Name: 出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ出芽酵母における微小管動態の計測法。GFP標識チューブリンと共焦点顕微鏡を用いて、生細胞内のアストラル微小管の動的変化をリアルタイムで解析する手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、様々なFP-TUB1プラスミドを共有するためのケリー・ブルーム（ノースカロライナ大学）、カイアング・リー（NCI）、スティーブン・マーカス（コロラド州立大学）、およびエルマー・シーベル（理学部ハイデルベルク）を感謝します。私たちは、スライドチャンバーの調製方法で私たちを訓練するためのメリッサ・ガードナー（ミネソタ大学）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所（NIH）（JKM）にR01GM112893-01A1と（CE）はT32GM008730を付与することにより、サポートされていました。

<ol><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+spindles+and+spindle+plaques+in+the+cell+cycle+and+conjugation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).</li>
<li>Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tub4p%2C+a+yeast+gamma-tubulin-like+protein%3A+implications+for+microtubule-organizing+center+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function.</a> J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).</li>
<li>Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Tubulin-like+Tub4p+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+associated+with+the+spindle+pole+body+substructures+that+organize+microtubules+and+is+required+for+mitotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation.</a> J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).</li>
<li>Winey, M., Bloom, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22491889">Mitotic spindle form and function.</a> Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).</li>
<li>Gupta, M. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Tubulin+C354+mutations+that+severely+decrease+microtubule+dynamics+do+not+prevent+nuclear+migration+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast.</a> Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Gartz Hanson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alpha-tubulin+mutation+disrupts+neural+development+and+tubulin+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis.</a> Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).</li>
<li>Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+negatively+charged+carboxy-terminal+tail+of+beta-tubulin+promotes+proper+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation.</a> Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).</li>
<li>Song, S., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+CDC5+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis.</a> J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).</li>
<li>Knop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging+of+yeast+genes+using+a+PCR-based+strategy%3A+more+tags+and+improved+practical+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines.</a> Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).</li>
<li>Kosco, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+dynamics+by+Stu2p+is+essential+for+spindle+orientation+and+metaphase+chromosome+alignment+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast.</a> Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).</li>
<li>Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+stabilization+of+microtubule+dynamic+instability+in+vitro+by+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine.</a> Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).</li>
<li>Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+and+discrete+functions+for+tubulin+carboxy-terminal+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails.</a> Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).</li>
<li>Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+living+budding+yeast%3A+anaphase+A+but+no+metaphase+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate.</a> Science. 277 (5325), 574-578 (1997).</li>
<li>Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc14-regulated+midzone+assembly+controls+anaphase+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B.</a> J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).</li>
<li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

出芽酵母モデルは、経時画像単一微小管に能力および酵母遺伝学のツールを使用してチューブリン及び微小管調節を操作する能力を含む、 インビボ設定において微小管ダイナミクスの高分解能測定値を収集するための主要な利点を提供します。 コンカナバリンAでコーティングされたチャンバーは、溶融寒天パッドを含む前述の装置、より多くの利点を提供します。チャンバを有するスライドを予め作製し、長期間保存するか、またはすぐに使用することができることができます。また、コンカナバリンAでコーティングされたチャンバーは、細胞が元々培養した同じ培地中で&gt; 6時間の酵母細胞を培養することが可能です。チャンバ内の細胞の数は、チャンバを画像化することができるどのくらいの期間を指示することに注意することが重要です。コーティングされたチャンバは、酵母細胞の単層のみがカバースリップに付着することを確実。最後に、複数のチャンバを作成することを可能にします同じスライド上に結像するためのいくつかの異なる酵母株。 比較的低い信号レベルとプロセスの非常に動的な...

微小管は、αβチューブリンタンパク質サブユニットからなる細胞骨格ポリマーであり、細胞内輸送、細胞分裂、形態形成、および運動性を含む細胞状況、多種多様に使用されています。これらの多様な役割のための微小管ネットワークを構築するために、細胞は、慎重に、いつどこで微小管の形を調整する必要があります。この規則は、遊離のサブユニットに微小管ポリマーまたは逆アセンブル微小管にαβチューブリンサブユニットを組み立てるのいずれかことが反応を制御することによって達成されます。これは、微小管ダイナミクスとして知られています。 微小管分野の主要な目標は、αβチューブリンサブユニットおよび/または微小管にチューブリンと結合する外因性制御因子の研究を含む微小管ダイナミクスを調節する分子メカニズムを解明することです。十分に確立された実験的なアプローチは、多くの場合に、COM、精製αβチューブリンタンパク質を用いてインビトロでこのシステムを再構築することです精製した外因性の規制当局とbination。これは有用なアプローチではあるが、再構成されたシステムでの微小管ダイナミクス生きた細胞で観察されたものから強く異なることは明らかです。例えば、微小管は、より速く成長し、 インビトロよりもインビボにおいても遅い縮小します。これらの違いは、細胞内の既知の外因性調節因子1の可用性、ならびにまだ未定義の要因に起因し得ます。したがって、微小管の規制当局およびネイティブ細胞の状況でのダイナミクスを混乱させる変異体の活性を測定することが重要です。 後生動物モデルは、微小管機能と高次組織を調査するための有力なシステムであることが証明されているが、いくつかの実用的な懸念が厳しく、微小管ダイナミクスの正確な測定のために、これらのモデルの有用性を制限します。まず、数十からセル当たり数千人に及ぶ微小管の高い数は、それが困難な自信を持ってすることができます時間をかけて個々の微小管を追跡します。多くの研究は、エンド結合（EB）家族の中でタンパク質のような選択的に微小管の両端に局在するタンパク質を、画像化することによってこの課題に対処します。しかし、これらのタンパク質は後生動物のみ2で成長している微小管の両端に局在することが知られています。したがって、これらのタンパク質の有用性は間接的にしかそのような破局の周波数と動力学の他の側面を、測定しながら直接、増殖速度を測定するように制限されます。第二に、ゲノム編集技術の進歩にもかかわらず、安定的に蛍光標識したチューブリンを発現するかまたは選択的にチューブリンまたは微小管のレギュレータを操作するために変異を導入した細胞を作成することは重要な課題です。また、後生動物における多くのチューブリンイソ型の存在は、変異は、個々のチューブリン遺伝子に影響を与える方法の研究を混乱させる。 出芽酵母系は、in vivo microtubu に測定するために、いくつかの重要な利点を提供しますルダイナミクス。酵母は、個々の微小管の可視化を可能に簡略化微小管ネットワークを持っています。酵母では、微小管は、核膜3中に埋め込まれている紡錘体極体（のSPB）、として知られているセンターを組織から発します。 SPBは、微小管4,5の核γチューブリン小複合体のための足場として機能します。 SPBは、微小管、スピンドル微小管とアストラル微小管の2つのクラスを核形成します。核質にスピンドル微小管プロジェクトと動原体微小管を経由し、極間微小管6を重ね経由してスピンドルを安定化させるための染色体に取り付けるために重要です。対照的に外側にサイトゾルに、アストラル微小管プロジェクト及び紡錘体微小管の緻密なネットワークに比べて比較的まれです。有糸分裂の際、事前に後期の細胞は、SPBのいずれかから発せられるだけで1-2アストラル微小管を持っています。これらは私のように存在してndividual微小管ではなく、バンドル7のように。有糸分裂時のアストラル微小管の役割は、つぼみネックとして知られている母親とつぼみのコンパートメントとの間の接合部の中に核とスピンドルを移動させることです。この動きは、向かって、最終的に芽ネック8に核とスピンドルを引く、アストラル微小管に力を生成する明確に定義された経路を含みます。 酵母系の別の利点は、比類のない精度で微小管調節剤及びチューブリンサブユニットを調査するために使用することができ、その遺伝学の有用性です。単一βチューブリン遺伝子（TUB2）および2つのαチューブリン遺伝子（TUB1とTUB3）：酵母はまた、チューブリンアイソタイプの簡略化されたレパートリーを有します。変異は、容易にこれらの遺伝子に導入し、それによって均質なチューブリン集団9、10で研究することができます。広くは数多くあります利用できるラベリング微小管のための構造、およびこれらは、安定な発現のための染色体座での統合のために標的とすることができる（説明を参照）。 この方法の全体的な目標は、微小管ダイナミクスの高分解能測定のための4つの次元（X、Y、Z、およびT）で酵母細胞を生きた画像単一微小管です。酵母細胞における蛍光標識チューブリンの恒常、低レベルの発現のための構築物を統合するための方法が記載されています。撮像前に、生きている細胞は、長期的なイメージングのための細胞を安定化するためにレクチンコンカナバリンAで被覆したスライドチャンバーに取り付けられています。画像取得のための最適なパラメータ、ならびにデータ分析のためのワークフローは、また、記載されています。

<table><tbody><tr><td>DOB(ドロップアウトベース)</td><td>サンライズサイエンス&nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>サンライズサイエンス&nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ポリスチレンプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA (Samon Sperm)&nbsp; 滅菌 DiH2O</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp;D7656</td> を <td>DiH2O 中で 10 mg/mL で再懸濁します。アリコートを-20&ordmで保管します。C</td></tr><tr><td>合成コンプリートメディア&nbsp;</td><td>日の出科学&nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>コンカナバリン A</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>L7647</td> を <td>DiH2O 中で 2 mg/mL で再懸濁します。アリコートを-20&ordmで保管します。C</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-374-12</td><td>パラフィン・フィルム</td></tr><tr><td>VALAP (ワセリン、ラノリン、パラフィンの等量)</td><td></td><td></td>は<td>75 & ordmで溶けます。鉗子を使用する前のC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>ポエチレングリコール(PEG)3350</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>strong会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E 倒立パーフェクトフォーカス顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメン</td>ツ <td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA 100X CFI Plan Apo 対物レンズ</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾ電動ステージ&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスクスキャナー</td><td>横河電機</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>レーザーコンバイナーモジュール</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Andor Technology</td><td>iXon Ultra 897&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>名<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ソフトウェア</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Bio-Formats Importer プラグイン</td><td>Open Microscopy Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>参照:Song、S.およびLee、KSSaccharomyces cerevisiae CDC5の細胞質分裂における新規機能。J Cell Biol., 152, 3, 451-469, 2001 (英語)</td></tr></tbody></table>

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

ダイナミック微小管は、多くの細胞プロセスの基本である、と微小管ダイナミクスの正確な測定は、細胞が、これらのプロセスを調節し、どのように遺伝的変異インパクトレギュレーション方法への洞察を提供することができます。後生動物モデルにおける微小管ダイナミクスの定量化は、遺伝子操作上の高い微小管の密度および制限などの関連する課題の番号を持っています。これとは対照的に、出芽酵母のモデルは、これらの課題を克服する利点を提供しています。このプロトコルは、酵母生細胞における単一微小管のダイナミクスを測定する方法を説明しています。蛍光タグ付けされたチューブリンを発現する細胞は、安定したタイムラプス画像の取得を可能にする、組み立てられたスライドチャンバーに接着されます。高速の詳細なガイドは、四次元画像の取得はまた、共焦点画像スタック内の動的微小管の特性を定量化するためのプロトコルと同様に、提供されます。この方法では、従来の酵母の遺伝学と組み合わせて、PROV定量チューブリンサブユニットの活性を変化させる微小管調節剤または変異の効果を評価するための一意に適しているアプローチのIDE。

生きた酵母細胞において微小管ダイナミクスを測定する遺伝子の変異は、微小管調節剤またはチューブリンサブユニット衝撃重合及び解重合速度、ならびにこれらの状態間の遷移の周波数をエンコードする方法を評価するための魅力的なツールを提供します。 図1ディスプレイ野生型細胞におけるアストラル微小管ダイナミクスの時系列と（430Δtub2-）βチューブリンに変異を有する変異体細胞。微小管は、微小管の長さを可視化するためにGFPタグ付きαチューブリンで標識されます。赤い矢印は、各画像（Figure1A及び1 C）にアストラル微小管の長さを追跡します。微小管の長さは8分間の各時点で測定し、そしてこれらのコンパイルされた長さは寿命プロット（ 図1B及び1 D）に示されています。これらのデータは、重合速度、解重合率、重合duratiを決定するために使用されました解重合時間、レスキュー周波数、大災害の頻度、および...

出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

この手順の全体的な目的は、酵母細胞における微小管のダイナミクスを測定することです。この手法は、微小管や微小管制御因子の変異が生細胞内でどのように微小管のダイナミクスを制御しているかなど、微小管分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた酵母細胞を画像内で安定化させることができる点にあります。むしろ、10分間の高時間分解能、または数時間の低時間分解能で測定します。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるColby FeesとCassi Estremです。この実験で使用する酵母細胞は、GFP標識したチューブリンを恒常的に発現するように構築されています。プレート上の単一コロニーから約 1 µL の酵母細胞を、3 mL の合成完全培地に接種します。30 °C で 250 RPM の振盪を加え、一晩培養します。翌日、飽和した培養液を培地で希釈し、OD600 が 0.1 未満になるように調整します。希釈した培養液を30 °Cのシェーカーに戻し、3〜4時間、あるいはOD600が0.4から0.8の間になるまで培養します。パラフィンフィルムを幅4インチ、長さ7インチのサイズに切り、フローチャンバースライドの準備を開始します。標準的な顕微鏡スライドをパラフィンフィルムの4インチ幅の辺に沿って縦に置き、フィルムをスライドに3〜4回巻き付けて、スライドが3〜4層のフィルムで覆われるようにします。層を押し合わせて適切に密閉させますが、強く押しすぎたり、フィルムにシワを寄せたりしないように注意してください。清潔なカッターナイフの替え刃を使用し、別のスライドを切り出し用の定規として当てて、スライドの外縁に沿ってパラフィンフィルムを切り離します。作業中のスライドから余分なフィルムを剥がして廃棄します。2枚目のスライドを定規として使い、積み重ねたフィルム層をスライドの長辺に沿って、幅約2～4 mmの帯状に約10本に切断します。次に、先ほどの切断線に対して垂直に、スライドの短辺に沿って積み重ねたパラフィンフィルム層を切断し、幅2～4 mm、長さ23～24 mm、厚さ3～4層のストリップを作成します。カミソリを45度の角度に当てて、切断したフィルムストリップを剥がします。次に、ピンセットを用いて、切断したストリップを清潔な顕微鏡スライドの上に均等に配置し、必要な数のチャンバーを作成します。この例では、4本のフィルムストリップを使用して3つのチャンバーを作成します。フィルムストリップの上にカバーガラスを1枚載せ、ピンセットで位置を調整します。準備したスライドを、カバーガラスが上になるように約95 °Cに設定したホットプレートの上に置き、フィルムストリップが半透明になるまで約3分間加熱します。ピンセットを用いて、パラフィンフィルムストリップの直上のカバーガラス領域を軽く押さえ、スライドとカバーガラスを密着させます。鉗子でスライドをホットプレートから取り出し、カバーガラス側を上にして置いて冷却させます。スライドが冷却されるにつれて、フィルムは白濁した色に戻ります。この手順を開始するには、凍結保存した200 µLのConcanavalin Aのアリコートを室温で融解させます。準備したスライドの各チャンバーの開口部の端から、融解したConcanavalin Aを約100 µLずつピペッティングして加えます。次に、カバーガラスを下にした状態でスライドを2つのマイクロチューブラックの間に5分間吊るし、Concanavalin Aをカバーガラスに吸着させます。スライドをカバーガラスが上の位置に戻し、合成完全培地でチャンバーを洗浄してConcanavalin Aを除去します。ペーパータオルの角を使用してチャンバーの一端から液体を吸い出しながら、同時に反対端から新しい液体をピペッティングし、チャンバー容積の2倍の培地を流します。指向性フロー法を用いて、チャンバー容積の2倍量の細胞懸濁液を流し、細胞をロードします。細胞をカバーガラスに接着させるため、スライドをカバーガラス側を下にして10分間静置します。合成完全培地をチャンバー容積の4倍量流し、非接着細胞を洗い流します。ペーパータオルのきれいな角でチャンバーの両端を慎重に拭き、メニスカスをカバースリップの端まで合わせます。温めたシーラントでチャンバーの両端を封止します。画像取得は、1.45 NA 100X CFI Plan Apo対物レンズ、ピエゾステージ、スピニングディスク共焦点走査ユニット、照明レーザー、およびEMCCDカメラを備えた倒立顕微鏡を用いて行います。画像取得の間、ステージの温度を室温に維持します。細胞にピントを合わせ、スライド内から細胞が集まっている箇所を探し、取得視野内の同一焦点面上に少なくとも5〜6個の細胞がクラスターを形成していることを確認します。時間の経過に伴い複数のzSeriesを収集するように、多次元取得をプログラムします。アクティブな取得設定を次のように調整します。酵母細胞全体を包含するように全Z深度を6 µmに、オーバーサンプリングを避けつつ光収集を最大化するようにZステップサイズを300 nmに、総時間を10分に、zSeries間の時間間隔を4秒に、そして各Z平面の露光時間を90 msに設定します。「Run」をクリックして取得を開始し、10分間の全時間をかけて実行させます。データは画像シリーズとして保存され、タイムラプスイメージングの結果例をここに示します。ImageJを開き、取得した画像スタックをコントロールパネルに直接ドラッグして、画像解析を開始します。Bio-Formatsによるインポートが自動的に開始されます。「OK」を選択して、画像スタックをハイパースタックとして読み込みます。ZProject機能を使用して、各zSeriesを最大強度の2次元投影に集約します。プロセスメニューからフィルターサブメニューを選択し、メディアン機能を選択して画像スタックにメディアンフィルターを適用し、スペックルノイズを低減します。半径のボックスに2.0 pixelsと入力し、OKをクリックしてください。視野内のpre-NFA細胞を特定します。これらは、中程度の大きさの出芽と、長さ約 1 ～ 1.5 µm の短い有糸分裂紡錘体を特徴としています。画像シリーズの最初のタイムポイントから、セグメント線ツールを使用して、星状微小管とより強く標識された紡錘体微小管との接点から、細胞質にあるプラス端に向かって、単一の星状微小管に沿って線を引きます。微小管の末端をダブルクリックして、セグメント線を完了させてください。キーボードのMボタンを押して計測機能を使用し、結果テーブルに測定値を記録します。すべてのタイムポイントの測定が完了したら、結果テーブルからデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、「名前を付けて保存」を選択してデータを保存します。この図は、野生型細胞および、微小管がより安定していることが以前に示された変異株における星状微小管ダイナミクスのタイムシリーズを表示しています。微小管の長さを可視化するため、GFPタグ付きα-チューブリンを用いて微小管を標識しています。赤色の矢印は星状微小管の全長を示しており、矢印の先端はプラス端を表しています。8分間にわたり各タイムポイントで微小管の長さを測定し、これらの集計された長さをライフプロットに示しています。緑色の点は重合を、桃色の点は脱重合を示しています。カタストロフイベントは矢印で示されています。これらのプロットは、変異体の微小管が野生型の微小管よりも長く、カタストロフの回数が少ないことを示しています。さらに、上昇および下降する微小管の長さの傾きから算出された重合速度および脱重合速度は、野生型と比較して変異体で低下しています。微小管ダイナミクスの測定により、変異体細胞における微小管は野生型よりもダイナミシティが低下していることも明らかになりました。スライド調製、細胞のロード、および画像取得に習熟すれば、これらを30分で完了できるため、1日で多くの異なるサンプルをイメージングすることが可能です。スライドチャンバーは、コンカナバリンAを加える前にあらかじめ作製し、保存しておくことができます。このビデオを視聴することで、簡易スライドチャンバー内で酵母細胞を安定化させ、4次元イメージングを行い、生細胞における微小管のダイナミクスを測定する方法について十分に理解できるはずです。また、この手順を修正することで、微小管以外にも、蛍光標識された他のタンパク質の生酵母細胞におけるダイナミクスを、数秒から数時間までの時間スケールで測定することが可能です。

high-resolution-imaging-analysis-individual-astral-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する...

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。...

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

分裂酵母は、 分裂酵母は、細胞質分裂を研究するための優れたモデル系、細胞分裂の最終段階です。ここでは、ライブ分裂酵母細胞内の異なる細胞質分裂のイベントを分析するために、顕微鏡のアプローチを説明します。...

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

このプロトコルは、多色4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いた発芽酵母における蛍光標識細胞内コンパートメントの分析について説明する。イメージ投射パラメータは、光の損傷を制限しながら、適切な信号をキャプチャするために選択されます。カスタム ImageJ...

酵母の4D顕微鏡検査

ここでは、有分裂・マイオシス時の生きた核分裂酵母細胞におけるタンパク質挙動や核ダイナミクスを研究者が研究できる非毒性顕微鏡法である生細胞イメージングを紹介する。...

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。...

単極有糸状スピンドルにおけるスピンディスク顕微鏡による微小管ダイナミクスの測定

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、分裂酵母を異種宿主として利用し、FtsZやMreBなどの細菌細胞骨格タンパク質をGFPとの翻訳融合タンパク質として発現させ、それらの重合を可視化します。また、重合に影響を与える化合物は、蛍光顕微鏡を用いたイメージングによって同定されます。...

細菌の細胞骨格タンパク質を標的とする抗菌薬スクリーニングのプラットフォームとしての分裂酵母

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S.

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

学ぶ出芽酵母における微小管動態の計測法。GFP標識チューブリンと共焦点顕微鏡を用いて、生細胞内のアストラル微小管の動的変化をリアルタイムで解析する手法を解説します。

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

さらに動画を探す