ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

この手順の全体的な目的は、ミツバチに対する化学的忌避剤を評価することです。この方法は、どのような化学物質がミツバチの行動を制御し、餌源から遠ざけることができるかなど、昆虫学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本プロトコルの主な利点は、ミツバチに対する化学的忌避剤を、比較的迅速かつ簡便にスクリーニングするためのシンプルなアプローチを提供することです。

対照区用の糖・アガロースキューブを調製するには、半冷却した糖・アガロース溶液をウェイボートの型に注ぎます。忌避剤処理区では、半冷却したアガロース溶液に目的の量の化合物を添加します。本デモンストレーションでは、最終濃度1%DEETを使用しています。

フラスコを回して化合物を混ぜ合わせ、その後、溶液をウェイボート型に注ぎます。糖含有アガロースキューブが冷却されたら、凝固したキューブをウェイボート型から取り出し、湿らせたペーパータオルと共にプラスチック容器に入れます。保存のため、容器を冷蔵庫に入れます。

トラッキングソフトウェアにおいて、画面左側にあるエクスペリメントエクスプローラーバーの「実験設定（experiment settings）」に移動します。正しいカメラが選択されており、ビデオ録画がペトリ皿のアリーナの中央に位置していることを確認してください。ビデオ録画を中央に合わせる必要がある場合は、カメラ設定の「関心領域（area of interest）」コントロールにある「Center X」および「Center Y」オプションを選択してください。

「Experiment settings」で、アリーナの数を16に変更します。「Tracked features」で、「center point detection」を選択します。次に、「arena settings」を選択し、アッセイに使用するアリーナを設定します。

16枚のペトリ皿を、カメラの下に配置したライトボックスの上に4x4のパターンで並べます。アリーナ設定において、右側のツールパネルにある背景取得ボタンを使用して、16枚のペトリ皿の写真を撮影します。これがアリーナをセットアップするためのテンプレートとして使用されます。

アリーナ設定画面上部のツールバーから「create ellipse」を選択し、キャプチャした画像内のペトリ皿のいずれかの直径と一致する円を作成します。アリーナ1のマーカーを円の中に配置します。次に、右側のツールパネルのアリーナ1の下にあるゾーングループ1を選択します。

画面上部のツールバーから「長方形ツール」を選択します。このツールを使用して、30×30ピクセルの正方形を作成します。その後、前のステップで作成した円の中心に正方形を配置します。

上部ツールバーから「add zone」を選択し、正方形の中央をクリックします。ゾーンを1マーカー分移動させ、正方形の中に配置します。次に、右側のツールパネルで「arena one」を選択し、「duplicate complete arena」をクリックします。

ドロップダウンメニューから、他のすべてのアリーナを選択し、OKをクリックします。複製したアリーナ設定を、取得した画像内の残りのペトリ皿に移動させます。次に、アリーナ1を選択し、上部ツールバーの「calibrate scale（スケール校正）」を選択します。アリーナ1のペトリ皿の直径に沿って校正線を引きます。

直径の測定値を9 cmに変更します。右側のツールパネルで「validate arena settings」を選択します。次に、左側のコントロールバーで「detection settings」を選択します。

検出設定1を選択し、右側のツールボックスにあるドロップダウンメニューからグレースケールを選択します。「検出」の下で、範囲を0から83に設定します。検出設定を右クリックし、「検出設定2」という名前で新しい設定を作成します。

グレースケールが選択されたままであることを確認し、他のパラメータは変更しないでください。エクスペリメンタル・エクスプローラーでトライアルリストを選択し、上部ツールバーの「変数追加（add variable）」をクリックします。ユーザー定義変数の名前を「Treatment」として設定します。

「user defined treatment」列にある predefined values のドロップダウンバーを選択し、事前定義値として「control」と「treatment」を追加します。上部ツールバーにある「add trials」ボタンをクリックし、2つのトライアルを追加します。次に、各アリーナについて、それがコントロールアリーナかトリートメントアリーナかを選択してください。

次に、エクスペリメント・エクスプローラーパネルにあるデータプロファイルを選択します。左側の列で、「ユーザー定義独立変数」の見出しの下にある「treatment」を選択してください。これにより、フローチャートのある領域にフィルターボックスが追加されます。

ポップアップボックスでCを選択し、新しく作成されたフィルターを開始ボックスと結果ボックスの間に配置します。フローチャートの矢印が、開始ボックスからフィルター、そして最終的に結果ボックスへと向くように調整されるはずです。この手順を繰り返しますが、今回はフィルターにTを選択し、共通要素セクションでresultを選択してください。

新しく作成したボックスをフローチャート領域に移動し、ボックス同士を矢印で接続してファイルを保存します。ビジュアルトラッキングプログラムを起動し、このアッセイ用に作成して保存した実験ファイルを開きます。検出設定2を選択してください。

次に、16枚のペトリ皿のうち8枚の中心に、対照群の糖アガロースキューブを配置します。残りの8枚の皿に対しても、同様の手順で糖アガロース化合物キューブを配置します。ピンセットを使用して、プラスチックボックスからミツバチを1匹取り出し、対照群のペトリ皿のいずれか1枚に入れます。

残りの15枚のシャーレについても、この手順を繰り返します。すべてのシャーレをライトボックスの上に置きます。赤色スペクトルに設定されたLEDライトアレイでライトボックスを下から照らし、アリーナ検出領域が各シャーレのアリーナに合うように配置します。

外部光を遮断し、アリーナ内の影を軽減するため、ボックスとカメラ全体を黒いプラスチックシートで覆います。ペトリ皿を設置した後、「detection settings one」が選択されていることを確認してください。この時点で、視覚トラッキングソフトウェアは、ペトリ皿アリーナ内のミツバチのみを検知しているはずです。

次に、エクスペリメントエクスプローラーからacquisitionを選択します。右側のacquisitionコントロールポップアップボックスにある緑色のstart trialボタンを押し、記録を開始します。アッセイを10分間実行した後、acquisitionコントロールポップアップボックスの赤色のstop trialボタンをクリックして記録を停止します。

個々のミツバチの摂食行動に及ぼすDEETの影響に関する代表的な結果をここに示します。コントロールキューブにさらされた個体は、摂食ゾーンで平均343秒過ごしましたが、DEETを含むキューブにさらされた個体では16秒でした。ここでは、2種類の異なる化合物が個々のミツバチの摂食行動に及ぼす影響の代表的な結果を示します。

非忌避化合物を曝露させた個体は、給餌ゾーンに平均282秒間滞在したのに対し、対照群は約352秒間滞在した。忌避化合物を曝露させると、給餌ゾーンでの滞在時間は約23秒と有意に短縮した。これは、平均493秒間滞在した対照群と比較してである。

この手法を習得し、適切に実施すれば、20分で完了させることができます。この手順を行う際は、あらかじめすべての準備を整え、ミツバチを十分な時間絶食させることが重要です。このビデオを視聴することで、ビデオトラッキングソフトウェアを用いて、餌に注入された化合物の個々のミツバチへの影響をどのように判定するかについて、十分に理解できるはずです。

本手順に続き、化合物のコロニーレベルへの影響に関するさらなる疑問を解決するために、近接場アッセイやフィールドアッセイなどの他の手法を実施することが可能です。本技術の開発により、昆虫学分野の研究者が新しい化学物質や、それがミツバチの採餌行動に及ぼす影響を探索する道が開かれました。化合物の取り扱いは極めて危険な場合があるため、本手順の実施中は、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じてください。