Name: 発生する感染性病原体の除去のための手洗いの有効性を試験する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ手洗い効果評価法。非病原性大腸菌とPhi6バクテリオファージを用いて、塩素系溶液や石鹸など複数の手洗い方法の除菌効果を定量的に比較し、感染症予防の科学的根拠を提供します。

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この作業は、米国防災庁（AID-OFDA-A-15-00026）によって支援された。 Marlene WolfeはNational Science Foundation（助成金0966093）の支援を受けました。

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

ここで説明する方法は、管理された実験室環境で手洗いの有効性をテストするためのアプローチを提供します。この方法は、人間のボランティアと代理の非感染性生物の使用を強調しています。この方法を使用すると、1)手洗い方法の有効性と2)すすぎ水中での生物の持続性の違いを実証することができました。このプロトコルを提示する目的は、感染症に関連する幅広い代理生物と手洗い方法をテストするために適応できる一般的なフレームワークを提供することです。
この方法の使用中に、2つの重要なデータ品質の推奨事項が重要であると指摘されました。まず、接種剤は、一連のテスト全体で可能な限り同様に、損失を最小限に抑える方法で適用する必要があります。これは、統計的に有意な結果が得られるように、十分な接種剤が手に適用されるようにするためです。第二に、以前の研究では、最初の洗浄とその後の洗浄の間に有意差がある可能性が高いが、クレンジングラウンド後に実行される後続の洗浄間には有意差がないことが示されているため、テスト前に手洗いせずにプロトコルを実行する「クレンジング洗浄」ステップを必ず完了してください<sup class='xre...

手洗いは、下痢や呼吸器疾患を含む、特に糞便 - 口腔または空中経路によって伝播される病気の拡大を防ぐために広く推奨されている1 。驚くべきことに、石けんと水（HWWS）による手洗いとアルコールベースの手指消毒剤（ABHS）による手洗い方法の有効性に関する比較可能な証拠はほとんどなく、生物を手から取り除く。初期の研究では、手洗い法とは対照的に手洗いの機械的作用が、ほとんどの生物の除去の原因となる可能性があることが分かっている2,3。さらに、手洗い法が最も効果的であるという比較の証拠はほとんどない。非公式の文献レビューでは、石鹸と手の消毒剤の有効性を生物の除去に比較した14の研究が確認された。これらの研究のうち、5人はABHSがより有効であることを見いだした4 、 </HWWSが9,10,11,12,13,14,15,12,13,14,15,16,17の間で有意差がないことが判明した。これらの知見は矛盾しており、手洗い後のすすぎ水中の生物の存続による疾病の継続的なリスクには対処していない。全体として、感染症を引き起こす病原体を除去するための手洗い方法の比較有効性に関する証拠は限られている。 この限られた証拠は、どの方法がアウトブレイクの状況に最も適切かについて不確実性をもたらしている。例えば2013年から2016年にかけての西アフリカでのエボラウイルス病（EVD）発生時に、いくつかの大規模な国際的対応者が、HWWS、ABHS、または0.05％塩素溶液に関する矛盾した推奨を提供した。世界保健機構（WHO）はHWWSまたはABHS（手が目に見えて汚れていない場合）を推奨しているが、手洗いには0.05％塩素溶液を使用することをMSCは推奨している。 WHOは、他の選択肢がない限り、塩素を使用すべきでないと述べている。なぜなら、それは皮膚18,19,20,21,22によって発せられる塩素要求のため他の方法よりも効果が低いからである。さらに、塩素溶液は、一般に、高濃度の次亜塩素酸塩（HTH）、局所的に生成され安定化された次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）、および苛性ソーダ（ジクロロイソシアヌレート（NaDCC））。西アフリカでのEVD流行に対応してWHOによって委託された体系的なレビューでは、最近、手洗いと塩素による比較の有効性を調査したわずか4件の研究しか見つかりませんでした23 。これらの研究でも矛盾する結果が得られましたが、これらの研究では、エボラウイルス10,24,25,26,27に類似した手洗いまたは調査された微生物について、0.05％の推奨塩素濃度を使用していませんでした。したがって、勧告はエビデンスベースであるとは認められず、どの勧告が最も効果的であるかは不明であった。 手洗いの介入は流行病の伝染を予防するための重要なツールであるため、感染病原菌の感染を予防するための手洗いアプローチを比較するためには、さらなる研究が必要です。これらのh洗濯推奨は証拠に基づいていなければならない。したがって、代理人または非感染性病原体を用いて実施される手洗い効力およびすすぎ水の持続性を試験する方法が開発された2,28,29。エボラウイルスの代理としてPhi6を使用し、共通指標生物として大腸菌（Escherichia coli）を使用した試料の結果をここに示す。このプロトコールでは、手洗いの有効性およびすすぎ水の持続性試験が提示される。

<table><tbody><tr><td>ソープバー</td><td>ダブ</td><td>ホワイト ビューティー バー ソープ</td><td></td></tr><tr><td>アルコールベースのハンド サニタイザー</td><td>ピュラー</td><td>アドバンスト インスタント ハンド サニタイザー 70% エチル アルコール</td><td></td></tr><tr><td>HTH パウダー</td><td>アクロス オーガニック 300340010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaDCC パウダー</td><td>メデンテック</td><td>クロルセプト 顆粒</td><td></td></tr><tr><td>NaOCl ソリューション</td><td>アクロス オーガニック</td><td>419550010</td><td></td></tr><tr><td>電解塩素剤</td><td>AquaChlor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨードメトリック滴定装置</td><td>Hach</td><td>1690001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>MP Biomedicals</td><td>NC0117242</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー</td><td>BP1421-100</td><td></td></tr><tr><td>ウシ ムチン</td><td>EMD ミリポア</td><td>49-964-3500MG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;m フィルター</td><td>EMD Milipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>スキン pH プローブ</td><td>Hanna Instruments</td><td>H199181</td><td></td></tr><tr><td>大型 Whirlpak サンプルバッグ</td><td>Nasco</td><td>B01447WA</td><td></td></tr><tr><td>小型 Whirlpak サンプルバッグ</td><td>Nasco</td><td>B01323WA</td><td></td></tr><tr><td>ファンネルボトル</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120850001</td><td>ボトルの蓋に適切なサイズの穴を開けて、適切な流量で水を分配する漏斗を形成することができます</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ThermoScientific</td><td>615090010</td><td>水と混合して70%エタノールを生成</td></tr><tr><td>スプレーボトル</td><td>Qorpak</td><td>PLC06934</td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>フィッシャーBioReagents</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ループ</td><td>Globe Scientific</td><td>22-170-204</td><td></td></tr><tr><td>Phi6</td><td>HER</td><td>102</td><td></td></tr><tr><td>栄養ブロス</td><td>BD Difco</td><td>BD 247110</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 100 分光光度計</td><td>ゼネラル・エレクトリック</td><td>28-9182-04</td><td></td></tr><tr><td>チオ硫酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・ケミカル</td><td>S445-3</td><td></td></tr><tr><td>メンブレンフィルター(47 mm、0.45 &micro;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>m-ColiBlue24 ブロスメディア</td><td>EMD Millipore</td><td>M00PMCB24</td><td></td></tr><tr><td>パッド付きシャーレ (47 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-500</td><td></td></tr><tr><td>真空マニホールド</td><td>Thermo Scientific/Nalgene</td><td>09-752-5</td><td></td></tr><tr><td>フィルター漏斗</td><td>Thermo Scientific/Nalgene</td><td>09-747</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae</td><td>HER</td><td>1102</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010031</td><td>溶液は、任意の基本レシピに従ってソース化合物から混合することもできます</td></tr></tbody></table>

発生する感染性病原体の除去のための手洗いの有効性を試験する方法

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

感染症の伝染を防ぐために手洗いが広く推奨されています。しかしながら、一般的な手洗い方法の有効性については、匹敵する証拠はほとんど存在しない。さらに、手洗い法を比較して、感染性病原体を除去するのに最も効果的なものを決定する証拠はほとんどない。感染症発生時に使用される可能性のある手洗いのさまざまなアプローチの証拠を提供するための研究が必要です。ここでは、手から微生物を除去する際の手洗い方法の有効性およびすすぎ水中でのその持続性を評価するための実験方法が記載されている。ボランティアの手を最初に試験生物にスパイクし、次に各手洗い方法で洗浄する。一般に、代理微生物は、ヒト被験体を疾患から保護するために使用される。洗浄後にボランティアの手に残っている生物の数は、変更された「グローブジュース」法を用いて試験される。手はエルツ微生物を懸濁させ、膜濾過（バクテリア）またはプラークアッセイ（ウイルス/バクテリオファージ）による分析に利用できるようにスクラビングされる。手洗いから生成されたすすぎ水は、分析のために直接収集される。手洗い効果は、手洗い後に採取した試料と手洗いをしていない試料との対数減少値を比較することによって定量化する。すすぎ水の持続性は、様々な手洗い方法からのすすぎ水サンプルを、単に水で手洗いした後に採取したサンプルと比較することによって定量化される。この方法は、ヒトボランティアの安全性を維持するために代理生物を使用する必要性によって制限されるが、 インビトロ研究では複製が困難で手洗いの有効性に関する研究ギャップやリンスにおける感染性生物の持続性を補う水。

ここでは、プロトコル（ 図1 ）は18名のボランティアで完了し、各ボランティアは大腸菌とPhi6の両方を用いて試験した。土壌負荷の有無にかかわらず大腸菌による手洗い結果と土壌負荷によるPhi6との間に有意な差が見られた（ 図2および図3 ）。土壌負荷のない大腸菌では、HTH、NaDCC、および安定化NaOClを用いた手洗いのすべてが、水のみによる手洗い（F（6,102）= 2.72、p = 0.034）より有意に大きな対数減少をもたらした。土壌負荷では、HTHは水のみ、HWWSおよびABHS（F（6,102）= 3.94、p &lt;0.001）よりも大腸菌の対数減少が有意に大きかった。土壌負荷のないPhi6の方法間に有意差はなかった（F（6,66）= 2.04、p = 0.073）。しかし、土壌負荷のあるPhi6（F（6,...

感染症の伝染を防ぐために手洗いが広く推奨されています。しかし、どのような手洗い方法が感染症病原体を除去するのに最も効果的であるかに関する証拠はほとんどない。我々は、微生物を除去する手洗い方法の有効性を評価する方法を開発した。

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

この実験の全体的な目的は、標的となる微生物を実験的に接種した手において、さまざまな手洗い方法の比較有効性を検証することです。この手法は、感染症の予防に役立つ重要な疑問に対する情報を提供できます。これにより、研究者は特定の標的微生物に対する手洗いの有効性を調査することが可能になります。この手法の主な利点は、柔軟性が高く、多くの異なる生物の調査に適応させることができる点にあります。私たちがこの方法を考案したきっかけは、エボラ出血熱の対策として手洗いに塩素溶液が使用されていたものの、当時その有効性を示す根拠がなかったことに気づいたことでした。適格な被験者を募集し、テキストプロトコルに従って手洗い溶液を調製した後、非病原性のE.Coli株をLB寒天培地にストリークして細菌を準備し、37 °Cで24時間培養して単一コロニーを得ます。実験開始の1日前、滅菌済みのループを用いてプレートから単一のコロニーを採取し、10 mLのLBブロスに接種します。培養液を37 °Cで振盪しながら一晩インキュベートします。実験当日の朝、一晩培養した培養液1 mLを20 mLの新鮮なLBブロスに加えます。培養液を約2時間30分インキュベートし、菌密度を10⁸ CFU/mL以上に到達させます。その後、分光光度計を用いて培養液の濃度を推定します。試験の直前に、細菌またはウイルス懸濁液68%と、塩化ナトリウムまたは土壌負荷物32%で構成される接種液を調製します。旋回させるか、あるいは穏やかにボルテックスして混合します。テキストのプロトコルに従って被験者の準備を整えた後、人差し指と中指の間の水かき部分に平らなチップを持つ皮膚用pHプローブを当て、各被験者の皮膚のpHを測定します。電極が皮膚に密着していることを確認し、pH測定値を記録してください。次に、ボランティアに両手を合わせた状態にしてもらいます。その後、手をスパイクするため、接種物を各手のひらに750 µLずつ慎重にピペットで分注します。ボランティアの手をスパイクする際は、接種物を一切こぼさないことが重要です。ボランティアに対し、この工程が重要であることを再確認させ、手順を開始する前に水で練習する機会を与えてください。ボランティアには、手のすべての表面に接種物が塗布されるまで、できるだけ摩擦を抑えながら、両手を静かにこすり合わせるよう指示します。その後、接種物を乾燥させるため、さらに30秒間、体を離して手を静止させたままにするよう指示してください。次に、テキストプロトコルに記載されている方法のいずれかを用いて手を洗います。石鹸で手を洗う場合は、10 millilitersの超純水で手を濡らします。ボランティアに石鹸を泡立てさせ、さらに20秒間、手を互いにこすらせてください。室温の超純水を500 milliliters、漏斗を用いて1.5 liters/minの流速でボランティアの手に注ぎ、大型サンプル回収バッグに回収して洗浄し、2時間以内にサンプルを処理します。すべての塩素溶液については、塩素溶液200 millilitersを漏斗を用いて1.5 liters/minの流速でボランティアの手に注ぎ、ボランティアに手を十分にこすり合わせてもらいます。別の手洗い方法として、ボランティアに手指消毒剤を使用して手を洗ってもらいます。手のすべての表面を丁寧にこすることが重要であるため、参加者には手のひら、爪、指の間など、各部位に重点を置いてこするよう指示し、その後、手全体を十分にすすがせる。コントロールAでは、接種後に手洗いの工程を行わない。コントロールBでは、既知の流速を持つ漏斗を用いて、室温の超純水のみで手洗いを行う。手洗い後、速やかに、被験者の検査対象の手を、75 millilitersのLeeuwinが入ったサンプルバッグに手首まで浸します。バッグの上部を手首に沿ってしっかりと保持してください。被験者に、指の間や爪の下まで行き届くよう注意しながら、溶液の中で30秒間、手を静かにこするように指示してください。バッグの外側から手を30秒間ゆっくりとマッサージし、手首まで手がすべてLeeuwinで十分に洗浄されるようにします。バッグを密閉し、適切なアッセイに従って処理します。各手洗い方法でプロセスを繰り返す前に、ボランティアに温水と石鹸を使用してシンクで十分に手を洗わせてください。最後に、70%エタノールをボランティアの手の両面に塗り込まれるまでスプレーし、乾燥させます。サンプルを分析するために、火炎および、滅菌済みろ過漏斗と真空接続を備えたろ過マニホールドを準備します。ピンセットをエタノールに浸し、火炎滅菌して滅菌します。ピンセットを使用して、0.45 micronフィルターのグリッド面を上に向け、ろ過マニホールドに配置します。次に、少量の滅菌PBSを使用してフィルターを濡らします。ベースに漏斗を設置し、サンプルをフィルター上に直接ピペッティングまたは注入します。サンプル全体がメンブレンを通過するまで真空吸引を行います。次に、滅菌PBSを用いて漏斗の側面を洗浄し、再度真空吸引を行います。続いて漏斗を取り外し、ピンセットを火炎滅菌して、ベースからフィルターを持ち上げます。次に、フィルターの格子面を上にし、表面に密着するように注意しながら、ペトリ皿内の培地上に静かに置きます。プレートを反転させ、37 °Cで24時間培養します。培養後、E.Coliのコロニー数を数え、データを記録します。テキストプロトコルに従ってデータ解析を行います。このビデオで説明したプロトコルは、E.ColiおよびPhi6を用いて試験した18名のボランティアで完了しました。土壌負荷なしのE.Coliにおいて、HTH、NaDCC、および安定化NaOClによる手洗いは、いずれも水のみでの手洗いよりも有意に大きなログ減少を示しました。土壌負荷がある場合、HTHは、水のみでの手洗い、石鹸を用いた手洗い、およびABHSと比較して、E.Coliの有意に大きなログ減少をもたらしました。土壌負荷のないPhi6については、方法間で有意な差は認められませんでした。しかし、土壌負荷のあるPhi6では、水のみの方がABHSまたは安定化NaOClよりも高いログ減少率を示し、石鹸を用いた手洗いはABHS、安定化NaOCl、および調製NaOClよりも高いログ減少率を示しました。また、HTHはABHSおよび安定化NaOClよりも高いログ減少率を示し、NaDCCは安定化NaOClおよびABHSよりも高いログ減少率を示しました。これらのグラフに示されているように、塩素は石鹸による手洗いよりも、すすぎ水中に残存するE.Coliのログ減少率を有意に大きくしました。最後に、土壌負荷のないPhi6においても同様の傾向が見られ、すべての塩素溶液において、石鹸による手洗いよりもすすぎ水中のPhi6が有意に減少しました。一方、Phi6と土壌負荷がある場合では、すすぎ水中の減少に有意な差は見られませんでした。この手順を実施する際は、各条件の有効性の結果が、2つのコントロールの結果を比較して算出されることを留意することが重要です。したがって、各手洗いオプションにおいて、各ステップを一貫して行うことが非常に重要となります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Holt-Torres, P. S. et al. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the use of the focused-contact exposure method to evaluate the antibacterial activity of nanostructured surfaces. It outlines the steps involved in establishing direct contact between bacteria and the nanostructured surface, incubation, bacterial collection, and colony counting to assess viability.

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このビデオでは、ペグプレートを使用してバイオフィルムを効率的に除去する抗菌化合物をスクリーニングするアッセイを示しています。この方法論は、抗菌化合物で処理した後のバイオフィルムの代謝状態をモニターし、バイオフィルムの最小根絶濃度の決定を容易にします。...

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実験室で一般的に使用される領域をプリオン汚染と効果的な除染のために評価する方法が不足しています。ここで説明するプロトコルは、特定のラボの個々のニーズに合わせて簡単に変更できるラボプリオン安全性スワイプテストを実装するための重要な基本を提供します。...

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優先細菌性病原体の同定のための簡単​​な方法は、遺伝子組み換えレポーターファージを使用することです。その特定の宿主種に固有のこれらのレポーターファージは、、急速に宿主細胞に生物発光信号応答を伝達することが可能です。ここで、我々は、検出のためのレポーターファージの使用について説明します。...

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学ぶ手洗い効果評価法。非病原性大腸菌とPhi6バクテリオファージを用いて、塩素系溶液や石鹸など複数の手洗い方法の除菌効果を定量的に比較し、感染症予防の科学的根拠を提供します。

発生する感染性病原体の除去のための手洗いの有効性を試験する方法

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