ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの腎上皮細胞に標的的なアブレーションを誘導し、ネフロンの損傷と修復をモデル化することです。この手法は、臓器、特に腎臓の再生分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、再生に関与する主要な細胞プロセスは何か、生存組織の可塑性はどの程度か、といった点などが挙げられます。

この手法の主な利点は、損傷の空間的・時間的な精密な制御が可能であるとともに、損傷のレベルを調整できる点にあります。この手法は、腎細胞の損傷と再生に関与する細胞および分子プロセスの精密な空間的・時間的評価を可能にするため、急性腎障害の治療や診断への応用が期待されます。まず、腎臓GFP蛍光ゼブラフィッシュを交配させて胚を生成します。

受精後24時間は、胚を28.5 degree celsiusのE3溶液で保持します。その後、E3培地を0.003%PTU含有E3溶液に交換します。胚をインキュベーターに戻して6日以上育成させると、腎臓が成熟します。

ゼブラフィッシュをライブイメージング用に固定するため、0.2 mg/mLのトリゲイン溶液を含む1%から2%の低融点アガロースを調製します。プラスチック製またはガラス製のピペットを用いて胚を溶液に移動させる前に、アガロース・トリゲイン溶液が冷却されていることを確認してください。次に、転送ピペットを使用してアガロース中の幼魚を吸い上げ、35 mmディッシュの中央に配置します。

ゼブラフィッシュを含むアガロースを素早く広げ、ディッシュの底面を均一に覆います。次に、ガラスプローブを用いて、光アブレーションおよびイメージング用に幼魚の向きを調整し、目的の腎臓セグメントがビーム経路に対して垂直になり、反対側のセグメントがレーザービームから離れるようにします。ゼブラフィッシュの向きは、その後のレーザーアブレーション工程において極めて重要です。

幼虫がアガロース内で垂直な姿勢を維持するように調整することが推奨されます。蒸発を最小限に抑えるためにペトリ皿に蓋をし、アガロースを約15分間凝固させます。テキストプロトコルに従って共焦点顕微鏡を正立構成でセットアップした後、幼虫が入ったペトリ皿を顕微鏡スライドの上に配置し、モデリングクレイを用いて固定します。

次に、スライド式ペトリ皿を顕微鏡ステージ上に配置します。その後、イメージング溶液を3 mL加えます。水浸レンズの下でステージをゆっくりと上げ、光路に気泡が入らないよう、レンズをわずかに傾けてください。

レンズを斜めに溶液に接触させた後、胚のある視野の中心に合わせます。次に、蛍光光源を用いて目的のセグメントを探し、損傷させる対象となる表在枝に焦点を合わせます。光散乱を最小限に抑えるため、表在枝を選択します。

顕微鏡ソフトウェアで、[View]、[Acquisition Control]、[C2plus compact GUI]の順に選択します。ピクセル滞在時間を1.9 microsecondsに、フレームサイズを512 by 512 pixelsに、ピンホール径を90 micronsに設定します。405 nanometerレーザーの強度を0に、488レーザーの強度を低い値に設定します。

488 nmレーザーを使用し、ソフトウェアインターフェースのscanをクリックします。ビーム光路に対して垂直で、GFP蛍光が十分に視認できる目的のセグメントを探します。その領域が特定されたら、ROIからdraw elliptic ROIを選択し、関心領域を描画します。

次に、「view（表示）」、「acquisition controls（収集コントロール）」、「C2plus scan area（C2plusスキャンエリア）」へと進み、「band scan area（バンドスキャンエリア）」を選択すると、そのインターフェース内に矩形マスクが表示されます。カーソルを使用して、レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーするように、矩形スキャンエリアを手動で定義してください。マスクエリア内で右クリックし、選択を確定させます。

488 nmレーザーのみを使用してGFPを活性化させ、グリーンチャンネルをモニタリングしながら時間計測を開始します。488 nmレーザーの強度は比較的低く設定してください。「measure」から「time measurement」を選択し、関心領域におけるGFPの平均強度を測定します。

グラフまたはデータタブを使用して、ROI内の平均強度レベルをモニタリングします。バイオレットレーザーを用い、レーザー出力コントロールを右端までスライドさせて強度を100%に上げることで、腎細胞に損傷を誘発させます。グラフタブで折れ線グラフを確認するか、データタブでGFP強度の数値を観察し、目的のレベルまで低下するまで待ちます。

例えば、ベースラインの50%とします。楕円形のROI内のGFP強度が必要なレベルまで低下したら、ソフトウェアのコントロールパネルにあるレーザーパワーのスライダーを一番左まで動かし、バイオレットレーザーの強度を直ちにゼロに下げます。最後に、GFP蛍光の新しいベースラインを取得します。

この図に示すように、405ナノメートルのレーザー光に曝露した後、GFP蛍光は1細胞ずつ消失し続けます。220分までには、切除セグメント全体がGFP陽性を100%失います。これは、GFP陽性を失った細胞に赤色蛍光プロピジウムヨード陽性の核が出現していることからわかるように、GFP発現のダウンレギュレーションではなく、細胞死によるものです。

これらの画像は、初期露光量を変化させることで、損傷の程度および損傷した上皮の反応を調整できることを示しています。初期のGFP光退色を10%から20%とした場合、損傷から5時間後においてGFP陽性率の低下はほとんど観察されません。50%および60%では、5時間後にGFPが完全に消失しますが、30%および40%の退色では中間的な結果となり、約35%の光退色で推定死滅率50%が観察されました。

これはプロピジウムヨード染色によって支持されており、20%の光退色では、アブレーション後100分においてプロピジウムヨード染色はほとんど認められません。しかし、50%の光退色では、60分後以降、アブレーションされた上皮においてプロピジウムヨード陽性反応が持続します。一方、30%および40%の光退色では、中程度のプロピジウムヨード取り込みが認められます。

この手法を習得し適切に実施すれば、30分で完了させることができます。レーザーや化学試薬の取り扱いは非常に危険であるため、レーザービームを直接見ないことや、化学薬品を扱う際に手袋を着用することなどの予防策を、本手順の実施中に常に講じることを忘れないでください。本手順の後、タイムラプス顕微鏡観察や免疫蛍光染色などの他の手法を組み合わせることで、細胞および分子レベルでの腎障害と修復の解析を目的としたさらなる疑問に答えることが可能です。

この手法の開発により、腎臓再生分野の研究に道が開かれました。本手法を用いて、ゼブラフィッシュにおける集団的な細胞移動と損傷後の腎臓修復の役割を探索します。このビデオを視聴することで、共焦点顕微鏡を用いてGPFトランスジェニック・ゼブラフィッシュの幼魚および胚の特定の腎セグメントに損傷を与える方法について、十分な理解を得ることができます。