ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法
2017年6月3日
この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。
この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの腎臓上皮細胞の標的アブレーションを誘導して、ネフロンの損傷と修復をモデル化することです。この方法は、臓器、特に腎臓再生分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、再生に関与する主要な細胞プロセスは何か、生き残った組織の可塑性の程度など、さまざまなものがあります。
この技術の主な利点は、傷害の正確な空間的時間的制御を可能にするだけでなく、傷害のレベルを調整する能力を可能にすることです。この技術の意味は、腎細胞の損傷と再生に関与する細胞および分子プロセスの正確な空間的および時間的評価を可能にするため、急性腎障害の治療または診断にまで及びます。まず、腎臓GFP蛍光ゼブラフィッシュを交配して胚を生成します。
受精後24時間は、胚をE3溶液中28.5°Cに保ちます。次に、E3 で 0.003%PTU を使用して、E3 メディアを交換します。胚をインキュベーターに6日以上戻すと、その時点で腎臓は成熟しているでしょう。
ゼブラフィッシュをライブイメージング用にマッピングするには、11ミリグラム/ミリリットルのトリゲイン溶液で1%から2%の低融点アガロースを調製します。プラスチックまたはガラスのピペットを使用して胚を溶液に移す前に、アガローストリゲイン溶液が冷えていることを確認してください。次に、トランスファーピペットを使用して、幼虫をアガロースに引き上げ、35ミリメートルの皿の中央に置きます。
ゼブラフィッシュが入ったアガロースをすばやく広げて、皿の底を均等に覆います。次に、ガラスプローブを使用して、光アブレーションとイメージングのために幼虫の向きを調整し、目的の腎臓セグメントがビーム経路に対して垂直になり、反対側のセグメントがレーザービームから離れるようにします。ゼブラフィッシュの向きは、レーザーアブレーションを含む進行ステップにとって重要です。
良いテクニックは、幼虫がアガロース内で垂直な位置を維持するようにすることをお勧めします。ペトリ皿を覆って蒸発を最小限に抑え、アガロースを約15分間固化させます。共焦点顕微鏡をセットアップした後、テキストプロトコルに従って、直立した状態で、幼虫が入ったペトリ皿を顕微鏡スライドの上に置き、モデリング粘土を使用して所定の位置に保持します。
次に、スライド式のペトリ皿を顕微鏡ステージに置きます。次に、3ミリリットルのイメージング溶液を追加します。水浸レンズの下で、ステージをゆっくりと持ち上げ、レンズがわずかに傾いていることを確認して、空気がビーム経路に閉じ込められるのを防ぎます。
レンズが溶液に斜めに触れたら、胚の視野に入るようにレンズを中央に配置します。次に、蛍光光源を使用して、目的のセグメントを見つけ、次に、表在枝に焦点を合わせて損傷を狙います。光の散乱を最小限に抑えるために選択された表在枝。
顕微鏡ソフトウェアで、ビュー、取得制御、C2plusコンパクトGUIに移動します。ピクセル滞留時間を 1.9 マイクロ秒に、フレーム サイズを 512 x 512 ピクセルに、ピンホール サイズを 90 ミクロンに設定します。405ナノメートルのレーザー強度をゼロに、488のレーザー強度を低い値に設定します。
488ナノメートルレーザーを使用しているときに、ソフトウェアインターフェースでスキャンをクリックします。ビームパスに垂直で、良好なGFP蛍光でよく可視化されている対象セグメントを見つけます。その領域が特定されたら、ROIに移動し、楕円ROIを描画して、関心領域を描画します。
次に、ビュー、アクイジションコントロール、C2plusスキャンエリアに移動し、バンドスキャンエリアを選択すると、そのインターフェース内に長方形のマスクが表示されます。カーソルを使用して、レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーする長方形のスキャンを手動で定義します。マスク領域内を右クリックして、選択を受け入れます。
488ナノメートルのレーザーだけでGFPを活性化し、グリーンチャネルを監視しながら時間測定を開始します。488レーザーの強度が比較的低いことを確認してください。関心領域のGFPの平均強度を測定するには、測定、時間測定を選択します。
グラフまたはデータタブを使用して、ROI内の平均強度レベルを監視します。バイオレットレーザーを使用して、レーザー出力制御を右端までスライドさせることにより、強度を100%に増やして腎臓細胞に損傷を与えます。グラフタブでは、折れ線グラフを観察するか、データタブを使用してGFP強度の数値を観察し、目的のレベルまで下がるまで待ちます。
たとえば、ベースラインの 50% です。楕円ROI内のGFP強度が目的のレベルまで下がったら、ソフトウェアコントロールパネルでレーザーパワースライダーを左端まで動かして、バイオレットレーザーの強度をすぐにゼロに下げます。最後に、GFP蛍光の新しいベースラインを取得します。
この図に示すように、405ナノメートルのレーザー光を照射した後、GFP蛍光は一度に1つの細胞で消え続けます。220分になるまで、アブレートセグメント全体がGFP陽性率の100%を失います。これは細胞死によるものであり、GFP陽性を失った細胞に赤色蛍光ヨウ化プロピジウム陽性核が出現することに見られるように、GFP発現のダウンレギュレーションによるものではありません。
これらの画像は、初期露光を変化させることにより、損傷と損傷した上皮に対する反応をダイヤルすることが可能であることを示しています。最初のGFP光漂白では、損傷後5時間でGFP陽性の減少はほとんど観察されません。50%と60%は5時間でGFPが完全に消失し、30%と40%の漂白は中間の結果をもたらし、約35%の光漂白で50%の推定死亡が観察されます。
これは、20%の光漂白により、アブレーション後100分でヨウ化プロピジウムが実質的に染色されないヨウ化プロピジウム染色によって裏付けられています。ただし、50% の光漂白により、60 分後にアブレーションされた上皮にヨウ化プロピジウム陽性が持続します。30%と40%の光漂白は中間のヨウ化プロピジウムの取り込みにつながります。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば30分で完了します。レーザーや化学試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、レーザービームを見ないようにしたり、化学薬品を取り扱うときは手袋を使用したりするなどの事前注意を怠らないことを忘れないでください。この手順に続いて、タイムラプス顕微鏡法、免疫蛍光染色などの他の方法を実行して、腎臓の損傷と細胞および分子レベルでの修復の解剖を目的とした追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は腎臓再生の分野の研究者に道を開きました。ゼブラフィッシュの損傷後の集団細胞移動と腎臓修復の役割を調査すること。このビデオを見れば、GPFトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生や胚の特定の腎臓セグメントを損傷するために共焦点顕微鏡を使用する方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この研究では、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた腎臓の部分的損傷の新しいin vivoモデルを紹介しています。このモデルは、腎臓上皮細胞の標的消去を容易にし、ネフロン損傷と修復に関与する細胞メカニズムの探索を可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 腎臓学
- 再生医療
- モデル生物
背景
- 腎臓損傷は重大な健康課題をもたらします。
- ネフロン損傷と修復メカニズムの理解は治療の進歩にとって重要です。
- ゼブラフィッシュは再生能力により価値あるモデルです。
- GFPトランスジェニックゼブラフィッシュは腎臓細胞ダイナミクスの可視化を可能にします。
研究目的
- 腎臓上皮細胞の標的消去を通じたネフロン損傷と修復のモデル化。
- 腎臓再生に関与する主要な細胞プロセスの調査。
- 生存腎臓組織の可塑性の評価。
使用された方法
- 腎臓GFP蛍光ゼブラフィッシュ胚の生成。
- 腎臓上皮細胞の標的消去の誘導。
- 損傷レベルの空間的および時間的制御。
- 損傷と修復中の細胞および分子プロセスの評価。
主要な結果
- ゼブラフィッシュモデルにおけるネフロン損傷の成功的な誘導。
- 腎臓再生に関与する主要な細胞メカニズムの同定。
- モデルの損傷レベル調整能力のデモンストレーション。
- 損傷後の腎臓組織の可塑性に関する洞察。
結論
- ゼブラフィッシュモデルは腎臓損傷と修復の研究に強力なツールを提供します。
- 結果は急性腎臓損傷の治療戦略に情報を提供する可能性があります。
- さらなる研究により腎臓再生プロセスの理解が拡大される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise cellular ablation in zebrafish enables controlled modeling of acute kidney injury (AKI), addressing a critical need for mechanistic de-risking in renal target validation. This approach provides spatiotemporal control over nephron injury, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's reproducibility and quantitative outputs position it as a robust platform for pipeline advancement and cross-functional R&D integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nephron injury and repair mechanisms at single-segment resolution.
- Supports biological de-risking by allowing precise modulation of injury severity and location.
- Facilitates functional target validation through direct observation of regenerative responses.
- Improves predictive confidence for renal therapeutic hypotheses and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, injury-responsive zebrafish models for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible injury induction with quantifiable readouts.
- Enables scalable assay development by adjusting injury levels and monitoring cellular outcomes.
- Supports reliable evaluation of candidate interventions in a live vertebrate system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant AKI models for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of renal repair mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo regenerative capacity.
- Offers mechanistic de-risking for renal targets prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven injury modeling, quantitative readouts, and downstream analytical workflows in zebrafish.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nephron cell death and repair with precise injury induction.
- Screening: Provides reproducible, quantifiable injury models for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence and cell death measurements for condition comparison.
- Translational Research: Connects zebrafish injury models to mammalian AKI relevance and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for renal injury and regeneration research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of injury modeling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of renal therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and zebrafish handling.
- Needs access to laser ablation instrumentation and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of injury induction and readout protocols.
- Adaptation may be needed for different nephron segments or developmental stages.
- Practical limitations include laser safety and the need for precise embryo orientation.
