マカクにおける肝臓及び腸間膜リンパ節のシリアル収集のための腹腔鏡技術

この低侵襲腹腔鏡手術の全体的な目標は、腸間膜リンパ節の収集と複数の時点での肝生検により、消化管からの微生物転座の影響の評価を改善することです。この方法は、感染の免疫学的影響と腸間膜リンパ節と肝臓への微生物転座、およびこれらの組織の病理に関するHIV生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、動物や評価対象のパラメータへの影響を最小限に抑えながら、研究の複数の時点でサンプリングできることです。

この方法は、HIVの理解を深めるために重要なサンプルを提供することができます。また、消化管の炎症や微生物の転座が重要な他のモデルにも適用できます。手順を行うのは、ワシントン国立霊長類研究センターの獣医であるジェレミー・スメドレー博士とキャシー・モーツ博士です。

テキストプロトコルに示されているように手術用のマカクを準備した後、滅菌済みの穴あきドレープで覆います。次に、滅菌カメラドレープを使用して、デジタルカメラをしっかりと覆い、タワーに差し込みます。リジッドスコープをカメラヘッドに接続します。

次に、滅菌ライトケーブルをリジッドスコープに取り付け、光源に接続します。最後に、滅菌気腹チューブを送気器に取り付けます。腹腔鏡検査を開始するには、15メスの刃を臍の左側に約1〜2センチメートル配置し、腹部の筋肉に達する皮膚に約5ミリメートルの刺し傷を切開します。

利き手ではない手で、切り傷の頭蓋側の腹壁を持ち上げます。次に、もう一方の手を使用して、動物の頭に向かって角度をつけた内反針の先端を切開部から導入します。内反針をシャフトで保持し、腹壁をカチッと音がして腹腔内で針に対する抵抗が減少するまでしっかりと押します。

次に、CO2吸入器のチューブを針に取り付け、ストップコックを開いてガスを腹腔内に放出します。最大10〜12ミリメートルの水銀柱の圧力に達することにより、気腹を作り出します。腹部が完全に注入されたので、15メスの刃を左頭蓋腹部、最後の肋骨まで約2〜4センチの尾側に配置し、約5〜7ミリメートルの皮膚切開を行います。

次に、カットを通して5ミリメートルのトロカールカニューレアセンブリを挿入します。アセンブリを1〜2センチメートルの深さに導入し、尾内側に約45〜60度に向けています。次に、回転運動でカニューレを前方にスライドさせ、1.5〜3センチメートルの深さまで伸ばして、カニューレを腹部にねじ込みます。

その後、トロカールを取り外します。内反針からインファフレーターチューブを外し、その後、ストップコックをオフにします。チューブをカニューレに接続し、ストップコックを開いて気腹を維持します。

圧力が正常に維持されていることを確認したら、内反針を取り外します。次に、カニューレを通して、硬質スコープを腹腔に挿入します。カメラの制御下で、内反針除去後に残った皮膚切開部を深くし、腹筋と腹膜を切断します。

最後に、足を頭から約15〜30度上に上げて動物を配置します。腸間膜リンパ節から生検を採取するには、準備した切開部を通じて腹腔内に固体プローブを導入します。プローブを大網と腸の間に置き、緩やかに掃くような動きで腸を大網から露出させ、下に隠れている腸間膜を視覚化します。

プローブを尾側から頭蓋方向に動かし続けて、大網を手術野から遠ざけます。次に、プローブを使用して、下行結腸を腹壁に向かって動かします。プローブで腸間膜を検査し、結腸間膜血管および腸間膜血管に沿って位置する腸間膜リンパ節を特定します。

リンパ節が特定されたら、腹腔内のプローブをメリーランドラチェット鉗子と交換し、リンパ節に隣接する腸間膜をつかみます。腸間膜を切開部に向かって引っ張り、カニューレからスコープを取り外します。次に、インファレーターの電源を切り、カニューレストップコックを開いたままにして腹部からガスを放出すると、腸間膜の外部化が容易になります。

次に、切開部から腸間膜を引っ張ります。外側の腸間膜を鉗子でつかみ、切開部からのアクセスを確保します。腸間膜を触診または観察して、より固い結節または灰色の領域として現れるはずのリンパ節を特定します。

次に、湾曲した止血剤を使用して、結節に隣接する腸間膜に3〜5ミリメートルの開口部を作り、組織への付着物を鈍く解剖します。必要に応じて、4-0の非吸収性モノフィラメント縫合糸で血管系を結紮し、メスを使用してリンパ節を解剖します。次に、生検を RPMI 1640 培地で氷上に置きます。

最後に、腸間膜を解放し、腹部をもう一度膨らませて、組織を腹腔に引き戻すことができます。テーブルを水平位置に戻します。肝生検を採取するには、リンパ節採取に使用する切開部から腹腔内にねじ込みカニューレを挿入します。

次に、カニューレを使用して、頭蓋腹腔に向けられた硬質スコープをスライドさせて、肝臓を視覚化します。カメラの制御下で、以前に腹腔を充填するために使用したカニューレを通して生検鉗子を導入します。鉗子を指定された肝葉縁の下に配置して、顎が組織に面するようにし、鉗子を開いて縁が顎に落ちるようにします。

位置を調整した後、鉗子を閉じ、圧力を約20〜30秒間維持します。次に、カニューレを通して鉗子をそっと引っ張ってサンプルを取り出します。生検を氷上のRPMI培地に置きます。

最後に、生検の部位に出血が観察されていないことを確認し、切開部を閉じます。ここに示されているのは、腸間膜リンパ節から得られた細胞収量と、2つの異なる時点で2人の健康な女性メカクから収集された肝生検です。予想通り、リンパ節生検では、肝生検と比較して、単離された細胞の数が有意に多かった。

ソース組織に関係なく、単離された細胞の85%以上が生存可能でした。次に、単離された細胞サンプルをCD45+白血球およびCD45+CD3+リンパ球集団について分析しました。腸間膜リンパ節は、肝臓由来の細胞と比較して、CD45+白血球およびCD3+リンパ球の頻度が高かった。

単離された集団の詳細な特性評価により、腸間膜リンパ節には、CD3+T細胞およびCD4+T細胞の割合が有意に高く、CD8+T細胞の数も増加していることが示されました。逆に、肝臓はCD14+白血球が有意に豊富でした。両器官は、CD20+B細胞の存在量が同程度であることを示しました。

一度習得すれば、このテクニックは30分から40分で実行できます。動物は通常、麻酔から回復し、数時間以内に活動し、食事をしますが、切開部は非常に小さいため、ケージ側が見づらくなることがあります。この手順を試みるときは、動物を成功を容易にする体調に維持することが重要です。

腸間膜脂肪が多いと、結節が不明瞭になり、揚げやすさと出血が増加するため、困難な障害になる可能性があります。この手順に続いて、瀉血、末梢リンパ節生検、上部および下部消化管内視鏡検査、直腸生検などの他の方法を実行して、全身および粘膜の免疫応答、微生物および上皮バリアの状態、およびウイルス量を評価することができます。この技術の開発後、私たちの研究室の研究者は、以前は剖検によってのみ利用可能であったマカクザルの組織で、炎症の微生物集団を縦断的に探索する道を開きました。

この技術の意味は、微生物の転座がHIVの病因を引き起こす炎症の主な原因であるため、HIVの治療にまで及びます。これを順次評価することで、潜在的な標的を提供し、治療介入の評価が可能になります。ウイルスに感染したマカクザルと一緒に働くことは非常に危険であることを忘れないでください。

マカクシンヘルペスウイルス1を含むバイオハザードの適切なトレーニング、適切な個人用保護具、咬傷および引っかき傷キット、適切な医療フォローアップなどの予防措置が利用可能である必要があります。