じ欠点があります。頭部への一次損傷は、インパクトの場所と強度に関してランダムに影響を受けます。さらに、両方の方法は、身体および内臓の他の部分への必然的な副次的損傷によって引き起こされる、かなりの死亡をもたらした。ここでは、ミバエのmTBIを誘導する新規な方法を説明する。私たちの装置は、ガス推進弾道衝撃子で構成されています。既存のショウジョウバエのモデル14,15と比較すると、本発明者らの方法は、meas自由に動くフライヘッドのみに向けることができるので、衝撃の重大性、衝撃の時間間隔、持続する衝撃の総数などの様々な要因を正確に制御することができます。

<table><tbody><tr><td>エアロゾルバリア</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>インパクターとして使用</td></tr><tr><td>200 &#956;Lピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1111-0706</td>フライ<td>ヘッドホルダーとして使用</td></tr><tr><td>1000&#956;L ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>コネクタとして使用</td></tr><tr><td>1mL ツベルクリンシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 mm ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713A</td><td>トラッキングアリーナとして使用</td></tr><tr><td>フローレギュレータ</td>ー <td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>標準クランプホルダー/スタンド</td><td>EISCO サイエンティフィック</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>ファインブラシジェ</td><td>ネシーサイエンティフィック</td><td>59-204</td><td></td></tr>フライ<tr><td>パッド</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>シルガードシリコーンエラストマー</td><td>ダウコーニング</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>マイクロソフト&nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax ウォーキング フライ トラッカー</td><td>Caltech</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Image Processing Toolbox</td><td>MATLAB</td><td>R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性外傷性脳症モデルの新しい方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

慢性外傷性脳症（CTE）は、繰り返し軽度の外傷性脳傷害（mTBI）への暴露と密接に関連する確立された神経変性疾患である。神経病理学的基準を定義するための最近のコンセンサスにもかかわらず、その複雑な病理学的変化の原因となっている機構は、依然として分かりにくいままである。ここでは、 ショウジョウバエメラノガスター （ ショウジョウバエ ）におけるCTEのモデルを開発して、特徴的な過剰リン酸化タウの蓄積および脳における神経細胞の死につながる重要な遺伝子および経路を同定するための新しい方法を説明する。軽度の閉鎖傷害を与えるための調整可能な衝撃は、ヘッドを急速な加減速にさらし、フライヘッドに直接供給されます。我々の方法は、他のショウジョウバエの mTBIモデルに内在する潜在的な問題を排除する（ 例えば、動物死は、身体の他の部分または内部器官）。労力とコストを重視する動物の手入れが少なく、寿命が短く、遺伝的ツールが豊富で、CTEの病因を研究し、ゲノム規模の大規模な遺伝的および薬理学的スクリーニングを行うことができます。我々は、モデルの進行中の特徴付けが、疾患の予防および治療アプローチに関する重要な機構的な洞察を生成すると予想する。

成体ショウジョウバエを使用してCTEモデルを確立するために、私たちは単一の閉鎖頭傷害を与える際の装置の有効性を判断した。遺伝子型、性別、年齢に関するバリエーションを排除するために、我々は実験で2日齢のCanton-S WT雌ハエを使用した。 100kPaの一定のガス圧でCO 2の流量を調節することによって、インパクターの強度を容易に制御することができた。最も高い流速（15L /分）で単一のストライクにさらされたハエは、最小の外部欠陥を示した（ 図2 ）。外部の眼および口の部分の両方が損なわれていないように見えた。それにもかかわらず、15L /分の流速は致命的であり、24時間以内に10％未満の生存率をもたらすことがわかった（ 図3A ）。対照的に、10または7.5L /分のストライキに曝露すると、それぞれ61.1％および96.3％の生存率が得られたが、5.0および2.5L /分の流速では、すべてのハエは生き残った24...

ここでは、 ショウジョウバエのメラノガスター（melanogaster）における閉鎖頭部外傷性脳傷害を引き起こす新しいアプローチについて説明する。私たちの方法は、調整可能な強さで反復的な衝撃を直接ヘッドに伝えるという利点があります。無脊椎系のさらなる探索は、慢性外傷性脳症の病因を明らかにするのに役立つだろう。

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

この新しい手法の総合的な目的は、ショウジョウバエ（Drosophila）に閉鎖性外傷性脳損傷を誘発し、慢性外傷性脳症の新しいモデルを確立することです。この方法は、反復的な外傷がどのようにニューロン変性を誘発するかなど、慢性外傷性脳症分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、動物体の他の部位に損傷を与えることなく、調節可能な強度の反復衝撃をハエの頭部に直接与えられることです。デバイスの組み立てやショウジョウバエの導入ステップは習得が困難であり、また、ショウジョウバエの頭部は非常に小さいため、衝撃を頭部にのみ与えることが重要であることから、本手法の実際のデモンストレーションは極めて重要です。ショウジョウバエに脳振盪を起こさせる、あるいは衝撃を与えるための装置を作成するには、まず装置のインパクター部分を作成します。1 mLのポリカーボネート製ツベルクリン用注射器からプランジャーを取り外し、次にシリンダーを1 mLの目盛りで切断します。インパクターには、200 µLピペットチップに付属しているエアロゾルバリアを使用します。このインパクターのサイズは、長さ3 mm、直径4 mmである必要があります。次に、平面側がノズルに向くようにして、インパクターをシリンジバレルに充填します。圧力を加えるため、シリンジバレルを二酸化炭素流量レギュレーターに取り付けます。レギュレーターにはOn/Off切り替えスイッチがあり、ガス流量を適切に制御できるものである必要があります。次に、インパクターがバレルの底まで落下するように、バレルをアイアンスタンドに垂直に固定します。次に、フライホルダーを作成します。200 µL ピペットチップを用意します。チップの先端から 5 mm の位置で切り、直径 8 mm の開口部を作成します。ショウジョウバエの頭部はこの穴を通過しますが、胸部は通過しません。最後に、フライホルダーとインパクトデバイスを作成します。まず、1 mLピペットチップの先端から44 mmの位置で切断します。次に、1 mL用シリンジの針カバーから6 mmの長さを切り出します。その後、2つのパーツを押し合わせて固定します。二酸化炭素を用いて、羽化後2日の成雌フライ1匹を麻酔します。二酸化炭素パッドから、細筆を用いてショウジョウバエをホルダーへ慎重に移します。次に、頭部が先端から突き出るまで、ホルダーを軽く叩きます。口吻が露出している場合は、先端を丸めた1 mLシリンジの針を使用して、慎重に口吻を先端の中に戻してください。ハエの体、特に口器をホルダー内に保持することが極めて重要です。そうしないと、内臓の損傷や摂食不能により、ハエが死に至る可能性があります。次に、ガス圧を100 kilopascalsに設定し、必要に応じて流量を調整します。ハエをセットしたら、コネクターを使用してホルダーをシリンジバレルに固定し、ハエの頭が下を向くようにします。次に、トグルスイッチを使用してガスを噴射し、インパクターを動作させてハエを一度だけ打撃します。その後、ハエホルダーを取り外し、ハエを二酸化炭素パッドに戻します。ハエが回復するまで、空のバイアルに筆で移します。1本のバイアルに1匹ずつ入れてください。回復には数分しかかかりません。この工程を繰り返し、実験群につき4匹のハエをテストします。テスト群とシャム群の2群の処理には、20～30分しかかかりません。シャム群についてもテスト動物と同様に扱いますが、インパクターチューブにエアロゾルバリアを入れない点だけが異なります。ペトリ皿内のショウジョウバエの動きを追跡するには、まず、6 cmの皿に透明なシリコンエラストマーを満たして追跡アリーナを作成します。シリコンと蓋の間に3 mmの間隔を空けることで、ハエがその隙間を自由に歩き回ることができ、かつ飛び上がることができないようにします。追跡アリーナの下には、白い背景を配置してください。次に、同じ処理群のショウジョウバエ4匹を麻酔し、アリーナに配置します。完全に点灯し、約22 °Cに設定されたアリーナ内で、ハエを1時間順応させます。室温より高くならないようにしてください。1時間後、アリーナ上方に設置した電荷結合素子（CCD）カメラを使用して、ショウジョウバエの活動を5分間記録します。5分間の記録終了後、アリーナ内のハエを麻酔し、新しい飼育瓶に戻します。その後、アリーナを廃棄します。その後、無料で利用可能なCtraxソフトウェアを使用して録画データを解析します。このソフトウェアはトラッキングデータを生成し、MATLAB形式などのプログラミング言語互換形式でエクスポートすることが可能です。これらのデータから、1フレームあたりの移動距離、個体ごとの平均歩行距離、および個体あたりの平均移動距離を算出します。統計的有意性を得るためには、処理群あたり約100匹のショウジョウバエをテストすることになります。慢性外傷性脳症モデルを構築するため、2日齢のCanton-S雌を用い、衝撃装置によって異なる速度で加えられた単回の閉頭部外傷の有効性を分析しました。ガス圧は100 kilopascalsに維持しました。最高試験流速で1回の衝撃にさらされたハエは、外的な欠損が最小限であった。外的な損傷の明確な証拠は認められなかったものの、15 liters per minuteの流速における損傷は急性に致死的であり、24時間以内の生存率は10%未満であった。流速が低くなるにつれて生存率は上昇した。5 L/min以下で100%の生存率が得られたため、本モデルの標準として5 L/minを選択した。衝撃を受けた直後、ショウジョウバエは4分以内に徐々に運動能を回復した。シャム群の回復は約1分早かった。衝撃後、ビデオ補助付き動作トラッキングを用いて運動機能を測定した。衝撃後の2日間で、運動能は徐々に正常に戻った。この漸進的な回復の証拠は、ヒトにおけるCTEの回復と一致している。長期的な影響を評価するため、5日間にわたり5回の衝撃を与える反復的外傷性脳損傷プロトコルを適用しました。処置から20日後、各群の生存個体の運動能を比較したところ、処置群は明らかに歩行距離が減少していました。また、処置群の生存期間も大幅に短縮し、対照群の中央値が37日であったのに対し、処置群では26日でした。本手法の開発により、軽度反復性外傷性脳損傷分野の研究者が、古典的な動物モデルであるDrosophila melanogasterを用いて病原性メカニズムを探索する道が開かれました。本手順を実施する際は、エアロゾルバリアによって口器、胸部、および腹部を直接的な衝撃から保護することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

このビデオでは、自由に歩くハエを追跡して一般的な移動能力を評価する方法を説明しています。注目のプロトコルは、ビデオ追跡ソフトウェアを使用したアッセイのセットアップとデータ解析を示しています。...

自由に歩くハエの追跡:ショウジョウバエの移動を評価する方法

このビデオは、麻酔をかけたショウジョウバエに、ガス推進式インパクターを備えたストライクデバイスを使用して、閉頭部外傷を負わせる手順を示しています。この損傷は神経機能に影響を及ぼし、歩行能力を損ないます。...

ショウジョウバエに閉鎖性外傷性脳損傷を負わせる技術

このビデオでは、ショウジョウバエに閉鎖性外傷性脳損傷(TBI)を誘発するためのHigh-Impact...

ショウジョウバエにおける閉鎖性頭部外傷性脳損傷の付与方法

このビデオは、ショウジョウバエの脳に貫通性外傷性脳損傷が誘発される様子を示しています。新たに出現したハエを選別し、麻酔をかけ、蛍光付き実体顕微鏡で位置決めします。GFPを発現するキノコの本体を特定し、ミヌーティエンピンを挿入して傷害を引き起こす。ハエはさらなる研究のために回復することが許されています。...

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転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila...

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

ここでは、 ショウジョウバエにおいて閉鎖性頭部外傷性脳損傷（TBI）を与えるための方法を説明します。この方法は、ハエのために利用可能な実験ツールと技術の広大な配列を使用して、TBI病理の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するためのゲートウェイを提供します。...

で閉鎖性頭部外傷性脳損傷を負わせる方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

学ぶ ショウジョウバエを用いた慢性外傷性脳症モデルの構築法。調整可能な衝撃装置で頭部に直接反復的な衝撃を与え、神経変性のメカニズムを研究します。この手法は神経科学分野の新たな研究手法として有用です。

慢性外傷性脳症モデルの新しい方法

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