出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

この手順の全体的な目的は、酵母細胞における微小管のダイナミクスを測定することです。この手法は、微小管や微小管制御因子の変異が生細胞内でどのように微小管のダイナミクスを制御しているかなど、微小管分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた酵母細胞を画像内で安定化させることができる点にあります。

むしろ、10分間の高時間分解能、または数時間の低時間分解能で測定します。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるColby FeesとCassi Estremです。この実験で使用する酵母細胞は、GFP標識したチューブリンを恒常的に発現するように構築されています。

プレート上の単一コロニーから約 1 µL の酵母細胞を、3 mL の合成完全培地に接種します。30 °C で 250 RPM の振盪を加え、一晩培養します。翌日、飽和した培養液を培地で希釈し、OD600 が 0.1 未満になるように調整します。

希釈した培養液を30 °Cのシェーカーに戻し、3〜4時間、あるいはOD600が0.4から0.8の間になるまで培養します。パラフィンフィルムを幅4インチ、長さ7インチのサイズに切り、フローチャンバースライドの準備を開始します。標準的な顕微鏡スライドをパラフィンフィルムの4インチ幅の辺に沿って縦に置き、フィルムをスライドに3〜4回巻き付けて、スライドが3〜4層のフィルムで覆われるようにします。

層を押し合わせて適切に密閉させますが、強く押しすぎたり、フィルムにシワを寄せたりしないように注意してください。清潔なカッターナイフの替え刃を使用し、別のスライドを切り出し用の定規として当てて、スライドの外縁に沿ってパラフィンフィルムを切り離します。作業中のスライドから余分なフィルムを剥がして廃棄します。

2枚目のスライドを定規として使い、積み重ねたフィルム層をスライドの長辺に沿って、幅約2～4 mmの帯状に約10本に切断します。次に、先ほどの切断線に対して垂直に、スライドの短辺に沿って積み重ねたパラフィンフィルム層を切断し、幅2～4 mm、長さ23～24 mm、厚さ3～4層のストリップを作成します。カミソリを45度の角度に当てて、切断したフィルムストリップを剥がします。

次に、ピンセットを用いて、切断したストリップを清潔な顕微鏡スライドの上に均等に配置し、必要な数のチャンバーを作成します。この例では、4本のフィルムストリップを使用して3つのチャンバーを作成します。フィルムストリップの上にカバーガラスを1枚載せ、ピンセットで位置を調整します。

準備したスライドを、カバーガラスが上になるように約95 °Cに設定したホットプレートの上に置き、フィルムストリップが半透明になるまで約3分間加熱します。ピンセットを用いて、パラフィンフィルムストリップの直上のカバーガラス領域を軽く押さえ、スライドとカバーガラスを密着させます。鉗子でスライドをホットプレートから取り出し、カバーガラス側を上にして置いて冷却させます。

スライドが冷却されるにつれて、フィルムは白濁した色に戻ります。この手順を開始するには、凍結保存した200 µLのConcanavalin Aのアリコートを室温で融解させます。準備したスライドの各チャンバーの開口部の端から、融解したConcanavalin Aを約100 µLずつピペッティングして加えます。

次に、カバーガラスを下にした状態でスライドを2つのマイクロチューブラックの間に5分間吊るし、Concanavalin Aをカバーガラスに吸着させます。スライドをカバーガラスが上の位置に戻し、合成完全培地でチャンバーを洗浄してConcanavalin Aを除去します。ペーパータオルの角を使用してチャンバーの一端から液体を吸い出しながら、同時に反対端から新しい液体をピペッティングし、チャンバー容積の2倍の培地を流します。

指向性フロー法を用いて、チャンバー容積の2倍量の細胞懸濁液を流し、細胞をロードします。細胞をカバーガラスに接着させるため、スライドをカバーガラス側を下にして10分間静置します。合成完全培地をチャンバー容積の4倍量流し、非接着細胞を洗い流します。

ペーパータオルのきれいな角でチャンバーの両端を慎重に拭き、メニスカスをカバースリップの端まで合わせます。温めたシーラントでチャンバーの両端を封止します。画像取得は、1.45 NA 100X CFI Plan Apo対物レンズ、ピエゾステージ、スピニングディスク共焦点走査ユニット、照明レーザー、およびEMCCDカメラを備えた倒立顕微鏡を用いて行います。

画像取得の間、ステージの温度を室温に維持します。細胞にピントを合わせ、スライド内から細胞が集まっている箇所を探し、取得視野内の同一焦点面上に少なくとも5〜6個の細胞がクラスターを形成していることを確認します。時間の経過に伴い複数のzSeriesを収集するように、多次元取得をプログラムします。

アクティブな取得設定を次のように調整します。酵母細胞全体を包含するように全Z深度を6 µmに、オーバーサンプリングを避けつつ光収集を最大化するようにZステップサイズを300 nmに、総時間を10分に、zSeries間の時間間隔を4秒に、そして各Z平面の露光時間を90 msに設定します。「Run」をクリックして取得を開始し、10分間の全時間をかけて実行させます。データは画像シリーズとして保存され、タイムラプスイメージングの結果例をここに示します。

ImageJを開き、取得した画像スタックをコントロールパネルに直接ドラッグして、画像解析を開始します。Bio-Formatsによるインポートが自動的に開始されます。「OK」を選択して、画像スタックをハイパースタックとして読み込みます。

ZProject機能を使用して、各zSeriesを最大強度の2次元投影に集約します。プロセスメニューからフィルターサブメニューを選択し、メディアン機能を選択して画像スタックにメディアンフィルターを適用し、スペックルノイズを低減します。半径のボックスに2.0 pixelsと入力し、OKをクリックしてください。視野内のpre-NFA細胞を特定します。

これらは、中程度の大きさの出芽と、長さ約 1 ～ 1.5 µm の短い有糸分裂紡錘体を特徴としています。画像シリーズの最初のタイムポイントから、セグメント線ツールを使用して、星状微小管とより強く標識された紡錘体微小管との接点から、細胞質にあるプラス端に向かって、単一の星状微小管に沿って線を引きます。微小管の末端をダブルクリックして、セグメント線を完了させてください。

キーボードのMボタンを押して計測機能を使用し、結果テーブルに測定値を記録します。すべてのタイムポイントの測定が完了したら、結果テーブルからデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、「名前を付けて保存」を選択してデータを保存します。この図は、野生型細胞および、微小管がより安定していることが以前に示された変異株における星状微小管ダイナミクスのタイムシリーズを表示しています。

微小管の長さを可視化するため、GFPタグ付きα-チューブリンを用いて微小管を標識しています。赤色の矢印は星状微小管の全長を示しており、矢印の先端はプラス端を表しています。8分間にわたり各タイムポイントで微小管の長さを測定し、これらの集計された長さをライフプロットに示しています。

緑色の点は重合を、桃色の点は脱重合を示しています。カタストロフイベントは矢印で示されています。これらのプロットは、変異体の微小管が野生型の微小管よりも長く、カタストロフの回数が少ないことを示しています。

さらに、上昇および下降する微小管の長さの傾きから算出された重合速度および脱重合速度は、野生型と比較して変異体で低下しています。微小管ダイナミクスの測定により、変異体細胞における微小管は野生型よりもダイナミシティが低下していることも明らかになりました。スライド調製、細胞のロード、および画像取得に習熟すれば、これらを30分で完了できるため、1日で多くの異なるサンプルをイメージングすることが可能です。

スライドチャンバーは、コンカナバリンAを加える前にあらかじめ作製し、保存しておくことができます。このビデオを視聴することで、簡易スライドチャンバー内で酵母細胞を安定化させ、4次元イメージングを行い、生細胞における微小管のダイナミクスを測定する方法について十分に理解できるはずです。また、この手順を修正することで、微小管以外にも、蛍光標識された他のタンパク質の生酵母細胞におけるダイナミクスを、数秒から数時間までの時間スケールで測定することが可能です。