出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

この手順の全体的な目標は、酵母細胞の微小管の動態を測定することです。この方法は、尿細管の突然変異や微小管調節因子が生細胞内の微小管ダイナミクスをどのように制御するかなど、微小管分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生きた酵母細胞が画像内で安定化されることです。

むしろ、10分間の高時間分解能、または数時間の低時間分解能です。この手順を実演するのは、私の研究室の2人の大学院生であるColby FeesとCassi Estremです。この実験で使用した酵母細胞は、GFP標識チューブリンを構成的に発現するように構築されています。

プレート上の単一コロニーから約1マイクロリットルの酵母細胞を3ミリリットルの合成完全培地に接種します。細胞を摂氏30度で一晩成長させ、250RPMで振とうします。翌日、飽和培養物を培地中のOD600に0.1未満に希釈します。

希釈した培養物を摂氏30度のシェーカーに3〜4時間、またはOD600が0.4〜0.8になるまで戻します。フローチャンバースライドの準備を開始するには、パラフィンフィルムのシートを幅4インチ、長さ7インチのピースにカットします。パラフィンフィルムの幅4インチに標準的な顕微鏡スライドを縦に置き、スライドが3〜4層の厚さのフィルムで覆われるように、スライドにフィルムを3〜4回巻き

レイヤーを一緒に押して、適度なシールがあることを確認しますが、強く押しすぎたり、フィルムにしわを寄せたりしないようにします。クリーンボックスカッターカミソリと、切断用の直線エッジを提供する別のスライドを使用して、スライドの外側の端に沿ってパラフィンフィルムを切断します。作業スライドから余分なフィルムをはがし、廃棄します。

2枚目のスライドを直定規として、スライドの長軸に沿って積み重ねられたフィルム層を、幅2〜4mm程度の約10枚にカットします。次に、積み重ねたパラフィンフィルム層をスライドの短軸に沿って前のカットに対して垂直にカットして、幅2〜4ミリメートル、長さ23〜24ミリメートル、厚さ3〜4層のストリップを作成します。45度の角度でカミソリを使用して、カットしたフィルムストリップをはがします。

次に、鉗子を使用して、カットしたストリップをきれいな顕微鏡スライド上に均等に分散させ、必要な数のチャンバーを作成します。この例では、4 つのフィルム ストリップを使用して 3 つのチャンバーを作成します。フィルムのストリップの上に単一のカバースリップを置き、鉗子で所定の位置に移動します。

準備したスライドを、約95°Cに設定されたホットプレートにカバーアップして置き、フィルムストリップが半透明になるまでスライドを約3分間加熱します。ピンセットを使用して、パラフィンフィルムストリップの真上にあるカバースリップの領域を優しく押して、スライドとカバースリップを一緒にシールします。鉗子を使用してスライドをホットプレートから取り外し、カバースリップ面を上にして脇に置いて冷まします。

スライドが冷えると、フィルムは白い不透明な色に戻ります。この手順を開始するには、コンカナバリンAの冷凍200マイクロリットルアリコートを室温で解凍します。.準備したスライドの各チャンバーに約100マイクロリットルの解凍したConcanavalin Aを、オープンエンドの1つにピペッティングして追加します。

次に、スライドを吊るし、カバースリップを2つのマイクロチューブラックの間に5分間吊り下げて、Concanavalin Aがカバースリップに付着するようにします。スライドをカバーのスリップアップ位置に戻し、チャンバーを合成完全培地で洗浄してConcanavalin Aを取り外します。ペーパータオルの角を使用してチャンバーの一方の端から液体を引き出し、同時に新しい液体をチャンバーのもう一方の端にピペッティングすることで、チャンバー内の媒体の体積の2倍をチャンバー内を流れます。

指向性流動法を使用して、セル懸濁液のチャンバー容積の2倍を流すことによるロードセル。スライドを吊るし、カバースリップを下にして、細胞がカバースリップに接着するのを待ちます。非接着性の細胞は、合成完全培地のチャンバー容積の4倍を流して洗い流します。

ペーパータオルのきれいな角でチャンバーの両端を慎重に乾かし、半月板をカバースリップの端に持ってきます。チャンバーの両端を温かいシーラントで密封します。画像取得は、1.45 NA 100X CFI Plan Apo対物レンズ、圧電ステージ、スピニングディスク共焦点走査ユニット、照明レーザー、EMCCDカメラを搭載した倒立顕微鏡で行います。

画像取得中は、ステージの温度を室温に保ちます。細胞に焦点を合わせ、スライドでグループ化された細胞を探して、取得フィールドに同じ焦点面上に少なくとも5〜6個の細胞が集まっていることを確認します。多次元集録をプログラムして、時間の経過と共に複数のzSeriesを収集します。

アクティブ取得設定内の設定を次のように調整します:酵母細胞全体を包含する合計Z深度6マイクロメートル、オーバーサンプリングなしで光収集を最大化するためのZステップサイズ300ナノメートル、合計時間持続時間10分、zSeries間の時間間隔4秒、および各Z平面の露光時間90ミリ秒。[Run] をクリックして取得を開始し、10 分間実行できるようにします。データは画像シリーズとして保存され、タイムラプス撮影の結果例を以下に示します。

ImageJを開き、取得した画像スタックをコントロールパネルに直接ドラッグして、画像解析を開始します。インポートされたバイオフォーマットが自動的に開始されます。[OK] を選択して、イメージ スタックをハイパースタックとして読み込みます。

ZProject 関数を使用して、各 zSeries を最大強度の 2 次元投影に折りたたみます。画像スタックに中フィルターを適用し、処理メニュー、フィルターサブメニュー、および中央値機能を選択して、斑点ノイズを減らします。半径ボックスに 2.0 ピクセルを入力し、[OK] をクリックしますフィールド内の NFA 前のセルを特定します。

これらは、中型の芽と、長さが約1〜1ポイント5マイクロメートルの短い有糸分裂紡錘体によって特徴付けられます。画像シリーズの最初の時点から開始して、セグメント化された線ツールを使用して、アストラル微小管とより強く標識された紡錘体微小管との間の接合部に位置する単一のアストラル微小管に沿って、細胞質内のプラスエンドまで線を引きます。微小管の端をダブルクリックして、セグメント化されたラインを完成させます。

測定機能を使用して、キーボードのMボタンを押して結果テーブルに測定値を記録します。すべての時点について測定を行った後、結果テーブルからデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、[名前を付けて保存] を選択してデータを選択します。このグラフは、野生型細胞のアストラル微小管ダイナミクスの時系列と、以前に示されたより安定した微小管を持つ変異株を示しています。

微小管は、微小管の長さを視覚化するためにGFPタグ付きアルファチューブリンとラベル付けされます。赤い矢印はアストラル微小管の全長をなぞり、矢印の先端はプラスエンドを示しています。微小管の長さは、各時点で8分間測定され、これらのコンパイルされた長さは生命プロットに描かれています。

緑色の点が重合、ピンク色の点が解重合を示しています。大災害イベントは矢印で示されます。これらのプロットは、変異体の微小管が野生型の微小管よりも長く、大惨事が少ないことを示しています。

さらに、上昇する微小管の長さと下降する微小管の長さの傾きから決定される重合および解重合速度は、野生型と比較して変異体で減少します。微小管の動態の測定は、変異細胞の微小管が野生型と比較して動態性が低下していることも明らかにしています。一度習得すれば、スライド調製、細胞ローディング、画像取得を30分で完了できるため、1日で多くの異なるサンプルをイメージングできます。

このビデオを見た後、単純なスライドチャンバーで酵母細胞を安定化させ、4次元で画像化し、生細胞の微小管動態を測定する方法について、スライドチャンバーを事前に作成して保存することができます。微小管に加えて、この手順を変更して、生酵母細胞内の他の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを数秒から数時間の時間スケールで測定できます。