Name: ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶ ビデオトラッキング法によるApis melliferaの化学的忌避物質スクリーニング。個体の餌取り行動を定量的に評価し、農薬からの pollinator 保護戦略を開発するための迅速で再現性の高い手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ビジュアルトラッキングソフトウェアと機器の使用についてDr. Thomas Kuharに感謝します。私たちはJames WilsonとScott O&#39;Nealに技術的支援をしてくれてありがとう。

1.シュガー・アガロース・キューブの調製<ol><li> 8gの砂糖を秤量し、50mLの三角フラスコに入れる。 </li><li>三角フラスコに20mLの脱イオン水を満たします。フラスコを旋回させて砂糖を溶解する。 </li><li> 170 mgのアガロースを秤量し、砂糖溶液に加える。 </li><li>砂糖 - アガロース溶液をマイクロ波で25秒間高温に加熱する。アガロースを糖溶液に溶解する。 </li><li> フラスコと糖 - アガロース溶液を冷ます。 注：フラスコは冷たくて触ってはいけませんが、溶液が凝固しないようにしてください。 <ol><li>対照処理のために糖 - アガロースキューブを調製するために、半冷却糖 - アガロース溶液を計量ボート型に注ぐ。 注：計量ボートの型は、1.5 x 1.5 x 0.3 cm 3の寸法です。 </li><li>忌避剤処理のための糖 - アガロース - 化合物立方体を調製するために、所望量の化合物を半冷却溶液に添加する（ 例えば 、1％DEET in sウガ - アガロース溶液（v / v））。フラスコを旋回させて化合物を混合し、次に溶液を計量ボート型に注ぐ。 注：この時点で、8個の制御型と8個の試験型が準備されます。制御型には忌避剤が含まれていません。 </li></ol></li><li>冷蔵庫でカビの糖 - アガロースの立方体を5〜10分間冷ます。秤量ボート型から凝固した糖 - アガロースの立方体を取り出し、湿らせたペーパータオルを入れたプラスチック容器に入れる。 </li><li>コンテナを冷蔵庫に入れて保管します。砂糖 - アガロースの立方体は、調製から7日以内に使用する必要があります。 </li></ol> 2.ビデオトラッキングソフトウェアのプログラミングと実験的セットアップ<ol><li> 画面の左側にある実験エクスプローラバー（トラッキングソフトウェアの「材料表」を参照）の下で、正しいカメラが選択され、ビデオレコーディングがペトリ皿の中央にあることを確認します。<ol><li>ビデオの録画を中央に配置する必要がある場合は、カメラの設定とAOIコントロールの下にある中央のXとYの中央のオプションを選択します。 </li></ol></li><li> [実験設定]で、アリーナの数を16に変更します。[追跡される機能]で、[中心点検出]を選択します。 </li><li> アレーナ設定を選択して、アッセイに必要なアリーナを設定します。 <ol><li> 16個のペトリ皿をカメラの下に置かれたライトボックスの上に4 x 4パターンで置きます（ 図1 ）。 注：これらの料理は録音場を作成するために使用され、空です。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig1.jpg" /> 図1：ライトボックス上のペトリ皿配置。ペトリ皿はライトボックスの上に4 x 4ブロックで配置されています。この配置は、vのための制御および忌避剤処理の容易な識別を提供する事実追跡プロトコル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li>アリーナの設定では、右側のツールパネルにあるグラブの背景ボタンを使用して、16枚のペトリ皿を撮影します。これは、アリーナをセットアップするためのテンプレートとして使用されます。 </li><li>アリーナの設定画面の上部にあるツールバーの &quot;楕円の作成&quot;を選択し、イメージ内のペトリ皿の1つの直径に一致する円を作成します。アリーナ1マーカーを円に配置します（ 図2 ）。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig2.jpg" /> 図2：ビジュアルトラッキングソフトウェアアリーナ設定のスクリーンショット円内の斜めの縞の観察は、円内の検出領域の確認を提供する。 A<html>ゾーン1のマーカーは、各四角に対して提供され、各ペトリ皿のターゲットゾーンを定義します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="6"><li>右側のツールパネルのArena 1にある「Zone Group 1」を選択します。画面上部のツールバーから「長方形を作成」を選択します。これを使用して30 x 30ピクセルの正方形を作成し、前の手順で作成した円の中心に配置します。上部のツールバーから「ゾーンを追加」を選択し、四角形の中央をクリックします。ゾーン1マーカーが正方形になるように移動します。 注：作成された四角は給餌ゾーンであり、給餌ゾーンは糖アガロースキューブよりわずかに大きい限り、記載されているサイズと正確に同じである必要はありません。 </li></ol>les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：Completed Arena Settingsのスクリーンショット完成したアリーナの設定はこの例のようになります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="7"><li> 右側のツールパネルで[Arena 1]を選択し、[完全なアリーナを複製]をクリックします。ドロップダウンメニューから「All Other Arenas」を選択し、「OK」をクリックします。複製されたアリーナの設定をグラブ画像の残りのペトリ皿に移動します（図3）。 <ol><li> &quot;Arena 1&quot;を選択し、上部のツールバーで &quot;目盛りの校正&quot;を選択します。アリーナ1ペトリ皿の直径全体に較正線を描きます。直径測定値を9cmに変更する（使用しているペトリ皿の直径）。右側のツールパネルで[アリーナ設定の検証]を選択します。 </li></ol></li><li>選択 &quot;左のコントロールバーの「検出設定」を選択します。 </li><li> 「検出設定1」を選択し、右側のツールボックスにあるドロップダウンメニューで「グレースケール」を選択します。検出下では、範囲を0〜83に設定します（ 図4A ）。 </li><li> 「検出設定」を右クリックして、「検出設定2」という名前の新しい設定を作成します。 「グレースケール」が選択されていることを確認しますが、他のパラメータは変更しないでください。 注：ビデオウィンドウには、アリーナの上に大きな黄色の円が表示されます。これは、記録前にペトリ皿を正しい位置に配置するのを助けます（ 図4B ）。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig4.jpg" /> 図4：検出設定1と2のスクリーンショット （ A ）アレーナがどのように表示され、グレースケールがシャーベットのハチミツ。 （ B ）試行の間にペトリ皿の配置を行うことができるように、アリーナ検出領域を示す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="11"><li> Experimental Explorerで &quot;Trial List&quot;を選択し、上部ツールバーの &quot;Add Variable&quot;をクリックします。ユーザー定義変数に「治療」と名前を付けます。ユーザが定義したTreatmentカラムの &quot;Predefined Values&quot;ドロップダウンバーを選択し、C（コントロール）とT（治療）をPredefined Valuesとして追加します。上部のツールバーにある「トライアルの追加」ボタンを選択します。 2つの試行を追加し、各競技場がコントロールアリーナ（C）か治療アリーナ（T）かを選択する（ 図5 ）。 </li></ol><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig5.jpg" /> Fi図5：試用リストのスクリーンショット。プログラムがここで情報を使用してデータを分離し、それを統計的に分析するので、アリーナに正しくラベルを付けることが重要です。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="12"><li> Experiment Explorerパネルの下の &quot;Data Profile&quot;を選択します。左側の列で、 &quot;User-defined Independent Variables&quot;見出しの下にある &quot;Treatment&quot;を選択します。これは、フローチャートにある領域に「フィルタ」ボックスを追加します。ポップアップボックスで &quot;C&quot;を選択し、新しく作成したフィルターを &quot;開始&quot;ボックスと &quot;結果1&quot;ボックスの間に置きます。フローチャートの矢印は、開始ボックスからフィルタ、最後に結果1を指すように調整する必要があります。 <ol><li>手順2.12を繰り返しますが、今回はフィルタの &quot;T&quot;を選択してから、「共通要素」セクションの下の「結果」をクリックします。新しく作成したボックスをフローチャート領域に移動し、矢印でボックスを接続します（ 図6 ）。 </li></ol></li></ol><img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig6.jpg" /> 図6：データプロファイルのスクリーンショットこれは、統計分析で適切な分離を得るためにフローチャートがどのように設定されるべきかを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="13"><li>ファイルを保存します。 </li></ol> 3.ハチミツ個体を集める<ol><li>保護服を着て、ミツバチ（主に飼い犬）を集めるハイブを選択してください。 </li><li>ハイブの外側カバーと内側カバーを取り外します。ハイブツールを使用して、巣箱を含まないトップハイブボディのフレームを選択します。ハイブボックスからフレームを静かに持ち上げます。 </li><li>ミツバチ女王のためのフレームを点検しなさい。彼女がそこにいない場合は、輸送のためにフレームからコンテナにミツバチ労働者を掃除します。十分な個体を集めて、試験する各化合物について2回の完全試験を行うことができるようにする（対照で試験ごとに16人が利用される）。 注：収集された個体は、主に飼料作物であるべきである。しかし、コレクションに含まれる看護師のような他の高齢者がいるかもしれません。 </li><li>ミツバチが取り除かれた時期を書き留めます。それらを空気孔を含む9cm×7cm×9cmのプラスチックボックスに移し、32℃および70％相対湿度のインキュベーターに入れる。 </li><li>ミツバチを15時間飢えさせる。 注：これは通常、テストの前に蜂蜜が収集される場合に最適です。 </li></ol> 4.ビジュアルトラッキングアッセイの実施<ol><li>ビジュアルトラッキングプログラムを起動し、保存を開きますこのアッセイのために作成された実験ファイル。 </li><li> 「検出設定2」を選択します。 </li><li>コントロールの砂糖 - アガロースの立方体を16のペトリ皿のうちの8つの中心に置きます。残りの8種類の砂糖 - アガロース - 化合物（抑止力）キューブでこのプロセスを繰り返します。 </li><li>鉗子を使用して、プラスチック箱から単一のミツバチを取り出し、コントロールのペトリ皿の1つに入れます。 </li><li>残りの15ペトリ皿について、ステップ4.4を繰り返す。 </li><li>すべての皿をライトボックスに置き、ペトリ皿の各アリーナにアリーナ検出領域（検出設定2が選択されているときはコンピュータ画面に表示されている）が収まるように配置します。赤いスペクトルに設定された一連のLEDライトでライトボックスを下から照らします。箱とカメラ全体を黒いプラスチックシートで包み、外光をなくし、アリーナ内の影を減らします。 </li><li>ペトリ皿をセットした後、「検出設定1」が選択された設定。 注：この時点で、ビジュアルトラッキングソフトウェアは、ペトリ皿のアリーナ内のミツバチのみをピックアップする必要があります。 </li><li> Experiment Explorerから「Acquisition」を選択します。録音を開始するには、右側のAcquisition Controlポップアップボックスにある緑色の「試用開始」ボタンを押します。 </li><li>アッセイを10分間実行し、その後、Acquisition Controlポップアップボックスの赤い &quot;Stop Trial&quot;ボタンをクリックして、記録を停止します。 </li><li>ペトリ皿から個体を取り出し、別々の容器に入れて2回検査しないでください。 </li><li>同じ化合物の2回目の試行について、4.4-4.10のステップを繰り返します。 注：このメソッドは、ユーザーが必要に応じて治療ごとのミツバチの数を増やすように変更することができます。 </li><li>実験エクスプローラで[統計]を選択し、[計算]をクリックします。 </li><li>データをデータ・マネージャ・ソフトウェアにエクスポートし、重要度のデータを分析するには、aを使用します。Tukeyの事後検定による分散分析、および好ましい統計ソフトウェアプログラムを用いた不対t検定が含まれる。 </li></ol>

<ol><li>Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0921800908002942">Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline.</a> Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).</li>
<li>van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+review+of+managed+honey+bee+populations+in+Europe+and+the+United+States+and+the+factors+that+may+affect+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them.</a> J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).</li>
<li>Aizen, M. A., Harder, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Stock+of+Domesticated+Honey+Bees+Is+Growing+Slower+Than+Agricultural+Demand+for+Pollination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination.</a> Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).</li>
<li>Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens%2C+Pests%2C+and+Economics+Drivers+of+Honey+Bee+Colony+Declines+and+Losses%5BTitle%5D)+AND+%22Ecohealth%22%5BJournal%5D)">Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses.</a> Ecohealth. 10, 434-445 (2014).</li>
<li>Mullin, C. A., Frazier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+of+Miticides+and+Agrochemicals+in+North+American+Apiaries%3A+Implications+for+Honey+Bee+Health%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health.</a> PLoS ONE. 5 (3), (2010).</li>
<li>Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+comparison+of+two+multi-residue+methods+for+the+analysis+of+select+pesticides+in+honey+bees%2C+pollen%2C+and+wax+by+gas+chromatography+-+quadrupole+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry.</a> Talanta. 140, 81-87 (2015).</li>
<li>Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+Bee+Gut+Microbiome+Is+Altered+by+In-Hive+Pesticide+Exposures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures.</a> Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).</li>
<li>Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+repellents%3A+Historical+perspectives+and+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Insect repellents: Historical perspectives and new developments.</a> J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).</li>
<li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048357513000308">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.</a> Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).</li>
<li>Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+Evaluations+of+Topical+Arthropod+Repellents+in+North%2C+Central%2C+and+South+America%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America.</a> J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).</li>
<li>Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/89/3/608/2216379/Use-of-Insect-Repellents-for-Dispersing-Defending">Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae).</a> J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).</li>
<li>Brown, M., Hebert, A. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9039177">Insect repellents: An overview.</a> J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).</li>
<li>Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+video-tracking+to+assess+sublethal+effects+of+pesticides+on+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.).</a> Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).</li>
<li>Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002219109190076C">Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone.</a> J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).</li>
<li>Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-agricultural-science/article/div-classtitlerepelling-foraging-honeybees-with-alarm-pheromonesdiv/FCF9E5141FBEC584DBD2650E62522846">Repelling foraging honeybees with alarm pheromones.</a> J Agr Sci. 105 (2), 255(1985).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

このビジュアルトラッキングプロトコールは、比較的容易かつ容易にハチミツの化学抑制剤をスクリーニングする簡単なアプローチを提供する。ミツバチに対する化学的抑止力の実験室試験の推奨プロトコールはありません。以前の半および全圃場研究では、ミツバチの忌避剤14,15 ;記載されたプロトコルは時間がかかり、労働集約的であり、一般的な研究室の外に追加の設備資源を必要とする。このプロトコールは、ミツバチを用いたこのような化合物の半減試験の前に化学抑制剤の前提条件評価として設計された。 ハイブ以外のミツバチの化学的抑止力を評価するために個人をスクリーニングする際には問題があります。例えば、ミツバチは社会的な昆虫であり、行動に影響を与えるハイブ内のフェロモンに依存している14 。このプロトコル要求飢えに加えてフェロモンの手がかりをもはや受け取らない個体の使用を再開する。個々のミツバチの摂食反応を標準化するには、飢餓が必要です。飢餓時間は、24時間の時間経過研究によって決定された。飢餓は、個々のミツバチに有...

ヨーロッパのミツバチ、 Apis melliferaL。世界的に2,000億ドル以上の受粉サービスを提供する、経済的かつ農業上重要な昆虫である1 。米国とヨーロッパでは、ミツバチのコロニー数は減少しています。米国はカリフォルニア州を失っている。 1947年から2008年にかけて管理されたミツバチのコロニーの60％を占めていました。 1961〜2007年の27％ 2、3 。寄生虫の侵入、病原体の感染、養蜂の実践、殺虫剤の使用などがありますが、これらに限定されません。 ハチミツは、2つの主要経路を介して農薬に暴露される可能性があります。ハイブ以外の農薬の暴露は、餌を食べる人が農作物と接触するときに起こります害虫からの保護のための化学薬品を噴霧されている。蜂蜜中の農薬の暴露は、養蜂者がダニ、バクテリア、微胞子虫などの病害虫や病原菌を防除するために化学物質を利用する場合に発生する可能性があります4 。米国とカナダの24の養蜂場のワックス、花粉、ミツバチのサンプルで農薬残留物が確認されている5,6。蜜蜂への農薬の接触の影響には、急性毒性ならびに麻痺、失見当識、および行動および健康の変化などの亜致死的影響が含まれる1,7。現代の農業では農作物収量を維持するために農薬を使用する必要があるため、これらの化学物質は将来も引き続き信頼されます2 。殺虫剤暴露からミツバチをより良く保護するためには、新しい議定書と規制の開発が必要である5 。保護のための1つの可能なアプローチは、餌を餌取りする間、ミツバチが農薬にさらされるのを減らすための忌避剤の使用である。 節足動物防除剤（IR）は、典型的には、節足動物の病原菌に対する個人的な咬傷保護手段として用いられてきた8 。 60年以上前に開発された最も広く使用され成功したIRはDEET 8,9です。これは昆虫忌避試験のゴールドスタンダードとみなされ、世界保健機関と環境保護庁が忌避スクリーニングのためのポジティブコントロールとして使用されています10 。さらに、DEETはミツバチを脅威から彼らのコロニーに分散させることが判明している11 。個人用IRに関連する現在の属性には、（1）広範な節足動物に対する持続的な効果、 （2）皮膚または衣類に適用したときに使用者に対して非刺激性であること; （3）無臭または楽しいにおい; （4）衣服への影響なし。 （5）皮膚に塗布し、使用者の発汗、洗浄、および拭きに耐えるときに油状の外観を示さない。 （6）一般的に使用されるプラスチックには影響を与えない。 （7）化学的に安定であり、広範な使用のために手頃な価格12 。ミツバチに使用される忌避剤は、永続的な効果、アプリケータに対する非刺激性、無臭または快適な臭気、化学的に安定で広範な使用のために手頃な価格、およびミツバチに対する無毒性のようないくつかの属性を必要とするだけである。しかしながら、これらの属性を深く探究する前に、高いスループットで忌避/抑止のための化合物をスクリーニングする方法が必要とされている。ここでは、ハチミツの抑止のための化合物をスクリーニングする実験室アッセイのプロトコールについて説明します。これは、忌避性を決定する重要なステップです。以下のプロトコールは、ミツバチに対する殺虫剤の致死効果を評価するための視覚的追跡方法を記述した以前の研究から変更されている13 。ハウこのプロトコルは、農薬処理された作物からミツバチを抑える可能性がある候補忌避物質の効果を測定するように設計されているという点で異なる。ミツバチに対する化学的抑止剤の実験室試験に推奨されるプロトコールはないので、このプロトコールはそのような化合物をスクリーニングする簡単なアプローチを提供する。

<table><tbody><tr><td>砂糖/アガロースキューブを作るために使用される</td><td>50mLの三角フラスコ</td><td>Kimax</td><td>26500-50</td></tr> シュ<tr><td>ガー</td><td>クローガー</td><td></td><td>は、同様の製品で十分です</td></tr><tr><td>家で取得した</td><td>脱イオン水</td><td></td><td></td></tr><tr><td>砂糖/アガロースキューブを作るために使用される</td>ア<td>ガロー</td><td>スApex</td><td>20-102</td></tr> ア<tr><td>ガロースキューブの金型(計量ボート)</td><td></td><td></td><td>研究者に1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cmの砂糖/アガロースキューブを提供する任意の金型で十分です</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>ビジュアルトラッキングソフトウェア</td></tr><tr><td>633 nm LED</td><td>サイロン</td><td>HTP904E</td><td>これらのライトは、アリーナを下から照らすために構築されたライトボックスに配置されました。&nbsp;箱はシンプルな木製の構造で、つや消しプラスチック/プレキシガラスのカバーが付いているため、まぶしさなく光が上向きに分散することができました。</td></tr><tr><td>ラップトップまたはPC</td><td>Dell</td><td>Inspiron One 2305</td><td>は、ビデオ追跡ソフトウェアに必要です。任意のPCデバイスは、任意のTBEビジュアルトラッキングソフトウェアを実行することができます</td></tr>保護<tr><td>服</td><td>Dadant&キーピング蜂で十分ですSons Inc</td><td>V0126</td>任意の<td>保護フードとジャケットは、</td></tr><tr><td>ハイブツール</td><td>Dadant&で十分ですSons Inc</td><td>M00757</td>は、ミ<td>ツバチの巣箱を開くために使用されます</td></tr><tr><td>ミツバチ</td><td></td><td></td>の<td>巣箱 ミツバチの収容と保管に適した任意のコンテナ</td></tr>で十分です <tr><td>フェザー級鉗子 狭い先端</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>個々のミツバチを選択するために使用されます</td></tr><tr><td>9 cm (直径) ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S01778</td><td>アリーナ ビデオ追跡中に個々のミツバチを収容するために使用される</td></tr><tr><td>記録デバイス (カメラ)</td> <td>Basler</td><td>acA-1300-60gm</td><td>被写体を明確に記録し、ファイルをコンピューターに転送できる任意のデバイスで十分です</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>Graphpad</td><td></td><td>任意の統計ソフトウェア パッケージで十分です</td></tr></tbody></table>

ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

ヨーロッパミツバチApis mellifera L.は、毎年何十億ドルもの費用を生み出す、経済的にも農業的にも重要な花粉媒介者です。ハチミツのコロニー数は、1947年以来、米国および多くのヨーロッパ諸国で減少しています。この減少には、ミツバチの殺虫剤への意図しない曝露を含む多くの要因が影響します。新しい方法と規制の開発は、これらの花粉媒介者への農薬の曝露を減らすために保証されている。 1つのアプローチは、最近の農薬処理された作物からミツバチを抑える忌避化学物質の使用である。ここでは、選択された忌避化学物質にさらされたミツバチの抑止を識別するためのプロトコルについて説明します。ハチミツの飼料を採取し、試験の15時間前にインキュベーターで一晩飢えさせる。個々のミツバチを、砂糖 - アガロースキューブ（対照処理）または砂糖 - アガロース - 複合キューブ（撥水処理）を入れたペトリ皿に入れる料理の真ん中に。ペトリ皿は、ビデオトラッキングソフトウェアを使用してミツバチの歩行活動を記録するライトボックス内のカメラの下に配置されたアリーナとして機能する。合計8つの対照および8つの忌避剤処理を10分間分析し、各処理を新しいミツバチと重複させた。ここでは、ハチミツは化合物処理をした糖 - アガロースのキューブに抑えられているが、ミツバチは添加化合物なしで糖 - アガロースのキューブに引き寄せられることを示している。

砂糖 - アガロース（コントロール処理）または糖 - アガロース - 複合キューブ（抑止処置）のいずれかを用いて、ミツバチが標的ゾーンに費やした時間を記録する視覚追跡プロトコルを開発した。記録された時間は、統計的ソフトウェアプログラムを用いて分析され、目標ゾーンにおける平均±標準誤差が棒グラフとして報告された。昆虫忌避剤/抑止試験のためのゴールドスタンダードであるDEETを、このプロトコールで陽性対照として用いた。砂糖アガロースキューブ（ネガティブコントロール）を与えたミツバチは標的ゾーンで343±26秒を費やしたが、砂糖アガロースDEET（忌避剤）を与えたミツバチは標的ゾーンで16±4秒を費やした（ 図7 ）。 DEETは、標的ゾーンのミツバチが消費した時間をcaで大幅に削減しました。 95％であった。 次いで、このプロトコルにより、ミツバチに対する抑止を決定するために興味のあった化合物をスクリーニングした。図8Aは...

ミツバチコロニーの喪失は、作物受粉サービスに挑戦している。現在の受粉者保護の実践は、忌避化学物質を用いてハチミツと有害な農薬との接触を最小限に抑えるための別のアプローチを保証する。ここでは、ミツバチに対する抑止力をスクリーニングするための視覚追跡プロトコルの詳細な方法を提供します。

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

この手順の全体的な目的は、ミツバチに対する化学的忌避剤を評価することです。この方法は、どのような化学物質がミツバチの行動を制御し、餌源から遠ざけることができるかなど、昆虫学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本プロトコルの主な利点は、ミツバチに対する化学的忌避剤を、比較的迅速かつ簡便にスクリーニングするためのシンプルなアプローチを提供することです。対照区用の糖・アガロースキューブを調製するには、半冷却した糖・アガロース溶液をウェイボートの型に注ぎます。忌避剤処理区では、半冷却したアガロース溶液に目的の量の化合物を添加します。本デモンストレーションでは、最終濃度1%DEETを使用しています。フラスコを回して化合物を混ぜ合わせ、その後、溶液をウェイボート型に注ぎます。糖含有アガロースキューブが冷却されたら、凝固したキューブをウェイボート型から取り出し、湿らせたペーパータオルと共にプラスチック容器に入れます。保存のため、容器を冷蔵庫に入れます。トラッキングソフトウェアにおいて、画面左側にあるエクスペリメントエクスプローラーバーの「実験設定（experiment settings）」に移動します。正しいカメラが選択されており、ビデオ録画がペトリ皿のアリーナの中央に位置していることを確認してください。ビデオ録画を中央に合わせる必要がある場合は、カメラ設定の「関心領域（area of interest）」コントロールにある「Center X」および「Center Y」オプションを選択してください。「Experiment settings」で、アリーナの数を16に変更します。「Tracked features」で、「center point detection」を選択します。次に、「arena settings」を選択し、アッセイに使用するアリーナを設定します。16枚のペトリ皿を、カメラの下に配置したライトボックスの上に4x4のパターンで並べます。アリーナ設定において、右側のツールパネルにある背景取得ボタンを使用して、16枚のペトリ皿の写真を撮影します。これがアリーナをセットアップするためのテンプレートとして使用されます。アリーナ設定画面上部のツールバーから「create ellipse」を選択し、キャプチャした画像内のペトリ皿のいずれかの直径と一致する円を作成します。アリーナ1のマーカーを円の中に配置します。次に、右側のツールパネルのアリーナ1の下にあるゾーングループ1を選択します。画面上部のツールバーから「長方形ツール」を選択します。このツールを使用して、30×30ピクセルの正方形を作成します。その後、前のステップで作成した円の中心に正方形を配置します。上部ツールバーから「add zone」を選択し、正方形の中央をクリックします。ゾーンを1マーカー分移動させ、正方形の中に配置します。次に、右側のツールパネルで「arena one」を選択し、「duplicate complete arena」をクリックします。ドロップダウンメニューから、他のすべてのアリーナを選択し、OKをクリックします。複製したアリーナ設定を、取得した画像内の残りのペトリ皿に移動させます。次に、アリーナ1を選択し、上部ツールバーの「calibrate scale（スケール校正）」を選択します。アリーナ1のペトリ皿の直径に沿って校正線を引きます。直径の測定値を9 cmに変更します。右側のツールパネルで「validate arena settings」を選択します。次に、左側のコントロールバーで「detection settings」を選択します。検出設定1を選択し、右側のツールボックスにあるドロップダウンメニューからグレースケールを選択します。「検出」の下で、範囲を0から83に設定します。検出設定を右クリックし、「検出設定2」という名前で新しい設定を作成します。グレースケールが選択されたままであることを確認し、他のパラメータは変更しないでください。エクスペリメンタル・エクスプローラーでトライアルリストを選択し、上部ツールバーの「変数追加（add variable）」をクリックします。ユーザー定義変数の名前を「Treatment」として設定します。「user defined treatment」列にある predefined values のドロップダウンバーを選択し、事前定義値として「control」と「treatment」を追加します。上部ツールバーにある「add trials」ボタンをクリックし、2つのトライアルを追加します。次に、各アリーナについて、それがコントロールアリーナかトリートメントアリーナかを選択してください。次に、エクスペリメント・エクスプローラーパネルにあるデータプロファイルを選択します。左側の列で、「ユーザー定義独立変数」の見出しの下にある「treatment」を選択してください。これにより、フローチャートのある領域にフィルターボックスが追加されます。ポップアップボックスでCを選択し、新しく作成されたフィルターを開始ボックスと結果ボックスの間に配置します。フローチャートの矢印が、開始ボックスからフィルター、そして最終的に結果ボックスへと向くように調整されるはずです。この手順を繰り返しますが、今回はフィルターにTを選択し、共通要素セクションでresultを選択してください。新しく作成したボックスをフローチャート領域に移動し、ボックス同士を矢印で接続してファイルを保存します。ビジュアルトラッキングプログラムを起動し、このアッセイ用に作成して保存した実験ファイルを開きます。検出設定2を選択してください。次に、16枚のペトリ皿のうち8枚の中心に、対照群の糖アガロースキューブを配置します。残りの8枚の皿に対しても、同様の手順で糖アガロース化合物キューブを配置します。ピンセットを使用して、プラスチックボックスからミツバチを1匹取り出し、対照群のペトリ皿のいずれか1枚に入れます。残りの15枚のシャーレについても、この手順を繰り返します。すべてのシャーレをライトボックスの上に置きます。赤色スペクトルに設定されたLEDライトアレイでライトボックスを下から照らし、アリーナ検出領域が各シャーレのアリーナに合うように配置します。外部光を遮断し、アリーナ内の影を軽減するため、ボックスとカメラ全体を黒いプラスチックシートで覆います。ペトリ皿を設置した後、「detection settings one」が選択されていることを確認してください。この時点で、視覚トラッキングソフトウェアは、ペトリ皿アリーナ内のミツバチのみを検知しているはずです。次に、エクスペリメントエクスプローラーからacquisitionを選択します。右側のacquisitionコントロールポップアップボックスにある緑色のstart trialボタンを押し、記録を開始します。アッセイを10分間実行した後、acquisitionコントロールポップアップボックスの赤色のstop trialボタンをクリックして記録を停止します。個々のミツバチの摂食行動に及ぼすDEETの影響に関する代表的な結果をここに示します。コントロールキューブにさらされた個体は、摂食ゾーンで平均343秒過ごしましたが、DEETを含むキューブにさらされた個体では16秒でした。ここでは、2種類の異なる化合物が個々のミツバチの摂食行動に及ぼす影響の代表的な結果を示します。非忌避化合物を曝露させた個体は、給餌ゾーンに平均282秒間滞在したのに対し、対照群は約352秒間滞在した。忌避化合物を曝露させると、給餌ゾーンでの滞在時間は約23秒と有意に短縮した。これは、平均493秒間滞在した対照群と比較してである。この手法を習得し、適切に実施すれば、20分で完了させることができます。この手順を行う際は、あらかじめすべての準備を整え、ミツバチを十分な時間絶食させることが重要です。このビデオを視聴することで、ビデオトラッキングソフトウェアを用いて、餌に注入された化合物の個々のミツバチへの影響をどのように判定するかについて、十分に理解できるはずです。本手順に続き、化合物のコロニーレベルへの影響に関するさらなる疑問を解決するために、近接場アッセイやフィールドアッセイなどの他の手法を実施することが可能です。本技術の開発により、昆虫学分野の研究者が新しい化学物質や、それがミツバチの採餌行動に及ぼす影響を探索する道が開かれました。化合物の取り扱いは極めて危険な場合があるため、本手順の実施中は、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じてください。

video-tracking-protocol-to-screen-deterrent-chemistries-for-honey-bees

Research

JoVE Journal

Environment

環境

このプロトコルでは、条件に触覚刺激にミツバチを活かしたとファインスケール触角サンプリングパターンの運動を解析するための2Dモーションキャプチャ技術を導入する方法を示しています。...

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。...

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

ミツバチ(Apis mellifera)のために開発されたテング拡張応答(PER)条件付けプロトコルは、多くの昆虫種における学習のいくつかの異なるメカニズムを研究するための生態学的に関連性があり、容易に定量化可能な手段を提供します。...

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

このビデオは、マルハナバチの選択行動を監視するためのRFID(Radio-Frequency Identification)と動きに敏感なビデオ録画方法について説明しています。...

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選​​択行動の記録を自動化

侵襲Africanizedミツバチによって鳥の巣箱のコロニー形成を防止することが巣サイト限られた鳥の保護活動のために重要です。私たちは「プッシュ」ミツバチ離れた巣箱から撥殺虫剤、ペルメトリンとの統合害虫管理のアプローチを提供し、フェロモン餌群れトラップに向かって、それらを「プル」。...

ミツバチによって植民地化鳥の巣箱を削減するためのプッシュプルプロトコル

溶液中の栄養素や毒素に対する自由に動くマルハナバチ(Bombus terrestris)の口器の短期的な味覚反応を調査するための新しい行動アッセイが説明されています。...

小説行動アッセイ個人の味覚応答を調査するために、自由に移動バンブル蜂（<em&gt;セイヨウオオマルハナバチ</em&gt;）

役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール - ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。...

シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します

この原稿は、自由飛行ミツバチのための単純な非侵襲的方法、ならびに拘束ミツバチの正確な局所治療を可能にする、より侵襲性の変異体を含む、ミツバチへの薬理学的薬剤を投与するためのいくつかのプロトコルについて説明します。...

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、<em&gt;アピスミツバチ</em

ここで我々が提示 個々ミツバチと蜂の巣コロニーの両方に農薬汚染された食物を供給するための方法。手順は、基本的な幼虫の食事のとも蜂の巣コロニーの自然条件にin vivoで供給することにより、個々のミツバチへの農薬の影響を評価します。...

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

殺虫剤の致死量は定期的にまたは visual...

致死の農薬暴露の蜂蜜の蜂のコロニー レベルの効果を監視

このプロトコルは、従来のコンピューターを使用して従来の web カメラの動画から昆虫のアンテナとテングの位置のフレーム単位で追跡するため、斬新なソフトウェア、SwarmSight を使用するための手順を説明します。無料、フリー、オープン ソースのソフトウェアは、フレーム ・ プロセスが約 120...

SwarmSight: 昆虫アンテナの動きと共通の準備と従来のハードウェアを使用して吻伸展反射のリアルタイム追跡

学ぶ ビデオトラッキング法によるApis melliferaの化学的忌避物質スクリーニング。個体の餌取り行動を定量的に評価し、農薬からの pollinator 保護戦略を開発するための迅速で再現性の高い手法です。

ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

さらに動画を探す