Name: ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶレーザー光アブレーションを用いたゼブラフィッシュ腎臓上皮細胞の標的除去法。空間・時間的制御が可能なこの技術は、急性腎障害のモデリングと再生メカニズムの研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

腎臓のGFPトランスジェニック系統を共有してくださったIain Drummond博士とVladimir Korzh博士に感謝したいと思います。 NYITCOMにもこの作業を行うために必要なリソースを提供していただき、ありがとうございます。この研究の一部は、K08DK082782、R03DK097443（NIH）、およびHSCIパイロットグラント（AV）の助成金によって一部サポートされました。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、NYITCOMのOsteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（NYITCOM IACUC）によって承認されました。全ての手術および生体内実験は、トリカイン麻酔下で実施され、苦痛を最小限に抑えるためにすべての努力がなされた。 1.胚の入手と維持<ol><li>腎臓のGFP蛍光ゼブラフィッシュを横切って胚を得る。 注：蛍光標識ゼブラフィッシュトランスジェニック系の例を表1に示す 。 </li><li>受精後24時間にE3溶液に28.5℃で胚を保つ。 </li><li> 24時間後、培地を0.003％1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含有するE3溶液と交換する。 注：メラニン形成におけるチロシナーゼ依存性のステップをブロックするため、PTUを使用する色素沈着を防止する。ここでは、この解決策をE3-PTUと呼ぶ。 </li><li>受精した胚を28.5°Cで6 dpf以上になるまで上げます。その時点で腎臓は成熟しています。 注：7-9 dpfウィンドウでは幼虫を使用することをお勧めします。 </li><li> 40倍の倍率および緑色蛍光発光フィルターで蛍光解剖顕微鏡を使用して、明るい腎臓GFP蛍光を有する幼虫を選択する。 </li></ol> 2.ライブイメージングのためのZebrafishのマウント<ol><li> 3 dpfの前に胚を光化する場合、画像化のためにゼブラフィッシュをマウントする前に、孵化していないゼブラフィッシュから絨毛膜を除去する。 <ol><li>手動で鉗子で脱着（推奨）するか、プロテアーゼ混合物で化学的処理をしてください。 注記：デコレーションにより、最良のイメージング結果が得られます。 </li></ol></li><li> E3-PTU溶液を用いてペトリ皿中の絨毛の破片を洗い流し、E3-PTUで皿を補充する。 </li><li> プレパ0.2 mg / mLのトリカイン溶液を含む1-2％低融点（LMP）アガロースでゼブラフィッシュを腎臓光切除およびライブイメージングにマウントします。 <ol><li>予めLMPアガロースが調製されている場合は、マイクロ波で再加熱して溶解します。 </li></ol></li><li> LMPアガロースが調製されたら、解剖顕微鏡上に35mmのプラスチックシャーレを置く。麻酔した幼虫を適切に方向付けるために、引っ張ったガラスプローブを近くに置く。 注：アガロースが約1〜3分で凝固する前に胚を配向させなければならないので、適時にこのステップを行い、すべてを整えることが重要です。 </li><li>胚をアガロースに移す前に、アガロースが冷えていることを確認してください（体温付近）。プラスチックまたはガラス転移ピペットを使用して、冷却した溶かしたアガロース - トリカイン溶液に胚を入れる。 注：これは、あまりにも高温のアガロースが胚に有害であり、心停止を引き起こす可能性があるために行われますまたは死</li><li>トランスファーピペットを使用して、アガロース溶液中の胚を再描画し、胚/幼虫を35mmディッシュの中央に配置する。 </li><li>胚/幼虫を含むアガロースを迅速に広げ、35mmの皿の底を均一に覆う。使用するアガロースの最善の量は~1.1mLである。 </li><li> ガラスプローブを使用して、胚を光切除および画像化のための最良の位置に向ける。 注：映画1は、片側光切除のための胚/幼虫の最良の向きを示す。このステップは、最も時間に敏感であり、ゲル化開始後に魚を再指向させる試みは有害であるため、アガロースがゲル化し始める前に迅速に実施されるべきである。 <ol><li>関心のある腎臓セグメントが、対側の部分がレーザービームから離れている間に、ビーム経路に対して垂直になるように幼虫を向ける（ 映画1参照）。 注：これはムービー1のように幼虫を回すことで実現できます。 </li&gt; </ol></li><li>アガロースが凝固するのに約15分を要する。ペトリ皿を覆って蒸発を最小限に抑えます。アガロースが凝固すると、胚または幼虫は光切除の準備が整う。 </li></ol>レーザーアブレーション<ol><li>共焦点イメージングシステムを操作する。 注記：参照画像プラットフォーム（材料の表を参照）を使用する場合、40倍の倍率、0.8 NA水浸レンズ、およびサンプルの488および405 nm照明の両方を可能にする第1のダイクロイックミラーセットが推奨設定に含まれます。検出はグリーンチャネルで実行する必要があります。 </li><li>固定化ゼブラフィッシュを含むディッシュを共焦点ステージ上に置く。 注：この手順は、40〜60倍の水浸レンズを使用した直立構成に最適です。しかしながら、倒立顕微鏡の手順を変更することは可能であるべきである。 </li><li>直立構成では、胚を含むペトリ皿を顕微鏡の上に配置するモデリングクレイ（ 例えば、プラシーネ）を使用して、その場所にスライドさせて保持してください。ペトリ皿でガラススライドを共焦点顕微鏡のステージ上に置く。 </li><li> 0.2mg / mLのトリカインを用いて3mLのイメージング溶液E3-PTU（工程1.3参照）を加える。 注：スライドをステージ上に置く直前にイメージングソリューションを追加することもできます。イメージング溶液の添加は、アガロースが皿の底から浮かぶのを防ぐために非常に慎重に行わなければならない。 </li><li>水浸レンズ（40または60X）に切り替えます。ゆっくりとステージを上げ、空気がビーム経路に閉じ込められないようにレンズがわずかに傾いていることを確認します。レンズがある角度で溶液に触れたら、それが胚の視野に入るように中心に置く。 </li><li>蛍光光源を使用して目的のセグメントを見つけます。光散乱を最小限に抑えるために、怪我の対象となる支店を表面的に配置します（ 映画1を参照）。 注：サブシーケンサーtステップでは参照ソフトウェア（表の表を参照）を使用しますが、この手順は他のプラットフォームにも容易に適用できます。 </li><li>ソフトウェアを開きます。 「表示」| &quot;獲得コントロール&quot; | 「C2plus Compact GUI」に設定し、「ピクセル滞留時間」を「1.9μs」、「フレームサイズ」を「512x512ピクセル」、「ピンホールサイズ」を「90μm」に設定します。 「405nm（またはいくつかのシステムでは408nm）レーザー強度」をゼロに、「488レーザー強度」を「低」（好ましくは1％未満）に設定します。良好なダイナミックレンジを得るために「ゲイン」を調整しますが、信号を飽和させないように調整してください。 注：これらの値は重要ではなく、一貫性のために使用されます。 405 nmレーザーを使用すると、GFP蛍光が増加します。光退色（ステップ3.11）中の信号の飽和を避けるために、信号利得値は緑チャネル上で縮小されるべきである。青色チャネル利得は、saには使用されないので、ゼロのままにすることができますmpling。 </li><li> 488 nmレーザーを使用して腎臓をスキャンするには、ソフトウェアインターフェイスで[スキャン]をクリックします。ビーム経路に垂直で、良好なGFP蛍光を伴ってよく視覚化されている関心のあるセグメントを見つけます。その領域が特定されたら、楕円形のRegion-of-Interest（ROI）を使用して関心領域を描画します。 <ol><li> &quot;ROI&quot;に移動| 「楕円ROIを描く」 注：これは、光退色が起こっている間に平均GFP強度を連続的に測定するために使用され、正確な線量のレーザー治療の投与を可能にする。 </li></ol></li><li> 「表示」| &quot;獲得コントロール&quot; | &quot;C2plus Scan Area&quot;を選択し、 &quot;Band Scan Area&quot;を選択します。長方形のマスクがそのインターフェイス内に表示されます。レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーするために、カーソルを使用して長方形のスキャンウィンドウを手動で定義します（ つまり 、マスクのドラッグ、サイズ変更、回転）。右クリックしてマスク領域を使用して選択を受け入れます。 注記：選択したリージョンのみがスキャンされます。 </li><li>緑色チャンネルを監視しながら、488 nmレーザーを使用してGFPを起動しながら時間測定を開始します。 488レーザーの強度が比較的低い（〜1％）ことを確認します。 &quot;Measure&quot;を選択することにより、関心領域内のGFPの平均強度を測定する。 「時間測定」 [グラフ]タブまたは[データ]タブを使用して、ROI内の平均強度値を監視します。 注：取得速度は、ピクセルドウェル時間とステップ3.9で設定された長方形ウィンドウのサイズによって定義されますが、一般的に、信号の高速監視（約2〜10フレーム/秒）が可能です。 </li><li> 「レーザーパワー」コントロールを右端にずらして強度を100％に増やし、バイオレットレーザー（405nm）で腎臓細胞を損傷させます。強度が低い場合、488 nmレーザーはアクティブのままです。 <ol><li>線gを観察する「グラフ」タブを使用するか、「データ」タブを使用してGFP強度の数値を使用し、所望のレベル、例えばベースラインの50％（ 図1に示す ）まで低下するのを待ちます。 注記：20mWレーザーは、参照レーザーユニットの一部として使用されています（材料表を参照 ）。最大強度はシステムによって異なることがある。より低い強度は、より長時間の暴露（ すなわち 、総暴露の尺度としてのパーセントGFP漂白を用いる）によって補うことができる。 </li></ol></li><li> 楕円ROI内のGFP強度（ステップ3.8）が所望のレベルに低下したら、「レーザー出力」スライダを左にずっと移動させることによって、紫色（405nm）レーザの強度を直ちに「0」に減少させるソフトウェアコントロールパネル。 <ol><li> GFP蛍光の新しいベースラインを得る。 X / Yの比を求めることによってアブレーションを確認する。 注： 図を参照してください図1Bに示す。 Y =アブレーション前の平均強度、X =アブレーション後の平均強度、ROI内の4つの連続サンプルの平均を用いる。正確な標的比率（50％、60％ など ）は、所与の実験に望まれる損傷の量に依存する。 </li></ol></li></ol> 4.ヨウ化プロピジウム染色による経時顕微鏡検査<ol><li>光分解後の腎細胞傷害の相関として、ヨウ化プロピジウム染色を視覚化するための一般的な時間経過の検討（前の研究15で概説）を適用する。 </li><li>ステップ2および3.7にそれぞれ記載されているように、埋め込みおよび光切除の前に、30μMヨウ化プロピジウム溶液（E3-PTU中の1％DMSO）中の幼虫を3時間プレインキュベートする。 注：ヨウ化プロピジウムは、アガロースまたはイメージング溶液には必要ありません。 </li><li>段階3.1~3.12に記載されているように、部分腎障害を誘発する。 </li><li>時間経過イメージスタックを取得する488 nmレーザー（GFP）および461 nmレーザー（Propidium Iodide、PI）を使用して、前の研究14のベッドを使用した。 注：GFPの消失とヨウ化プロピジウム染色の出現を相関させるために、2色を共焦点スタックに重ねる。 </li><li>仮想スライス厚さ=4μm、z-スタック間隔=2μm、画素滞留時間=1.9μs、画像寸法= 512x512、および平均= 2のように、タイムラプス画像スタックを得るためのパラメータを設定する。 注：これらのパラメータは、最大4匹の幼虫の連続的な10〜15分の間隔記録を可能にし、試料の光退色が最小限であることを保証する。 </li><li>記録ファイル形式と互換性のあるイメージングソフトウェアを使用して、データを視覚化して分析します。 </li></ol>

<ol><li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kidney+Injury%2C+Mortality%2C+Length+of+Stay%2C+And+Costs+In+Hospitalized+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Apher+Dial%22%5BJournal%5D)">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li>
<li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li>
<li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19041789">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li>
<li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744(2002).</li>
<li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742480/">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li>
<li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish%3A+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21111220">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li>
<li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li>
<li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen%2C+Vimentin%2C+C-Fos%2C+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments%2C+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li>
<li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304(2014).</li>
<li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li>
<li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development%3A+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li>
<li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20810610">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li>
<li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li>
<li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).</li>
<li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+%28ZETRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5(2006).</li>
<li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を得ることは、はるかに困難である。このプロトコルを変更し、異なるアプリケーションに適応させる場合、光分解に対する組織反応性のこれらの差異を考慮する必要があります。したがって、傷害の量および傷害された腎臓上皮の予測される応答を適切に測定するために、GFP蛍光の減少パーセントをモニターすることが重要である。 この方法の主な利点は、腎障害の他の方法とゼブラフィッシュはそれが損傷の時空間的位置の正確な制御を可能にするものである。また、研究者は怪我のレベルを上下させることができます。傷害の量を制御するこの能力は、上皮細胞の応答の検査を可能にするべきであり、回復対アポトーシス対壊死の意思決定を助けるべきである。例えば、細胞移動は、部分的切除に...

急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） 1,2 は、腎機能の突然の障害として広く定義されている3 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いままである 1,2 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である6 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。 傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚9に対して致命的であることを見出した。それは、胚の回復にはあまりにも深刻な管状の損傷を引き起こし、何らかのタイプの介入なしに再生の研究を困難にする。マウスやラットのような哺乳類のモデルも貴重だと考えられていますが、AKIの研究では多くの制限があります。おそらく、げっ歯類モデルの主な欠点は、視覚障害げっ歯類の腎臓を結紮し、上皮の死および修復に至る正確な時空間的過程を決定する。 Johnson ら胚および幼生のゼブラフィッシュにおいて急性腎障害を誘発するためのレーザーアブレーションベースの技術を報告している9 。彼らは、デキストラン結合体を筋肉内注射した後、腎臓に損傷を与えるためにパルスレーザーアブレーションを使用した。デキストラン結合体からの蛍光は、細管上皮9の損傷および再生の可視化を可能にする。このモデルは、上記の2つの制限を克服するが、傷害の段階的なレベルを許容せず、大きな、任意の細胞群で実施することは困難である。 ここに記載されているAKIの新しいレーザーアブレーションベースのゼブラフィッシュモデルは、上記のすべての制限に対応しています。幼虫ゼブラフィッシュの前腎臓腎臓は成熟した機能的器官であり、哺乳類のne糸球体、近位および遠位尿細管、および収集ダクト10を含む 。ゼブラフィッシュの幼虫もまた光学的に透明であり、蛍光技術によって腎臓を観察することが可能になる。したがって、ゼブラフィッシュは、AKIの貴重なインビボモデルであり、幼生期腎臓（受精後5〜12日）は、腎臓傷害および修復に関与する細胞および分子プロセスを研究するために使用することができる。 この論文では、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するネフロンセグメントを、低エネルギー（パルスレーザシステムと比較して）紫色レーザ光（405nm）を用いて光結合させる方法を提示する。 GFP蛍光は、細胞のグループの標的化を可能にし、GFP光退色の観察によって可視化される変化を生じさせる。さらに、GFP（紫色光を吸収することによって）は、GFP発現腎細胞における損傷を増強するエネルギーシンクとして働く。時差マイクロコピーを使用して修復処理を調べることができます。研究により、細胞増殖、細胞移動、および細胞化生11,12,13がすべて腎臓修復において重要な役割を果たす可能性のあるプロセスであることが判明している。しかし、これらのプロセスの相対的重要性とその相互作用の詳細は、AKIの既存モデルの限界のために明らかにすることは困難でした。この新規アプローチを用いて、急性損傷後の腎臓修復において細胞移動が中心的役割を果たすことを示すことが可能であった14 。

<table><tbody><tr><td>ペトリ皿、35 x 10 mm</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-103</td><td>手続き型 使用法 ステップ2.4、2.7</td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 x 15 mm</td><td>ミッドウェスト・サイエンティフィック</td><td>910</td><td>手続き型 使用法 ステップ1</td></tr><tr><td>デコレーション鉗子 - 電子顕微鏡科学 デュモン・ピンセット 5 デュモスター</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>50-241-57</td><td>手続き型 使用法 ステップ2.1.1</td></tr><tr><td>プラスチック転写ピペット</td><td>グローブScientific</td><td>135030</td><td>手続き型 使用法: ステップ 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>手続き型 使用法: ステップ 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP165-25</td><td>手続き型 使用法: ステップ 2.3</td></tr><tr><td>プルド ガラス プローブ (ガラス キャピラリー チューブから手動で製造)</td> <td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>21-1640-2C</td><td>手続き型 使用法: ステップ 2.4</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ1270</td><td>手続き 使用法: ステップ 1.5</td></tr><tr><td>SOLA ライトエンジン</td><td>ルーメンコール</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>手続き 使用法: ステップ 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus 共焦点顕微鏡システム</td><td>ニコン</td><td></td><td>手続き 使用法: ステップ 3</td></tr><tr><td>1x E3 ソリューション</td><td></td><td></td><td>生成に使用したレシピ: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 手続き型ステップ 使用法: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>手続き型ステップ 使用法: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>手続き型 使用法: ステップ3</td></tr><tr><td>レーザーユニット</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>手続き型ステップ 3.11</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化物(PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>手続きステップ使用法:4.2</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。

このプロトコルはET（krt8：EGFP）sqet11-9、ET（krt8：EGFP）sqet33-d10、およびTg（atp1a1a.4：GFP）を含む多くの腎臓GFPトランスジェニック系統でうまく使用されたことに注意してください。ここに示されている例の結果は、ET（krt8：EGFP）sqet11-9系統を用いて得られた。 図1は、光切断プロトコルの例を示す。平均GFP強度は、関心領域内でモニターされる（ 図1Aおよび映画1 ）。例示的な平均強度トレースを図1Bに示す 。 ...

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの腎上皮細胞に標的的なアブレーションを誘導し、ネフロンの損傷と修復をモデル化することです。この手法は、臓器、特に腎臓の再生分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、再生に関与する主要な細胞プロセスは何か、生存組織の可塑性はどの程度か、といった点などが挙げられます。この手法の主な利点は、損傷の空間的・時間的な精密な制御が可能であるとともに、損傷のレベルを調整できる点にあります。この手法は、腎細胞の損傷と再生に関与する細胞および分子プロセスの精密な空間的・時間的評価を可能にするため、急性腎障害の治療や診断への応用が期待されます。まず、腎臓GFP蛍光ゼブラフィッシュを交配させて胚を生成します。受精後24時間は、胚を28.5 degree celsiusのE3溶液で保持します。その後、E3培地を0.003%PTU含有E3溶液に交換します。胚をインキュベーターに戻して6日以上育成させると、腎臓が成熟します。ゼブラフィッシュをライブイメージング用に固定するため、0.2 mg/mLのトリゲイン溶液を含む1%から2%の低融点アガロースを調製します。プラスチック製またはガラス製のピペットを用いて胚を溶液に移動させる前に、アガロース・トリゲイン溶液が冷却されていることを確認してください。次に、転送ピペットを使用してアガロース中の幼魚を吸い上げ、35 mmディッシュの中央に配置します。ゼブラフィッシュを含むアガロースを素早く広げ、ディッシュの底面を均一に覆います。次に、ガラスプローブを用いて、光アブレーションおよびイメージング用に幼魚の向きを調整し、目的の腎臓セグメントがビーム経路に対して垂直になり、反対側のセグメントがレーザービームから離れるようにします。ゼブラフィッシュの向きは、その後のレーザーアブレーション工程において極めて重要です。幼虫がアガロース内で垂直な姿勢を維持するように調整することが推奨されます。蒸発を最小限に抑えるためにペトリ皿に蓋をし、アガロースを約15分間凝固させます。テキストプロトコルに従って共焦点顕微鏡を正立構成でセットアップした後、幼虫が入ったペトリ皿を顕微鏡スライドの上に配置し、モデリングクレイを用いて固定します。次に、スライド式ペトリ皿を顕微鏡ステージ上に配置します。その後、イメージング溶液を3 mL加えます。水浸レンズの下でステージをゆっくりと上げ、光路に気泡が入らないよう、レンズをわずかに傾けてください。レンズを斜めに溶液に接触させた後、胚のある視野の中心に合わせます。次に、蛍光光源を用いて目的のセグメントを探し、損傷させる対象となる表在枝に焦点を合わせます。光散乱を最小限に抑えるため、表在枝を選択します。顕微鏡ソフトウェアで、[View]、[Acquisition Control]、[C2p

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。...

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

細胞移植は、組織の再生を研究するための、病気の細胞ベースの治療法を開発するために必要不可欠な技術です。ここでは、成人のゼブラフィッシュの魚の腎臓に直接遺伝的に標識された細胞の移植を可能に顕微鏡下手術を示しています。...

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。...

腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。...

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a...

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

この記事は、ゼブラフィッシュの胚に機械的な血管損傷を作成する方法について説明しています。この損傷モデルは、リアルタイム顕微鏡検査に最適な生物の止血、損傷関連炎症、および創傷治癒を研究するためのプラットフォームを提供します。...

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。...

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。...

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

ゼブラフィッシュの胆道による肝臓再生の根底にある分子メカニズムを評価するために、メトロニダゾール治療によりニトロレダクターゼを発現する肝細胞が遺伝的に除去される肝障害モデルを確立しました。...

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

学ぶレーザー光アブレーションを用いたゼブラフィッシュ腎臓上皮細胞の標的除去法。空間・時間的制御が可能なこの技術は、急性腎障害のモデリングと再生メカニズムの研究に有用です。

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

さらに動画を探す