筋肉組織を直接液体窒素中に浸漬されたときにアーティファクトを凍結マルチホールクライオバイアルが不要

本手順の目的は、凍結アーチファクトを排除しながら、筋肉組織を液体窒素に直接投入して凍結させることです。私の研究室の学生であるMaozhang Heが、Yizhong Huangと共にこの手順を実演します。まず、各クライオバイアルにサンプル名を記載してください。

次に、以下の器具を準備します：液体窒素タンク、保護メガネまたはフェイスシールド、冷凍用手袋、10 cmのピンセット、および25 cmのピンセット。また、発泡スチロール製クーラー、プラスチックフィルム、メス、およびA4サイズのPVC製バインダーカバーも準備してください。筋肉サンプルを調製するために、まずクーラーに液体窒素を満たします。

検体を採取してから5分以内に、サンプルをA4サイズのPVC製バインダーカバーの上に静かに置き、筋線維の走行を確認します。次に、メスを用いて、筋線維の方向に沿って、長さ約3 cm、間隔0.6 cmとなるように2本の平行な切開を検体に加えます。切開した筋肉を、幅約0.6 cm、高さ0.6 cm、長さ1.5 cmの直方体に切り出します。

次に、10 cmの鉗子を用いて、切開した筋肉の長軸がプラスチックフィルムの長辺と平行になるように、サンプルをフィルムの上にそっと置きます。ラベルを貼った凍結保存チューブの下部中央、導入孔の間に筋肉組織を入れ、チューブのキャップをしっかりと閉めます。組織サンプルを凍結させるため、25 cmのピンセットを使用して、あらかじめ冷却したスタイロフォーム製クーラー内の液体窒素に凍結保存チューブ全体を素早く浸し、液体窒素が沸騰しなくなるまで待ちます。

液体窒素は、クライオバイアル全体を浸すのに十分な量であり、バイアルが完全に液面下にある必要があります。筋肉サンプルを液体窒素保存タンクまたは-80°Cフリーザーに移し、長期保存します。凍結した筋肉が、室温の容器や器具に不意に接触しないようにすることが重要です。

スライドを作成するために、クライオスタットを20 °Cから22 °Cの間まで予冷します。古いミクロトーム刃を取り外して廃棄し、クライオスタット内のナイフホルダーとアンチロールプレートを拭き上げます。次に、新しいミクロトーム刃をクライオスタットに取り付け、切片の厚さを8 µmに設定します。

筋肉サンプルの入った凍結保存バイアルを、液体窒素貯蔵タンクまたは-80°Cのフリーザーから取り出し、液体窒素またはドライアイスの上に置きます。次に、サンプルをクライオスタットへ移し、検体がクライオスタットの温度に馴染むまで30分間待ちます。OCTを用いてサンプルを包埋した後、検体ホルダーにサンプルを固定します。

次に、8 µmの厚さで切片を作成します。切片を室温のマイクロスライドの中央付近に載せます。その後、速やかにスライドをスライドボックスに入れます。

次に、スライドボックスを-80 °Cのフリーザーに入れます。スライドを室温で乾燥させないでください。ここで示されているように、ブタの最長筋（longissimus dorsi muscle）のサンプルを直接-80 °Cのフリーザーに入れた場合、氷結晶が形成され、筋肉の凍結切片に周知の「スイスチーズ現象（Swiss cheese effect）」が生じました。

筋肉組織を液体窒素に直接浸した際にも、氷晶が形成されました。別の方法として、組織を適切な方向でOCT包埋剤に浸し、その後イソペンタンのスラリーで急速凍結させると、筋細胞の細胞質区画に多くの針状の氷晶が形成されました。マルチホールクライオバイアルを用いて組織を凍結させることで、細胞質区画が明確に観察され、筋細胞と周囲の組織が密接に接した状態が維持されるという、極めて優れた標本整合性が得られます。

本手法を用い、速筋線維および緩徐筋線維におけるATPase活性を分析しました。等しい時間を処理した場合、速筋線維は淡い色で2段階の濃淡として現れ、緩徐筋線維は黒色に現れます。ここで示す標準的な凍結法では、筋肉組織をOCT包埋剤に直接接触させずにイソペンタンのスラリーに浸漬させましたが、イソペンタンの固液スラリー状態を1時間以上維持することは困難であり、またイソペンタンが常に利用可能であるとは限りません。