Name: 血管平滑筋細胞の処理のための凍結乾燥ベリー粉末からのポリフェノールの抽出および精製インビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶ凍結乾燥ベリー粉末からポリフェノールを抽出・精製し、血管平滑筋細胞のERKリン酸化を抑制する方法。この技術は心血管系の老化予防研究に活用できます。

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この研究は、米国心臓協会（14GRNT20180028）およびフロリダ州立大学研究および創造性評議会（COFRS）によって資金提供を受けた。

1.試薬の調製<ol><li> 80mLの無水エタノール（分子生物学グレード）80mLと細胞培養グレードの滅菌水20mLを混合して80％エタノール（100mL）を調製する。 </li><li>ポリフェノール抽出物（10mg / mL）を調製するには、CEまたはPEを10mg計量する。細胞培養フードの下にプレーンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）1mLを加える。溶液をボルテックスする。 200μLずつ分注し、-20℃で保存します。 </li><li>溶解緩衝液を調製する。 <ol><li> 1M HEPESストック溶液（pH 7.4;最終50mM）5mL、5M NaClストック溶液（50mM最終）、1mLの0.5M EDTAストック溶液（5mM最終）、2mLの0.5 M NaFストック溶液（最終10mM）、700mM Na 3 VO 4ストック溶液（2mM最終）286μL、200mM Na 4 P 2 O 7ストック溶液（10mM最終）5mL、および5mLの水中で調製した20％Triton-X-100ストック溶液（最終濃度1％）。水を加えて100mLの容量にする。 4℃で保存してください。 </li><li）プロテアーゼ阻害剤カクテル10μL/ mLを添加する。細胞が溶解の準備ができたら新鮮なものを加える。 </li></ol></li><li> Laemmliサンプルバッファー（4x）を調製する。 <ol><li> 2Mトリスストック溶液（pH6.8）31.25mL、グリセロール100mL、水中で調製した20％硫酸ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液50mLおよびβ-メルカプトエタノール50mLを添加する。 250 mLまでの水を加える。 4℃で保存してください。 </li></ol></li><li>トリス緩衝生理食塩水（TBS）緩衝液を調製するために、トリス（最終25mM）3g、KCl（最終2.5mM）0.18g、およびNaCl 8.76g（最終150mM）を秤量する。 pHを7.4に調整し、水を1Lまで加えます。室温に保ちます。 </li><li> TBS-Tを調製するために、99.7.5mLのTBSおよび2.5mLの20％Triton-X-100溶液を水中で調製する。 RTを維持してください。 </li></ol> 2.ブラックリー抽出物の調製<ol><li>凍結乾燥したベリー粉末からの粗抽出物の調製。 <ol><li>凍結乾燥したブラックベリー粉末（または5gの新鮮な粉末）10gを秤量する。冷凍果実を使用する場合は、それをカット抽出を開始する前に非常に小さな断片に。 </li><li> 1L丸底三角フラスコ中で100％の80％水性エタノールと果汁を混合する。 </li><li>混合物を、42kHzで20分間、25℃で超音波浴を使用して135Wで、時間間隔なしで超音波処理する。抑圧された光で連続窒素パージを行って超音波処理を行います。凍結果実の場合、インキュベーション時間を4時間に増加させます。 </li><li>冷却吸引したブフナー漏斗を用いて＃2濾紙を通して混合物を濾過し、真空吸引する。 注：このステップの終わりに、サンプルの残留物がろ紙に現れます。これはフィルターケーキと呼ばれています。 </li><li>フィルターケーキを50mLの100％エタノールですすぐ。濾液を保存し、80％水性エタノール100mLを含む1L丸底フラスコにフィルターケーキを加える。 </li><li>残留物の抽出プロセスを繰り返す（ステップ2.1.2〜2.1.4）。 </li><li> 2つの濾液を丸底フラスコに合わせ、追加の50mLの80％エタノール水溶液で洗浄した。 注：最終容量は約300 mLにする必要があります。 </li><li>ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させます（62℃、50rpm）。エタノールがもはや蒸発しなくなるまで、このプロセスを続ける。 注：このプロセスには約45分かかります。 </li><li>試料を50 mLコニカルチューブに移す。窒素ガスをチューブの頂部に10分間注入することによってエタノールを蒸発させる。 注：このステップはエタノールの完全な蒸発を確実にするために必要です。この段階での試料の容量は約20mLである。 </li><li> -80℃で少なくとも24時間凍結する。 注：このステップは、より効率的な凍結乾燥プロセスを可能にするために必要です。 </li><li> -50℃で約8時間凍結乾燥します。試料を-20℃で保存する。 注：凍結乾燥機は、試料を乾燥させるためにチャンバー内に-50℃で強力な真空を作りますが、ポリフェフのような化合物のほとんどを保存しますnols。 </li></ol></li><li>粗抽出物からの精製ポリフェノール抽出物の調製。 <ol><li>凍結乾燥した抽出サンプルを秤量する。 注：この段階での抽出物の容量は約10mLです。 </li><li> 2倍量（約20mL）のクロロホルムを粗抽出物に加え、撹拌プレート中で5分間溶液を振とうする。 </li><li>混合物を分液漏斗に注いだ。粗抽出物をRTで1時間デカントし、精製画分を得る。 注：この段階では、2相混合物が形成されます。 </li><li>分液漏斗から底部層（クロロホルム相）を捨て、水層を清浄なビーカーに集める。 </li><li>水性画分に2倍量の酢酸エチルを加え、マグネチックスターラーバーを用いて混合物を室温で5分間撹拌する。 </li><li>冷却吸引したブフナー漏斗を用いて＃2濾紙を通して混合物を濾過し、真空吸引する。 </li><li>ろ過されたサンプルを集め、丸底フラスコに移して私達になるロータリーエバポレーターで処理した。 </li><li>回転蒸発器を62℃および50rpmに設定し、酢酸エチルを約30分間蒸発させる。 </li><li> -50℃で約8時間凍結乾燥します。試料を50 mLコニカルチューブに移し、-20°Cで保存する。 </li></ol></li></ol> 3.ベリー抽出物によるVSMCの処理<ol><li> VSMC培養物。 <ol><li>前述の29のように、酵素消化を行うことにより、Sprague-Dawleyラットの胸部大動脈からVSMCを単離する。説明したようにVSMCを培養する29 。 </li><li> 10％ウシ胎仔血清（FBS）、100U / mLペニシリン、100mg / mLストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを補充した1g / Lグルコースを含むDMEMを用いてVSMCの培養のための完全培地を調製する。完全培地を4℃で保存する。 </li></ol></li><li> VSMCsとポリフェノール抽出物のインキュベーション。 <ol><li> VSMCを分割するには、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄する。 4mLのPBSおよび2mLのトリプシンEDTA 0.25％を添加する。 CO 2インキュベーター内で37℃で5分間細胞をインキュベートする。 <ol><li>細胞を回収し、15mLの遠心分離管内で2mLの完全培地と混合し、1,100×gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。血球計数器を用いて細胞を数える。 </li><li> 6ウェル培養プレート中に1ウェルあたり50,000個のVSMCを播種し、10％FBSを含む完全培地中でそれらが90％コンフルエンシー（約3日）に達するまで増殖させる。加湿5％CO 2インキュベーター内で37℃でVSMCを維持する。 </li></ol></li><li> 1g / Lのグルコース、100U / mLのペニシリン、100mg / mLのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および0.5％のFBSを含むDMEM培地を用いた処理のための培地を調製する。処理培地は4℃​​で保存する。 注：ポリフェノール抽出物とAng IIをこの細胞を用いて細胞に直接加えるジウム。 </li><li> 10mgの抽出物を1mLのプレーンDMEM培地に溶解することにより、10mg / mL粗抽出物（CE）またはポリフェノールの精製抽出物（PE）のストック溶液を調製する。 -20℃で200μLに分注してください。 </li><li> VSMCを0.5％FBSを含む処理培地2 mLとインキュベートし、CEまたはPE抽出物を加えて50〜500μg/ mLの濃度にする。新鮮なポリフェノール抽出物を添加して24時間ごとに培地を交換する。細胞を3日間処理する。 </li><li> Ang IIまたは他のホルモンおよび増殖因子での処置のために、Ang II（100nM）の添加前に0.5％FBSを含む処理培地で細胞をインキュベートすることにより、細胞を少なくとも24時間飢えさせる。 注：Ang IIを添加する前に、0.5％FBS処理培地中でCEおよびPEを添加した場合と添加しない場合のインキュベーションを推奨します。 <ol><li>飢餓の24時間後、100nMのAng IIを加える。新鮮なCE、PE、またはAng IIで24時間ごとに3日間処置培地を交換する。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞試料の調製。 <ol><li>冷PBSで処理した細胞を2回洗浄し、氷上で200μLの溶解緩衝液でそれらを溶解する。 </li><li>細胞スクレイパーを使用して細胞溶解物を収集し、溶解物を1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。全細胞溶解物を氷上で20分間インキュベートし、5分毎にボルテックスする。 </li><li>その間に2秒間休止させながら、細胞抽出物を125Wで3回バーストして10秒ずつ超音波処理する。超音波処理の間、サンプルを氷上に置いておきます。 </li><li> 595nmでタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質濃度を測定する。 </li><li>ウエスタンブロットによる分析のためにサンプルを-20℃で保存する。 </li></ol></li><li>ウエスタンブロット。 <ol><li>対照未処理およびポリフェノール処理サンプルまたはAng II処理サンプルから等量のタンパク質（約50μg）を溶解緩衝液で混合して、最大総量50μLを得る。 16μLの4倍Laemmliサンプルバッファーを添加する。試料を75℃で5分間加熱する。 </li><li>サンプルを分離する10％SDS-PAGEゲル中でインキュベートし、そして特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析のために半乾式トランスファーシステムで10Vで75分間PDVFメンブレンに移す。 </li><li> TBS 0.05％Triton-X100緩衝液（TBS-T）中2％ミルクで膜を20分間ブロックする。 </li><li>膜をTBS（各5分）で少なくとも3回洗浄することによってミルクを除去し、4℃で1時間、一次抗体と共に室温またはO / Nでインキュベートする。 </li><li>膜をTBS-Tで3回、それぞれ10分間洗浄し、HRP結合二次抗体と共に45分間インキュベートする。 </li><li>膜をTBS-Tで3回、各10分間洗浄し、増強化学発光（ECL）によって発色させる。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

ベリーから単離されたポリフェノールは、明確な組成物を含有する。本明細書に記載のエタノールベースの抽出プロトコールは、BLの粗製および精製ポリフェノール抽出物中に存在する種々のレベルのフェノール酸およびフラボノイドの同定を可能にした（ 表1 ）。 CEは没食子酸、フェルラ酸、4-O-カフェオイルキナ酸、5-O-カフェオイルキナ酸に富んだ。精製プロセスは、没食子酸およびp-クマル酸のレベルを有意に変えなかった。しかしながら、それは3- O-カフェオイルキナ酸のレベルを170.5〜235.3ppmに、ケルセチンを24.5〜95ppmに増加させた。対照的に、フェルラ酸およびルチンは、CEの精製中に失われた。 50〜500μg/ mL CEおよびPEを用いたVSMCの処理は、両方の抽出物がERK1 / 2の基礎的リン酸化を減少させるのに有効であることを示した。しかしながら、PEは、より低い濃度でこのキナーゼの活性におけるより強いダウンレギュレーションを示した：100＆CEは400〜500μg/ mLであったのに対し、PEは181μg/ m...

ポリフェノールは、その構造中に少なくとも1つのフェノール環を含む化合物であり、植物界1に多量に存在する。人間は、そのような化合物の存在を意識することなく、何千年もの薬用植物を摂取してきた2 。多くの果物と野菜には、フラボノイド、スチルベン、フェノール酸などの異なる量であるにもかかわらず、いくつかの共有ポリフェノール化合物があります。ポリフェノールはしばしばカラフルな果物や野菜と関連していますが、これは厳密には当てはまりません。例えば、ゼアキサンチンやキサンチンは、タマネギやニンニクなど、カリカリではない野菜に含まれています。これらは、スカリオンの家族に由来し、数多くの健康上の利点に関連しています4 。ポリフェノールは、いくつかの健康上の利益に関連するほか、植物を昆虫から保護して、d紫外線2 。ポリフェノールは人間の食生活によく見られ、反応性酸素種（ROS）6,7,8を取り除くことができるため、強力な抗酸化物質と考えられています。また、抗炎症剤9 、抗菌剤10 、抗高血圧剤11 、および抗発癌性12,13の特性を有する。 疫学研究は、フラボノイドの摂取と心血管疾患（CVD）の発生率16,17および死亡率14,15との間に逆相関があることを示している。ベリーは米国で広く消費されており、フラボノイドを含む多量のポリフェノールを含有している。例えば、ブラックベリー（BL）ジュース（300<html> mL / d）を8週間投与すると、異脂肪血症患者の収縮期血圧が有意に低下した18 。 Jeong ら 19人は、1日に2.5gのブラックラズベリー（BRB）抽出物を消費する高血圧前の男性および女性が、プラセボを摂取する人々と比較して、24時間および夜間の血圧が低いことを報告した。ラズベリー（RB）は血圧を低下させ、一方、自然発症高血圧ラットではスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の発現を増加させる20 。最近、BL、RB、およびBRBは、血管平滑筋細胞（VSMC） 21におけるアンジオテンシンII（Ang II）によって誘導されるROSおよび老化のレベルを低下させることが示されている21 。さらに、BL抽出物からのアントシアニン画分は、誘導性酸化窒素シンターゼ（iNOS）の発現を減少させ、リポ多糖（LPS）刺激における核因子κB（NF-κB）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の活性を阻害したJ774細胞ass = &quot;xref&quot;&gt; 22。 BRB抽出物は、高脂肪食餌を与えたマウスのNF-κB活性化およびシクロオキシゲナーゼ2（COX-2）発現をインビトロで低下させ、脂質プロファイルを改善し、アテローム性動脈硬化病変を形成しなかった24 。ベリーにおける最も豊富なフラボノイドと考えられているアントシアニンは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）産生を低下させ、VSMCの増殖および遊走を減少させることにより、LPS刺激RAW 264.7マクロファージにおける炎症応答を調節する。 ヒトの健康と疾病におけるポリフェノールの役割を理解することへの関心が高まっているので、抽出方法を最適化することが重要である。溶媒抽出は、費用効果が高く容易に再現可能であるため、その目的で広く使用されている。この研究では、エタノールを用いて溶媒抽出を行い、超音波補助抽出物この方法は、KimとLeeの手法を応用したものである27 。クロロホルムおよび酢酸エチルを用いる粗抽出物（CE）の精製および分画を実施して、Queires ら 28から適合された精製抽出物（PE）画分を得た。さらに、BL由来の精製されたポリフェノール抽出物とERK1 / 2の基礎的なリン酸化を減少させるBLの精製されたポリフェノール抽出物との効果を比較し、精製されたBLポリフェノール抽出物のAng II誘発性VSMCsの抑制効果の代表例を提供した。

<table><tbody><tr><td>アンジオテンシンII</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>VSMCの治療</td></tr><tr><td>&β;-actin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>一次抗体 (1:5000)</td></tr><tr><td>ブラックベリーフルーツ</td><td>マーサーフーズ</td><td></td><td>フリーズドライブラックベリーパウダー</td></tr><tr><td>カタラーゼ&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>一次抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>精製ポリフェノール抽出物の調製</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM</td>) <td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>VSMCs</td></tr><tr><td>エタノールの培養(分子生物学用絶対グレード)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>ポリフェノール抽出物の調製&nbsp;</td></tr><tr><td>エチルアセテート</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>精製ポリフェノール抽出物</td></tr><tr><td>ERK1/2</td>の調製 <td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>一次抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8.0</td><td>テクノバ</td><td>E0306</td><td>溶解緩衝液</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>ポリフェノール抽出物の調製</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>溶解バッファー&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc. (英語)</td><td>7760</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , 十水和物</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>リン酸化 ERK1/2&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (株)</td><td>9101S</td><td>一次抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Lysis</td></tr> buffer <tr><td>Protein assay dye 試薬</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>タンパク質濃度測定</td></tr><tr>用<td>PVDF転写膜</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>回転式エバポレーター</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>ポリフェノール抽出物の調製</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>ポリフェノール抽出物の調製</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>細胞抽出物の調製</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>一次抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>Whatman #2 濾紙</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>ポリフェノール抽出物の調製</td></tr></tbody></table>

血管平滑筋細胞の処理のための凍結乾燥ベリー粉末からのポリフェノールの抽出および精製<em&gt;インビトロ</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

疫学研究によると、フラボノイドの摂取量の増加は、米国および欧州における心血管疾患（CVD）による死亡率の減少と相関しています。ベリーは米国で広く消費されており、ポリフェノール含有量が高い。ポリフェノールは、多くの分子標的と相互作用し、抗酸化剤、抗炎症剤、および心臓保護作用を含む多くの陽性の生物学的機能を発揮することが示されている。ブラックベリー（BL）、ラズベリー（RB）およびブラックラズベリー（BRB）から単離されたポリフェノールは、アンジオテンシンII（Ang II）に応答する酸化ストレスおよび細胞老化を減少させる。この研究は、凍結乾燥果実からポリフェノール抽出物を調製するために使用されるプロトコルの詳細な説明を提供する。凍結乾燥したベリー粉末からのポリフェノール抽出は、80％水性エタノールおよび超音波補助抽出法を用いて行った。粗抽出物をさらに精製し、クロロホルムおよび酢酸エチルを用いて分画し、それぞれ、粗抽出物および精製抽出物の両方の効果を培養物中の血管平滑筋細胞（VSMC）で試験した。

BL、RBおよびBRBから単離されたポリフェノール抽出物は、Ang II 21に応答するVSMCの老化を減少させることが以前に示されている。これらの精製ポリフェノール抽出物は、Akt、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、およびERK1 / 2のリン酸化を減少させることによってAng IIシグナル伝達を調節することが示されている。 BLは、スーパーオキシドアニオンを産​​生する酵素であり、Ang IIによって強く上方制御されるNADPHオキシダーゼ（Nox）1の発現を減少させることによって老化を防止する。対照的に、RBおよびBRBは、抗酸化酵素SOD1、SOD2、およびグルタチオンペルオキシダーゼ1（GPx-1）の発現を増加させるので、Nox1非依存性メカニズムによる老化を防止する。 BLはSOD2発現を増加させないが、いずれの抽出物もAng II 21によるカタラーゼのダウンレギュレーションを減弱させない。 BLは、BLがSOD2およびカタラーゼ発現に及ぼ...

この作品は、凍結乾燥したベリーパウダーからポリフェノールが豊富な抽出物を調製するための段階的な方法を詳述しています。さらに、血管平滑筋細胞（VSMCs）を用いたペプチドホルモンアンギオテンシンII（Ang II）の存在下で、これらのポリフェノールに富む抽出物を細胞培養においてどのように使用するかについての完全な記述を提供する。

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

本プロトコルの全体的な目的は、将来的に細胞処理に使用可能な植物ポリフェノールの抽出および精製のための、簡便で再現性のある手法を提供することです。この手法は、ヒトの健康と疾患における機能性食品の役割に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。このエタノールを用いた超音波支援ポリフェノール抽出は、より高いポリフェノール収率を可能にする、簡便で再現性の高い手法です。クロロホルムを用いることで、糖、脂肪酸、タンパク質およびその他の分子を除去することができ、酢酸エチルを用いることでポリフェノールの分画が可能になります。このように濃縮されたポリフェノール抽出物は、本手法で述べるように、心血管系を含むさまざまな組織におけるポリフェノールの影響およびその作用機序を研究するために、in vitroおよびin vivoで利用できます。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに従って試薬を準備してください。次に、凍結乾燥させたブラックベリーパウダーを10 g量り取ります。このベリーパウダーを、100 mLの80%エタノール水溶液が入った1 Lの丸底フラスコに加えます。フラスコを25 °Cの超音波バスに入れます。減光下で窒素パージを継続しながら、42 kHz、135 Wで混合物を20分間超音波処理します。その後、冷却したブフナー漏斗と真空吸引を用いて、2番ろ紙で混合物をろ過します。ろ過ケーキを50 mLの100% ethanolで洗浄します。ろ液を保存し、フィルターケーキを100 mLの80%エタノール水溶液を含む1 Lの丸底フラスコに加えます。その後、超音波処理、ろ過、および混合物の洗浄による抽出工程を繰り返します。2つのろ液を、50 mLの80%エタノール水溶液を含む丸底フラスコにまとめます。ロータリーエバポレーターを用い、62 °C、50 rpmの条件で溶媒を蒸発させます。エタノールが蒸発しなくなるまでこの操作を継続してください。次に、サンプルを50 mLコニカルチューブに移します。チューブの上部に窒素ガスを10分間注入し、残っているエタノールを蒸発させます。サンプルを-80°Cで少なくとも24時間凍結させます。その後、サンプルを-50°Cで約8時間凍結乾燥させます。サンプルは使用するまで−20°Cで保存してください。まず、凍結乾燥させた抽出サンプルの重量を量り取ります。サンプルを入れた100 mLビーカーに、クロロホルムを約20 mL加えます。スターラーを用いて、溶液を5分間混合します。次に、混合液を分液漏斗に注ぎます。粗抽出液を室温で1時間静置し、時間をかけて分離させます。その後、下層を捨て、水層を清潔なビーカーに回収します。ビーカーに2倍量の酢酸エチルを加えます。マグネチックスターラーを用い、室温で5分間混合物を撹拌します。次に、冷却したブフナー漏斗と吸引装置を用いて、2号ろ紙で混合物をろ過します。ろ過したサンプルを丸底フラスコに移します。ロータリーエバポレーターを用い、62 °C、50 rpmの条件で、酢酸エチルを30分間蒸発させます。その後、サンプルを-50 °Cで8時間凍結乾燥させます。サンプルを50 mLコニカルチューブに移し、使用時まで-20 °Cで保存します。血管平滑筋細胞の培養後、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄します。次に、4 mLのPBSと2 mLの0.25% Trypsin-EDTAを加えます。37 °Cの二酸化炭素インキュベーターで5分間インキュベートします。その後、細胞を2 mLの完全培地を含む15 mL centrifuge tubeに移します。1,100 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのPBSで再懸濁します。血球計数計を用いて細胞数をカウントします。次に、6ウェル培養プレートに1ウェルあたり50,000個の細胞を播種します。10%胎児牛血清を含む完全培地を用いて、細胞を90%コンフルエントになるまで培養します。テキストプロトコルに記載されている通りに処理培地を調製し、4°Cで保存します。次に、粗抽出物または精製抽出物のいずれかを10 mg、1 mLのプレーンなDMEMに加え、10 mg/mLのストックソリューションを調製します。このストックソリューションを200 µLずつ分注し、-20 °Cで保存します。その後、0.5%胎児牛血清と目的濃度のストックソリューションを含む処理培地2 mLを細胞に加えます。加湿した5%CO2インキュベーター内にて、37 °Cで3日間培養します。その後、ホルモンまたは成長因子で処理する場合は、0.5%胎児牛血清を含む処理培地で培養し、少なくとも24時間細胞を飢餓状態にします。飢餓状態にした後、テキストプロトコルに詳述されている通り、目的のホルモンを添加し、3日間、24時間ごとに処理培地を交換します。次に、処理した細胞を冷PBSで2回洗浄します。氷上で200 µLの溶解バッファーを用いて細胞を溶解させます。セルスクレイパーを用いて細胞溶解物を回収し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。回収した溶解液を氷上で20分間インキュベートし、5分ごとにボルテックスします。その後、細胞抽出液を125 Wで10秒間、3回超音波処理し、各処理の間には2秒間の休止時間を設けます。595 nmでタンパク質定量試薬を用いて、タンパク質濃度を測定します。50 µgのタンパク質を溶解バッファーと混合し、最大合計容量を50 µLにします。次に、4x Laemmliサンプルバッファーを16 µL加えます。その後、サンプルを75 °Cで5分間加熱します。10%SDS-PAGEゲルでサンプルを分離し、PVDFメンブレンに転写して、特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析を行います。本研究では、エタノールベースの抽出法を用いて、ブラックベリーの粗抽出物および精製ポリフェノール抽出物に含まれるフェノール酸とフラボノイドの各レベルを同定しています。精製過程により没食子酸またはp-クマル酸のレベルに大きな変化は見られませんでしたが、3-O-カフェオイルキナ酸のレベルは170.5 ppmから235.3 ppmに、ケルセチンのレベルは24.5 ppmから95 ppmに上昇しました。対照的に、粗抽出物の精製過程でフェルラ酸とルチンは消失した。抽出後、VSMCを0.5%胎児牛血清を含む培地中で、50から500 µg/mLの粗抽出物または精製ブラックベリー抽出物のいずれかに3日間インキュベートした。その結果、どちらの抽出物もERKの基底レベルのリン酸化を抑制する効果があることが示された。しかし、精製抽出物は100 µg/mLで強力なダウンレギュレーションを示すのに対し、粗抽出物では400から500 µg/mLが必要であることがわかります。これは、精製抽出物がERKリン酸化を抑制する効率が高い理由が、ポリフェノール化合物の濃度が高いためであることを示唆しています。その後、VSMCを200 µg/mLの精製ブラックベリー抽出物で24時間処理し、100 nMのアンジオテンシンIIを添加します。既報の通り、ブラックベリーポリフェノール抽出物はアンジオテンシンII誘発性のERKリン酸化を減少させますが、カタラーゼやSOD2の発現には影響を及ぼしません。ポリフェノールの抽出法を習得すれば、数時間で準備することが可能です。この手法は、機能性食品分野の研究者が、in vitroおよび動物モデルにおいてポリフェノールの役割を探索する際に役立ちます。このビデオを視聴することで、果物や野菜からポリフェノールを抽出・精製し、その抽出物を用いて培養細胞を処理できるようになります。我々は本手法を用いて、大動脈血管平滑筋細胞の老化防止におけるブラックベリーポリフェノールの役割を実証しました。血管系の老化が心血管疾患の発症における主要なリスク要因であることを考慮すると、これは重要な知見です。

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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