Name: 評価プライマリ ブラスト効果の in Vitro (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ ショック波による一次細胞の機械的損傷評価法。カスタムショックチューブを用いて細胞生存率を測定し、ブラスト傷害の細胞応答メカニズムを解明する。

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HA と CAH に医学研究評議会 (M01858X/1) から資金調達する爆風損傷研究のロイヤル英国リージョン センターの助成を受けたいと思います。

1 細胞培養そしてサンプル準備 <ol><li>取得適切なセルライン (例えば、 毛乳頭細胞)。 。
	注: 現在のプロトコル搭載されており付着細胞のラット乳頭線維芽細胞由来のヒゲのモデルとして使用します</li>。
	<li>10% 牛胎児血清と 1% ペニシリン ストレプトマイシン補われる最小必須培地 (MEM) α を含む T-75 フラスコの細胞を培養します。80% の合流点に到達するまで加湿環境で CO 2 を 37 ° C および 5% の標準的な培養条件で細胞を維持します</li>。
	<li>培地を吸引・ ダルベッコの 2 回セルを洗浄 &#39; s リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。2 mL のトリプシン/edta 標準文化 5 分のための条件は簡単に細胞が正常に (10 X 対物レンズと光/位相差顕微鏡を使用してフラスコから分離したことを確認してくださいにそれらをインキュベートし、フラスコから細胞を分離します。).</li>
	<li>は、trypsinization 反応を中和するために培養液の 4 mL を追加します。15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します</li>。
	細胞のペレットを 4 分の 200 x <li>遠心 g。ゆっくりと、ペレットが外れないように世話、上清を吸引します。培地 5 mL にペレットを再停止します</li>。
	<li>きれいな検定に細胞懸濁液の 20 μ L 因数を転送し、顕微鏡 10 X 対物レンズが装備を使用してセルをカウントします</li>。
	<li>は、3 つの 35 mm 料理 90 mm ディッシュ内に配置することによって爆発のセルを準備します。適切にラベルを付けます。各 35 mm ディッシュの培地 2 mL に追加で一皿、皿全体に均一に細胞を配布する 5 x 10 の 4 セルの合計をシードします。衝撃波の前に適切なセルの添付ファイルを許可する標準的な培養条件で一晩実験サンプルをインキュベートします 。
	注: 蛍光イメージングのセルする必要がある滅菌ガラス カバーガラス上</li>。
</ol> 2。管に衝撃を与える <img alt="Figure 2"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg"/> 図 2 : EVOC リグと衝撃管アセンブリ。(A) EVOC リグのイメージ。(B) 衝撃波管の概略図です。作動筒には内径が 59 mm と 4.13 m、EVOC リグを含む全体の長さが含まれます。駆動チューブの EVOC リグ合計 2.71 メートル長さ <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>組立手順中に仕事鋼鉄つま先のブーツおよび実験室のコートを着用します</li>。
	<li>挿入 2 つのボルト穴を 2 つ配置バーは排気口フランジの水平面で発見します。排気口フランジと 前のヴィヴォ オルガン文化 (EVOC) リグとの間に収まるように配置バーの端にニトリル ゴム製ガスケット シートを配置します 。
	注: EVOC リグは 35 mm ペトリ皿 ( 図 2 a) 用特注器具</li>。
	<li>、配向正しく、そのベースにペトリ皿を握るセクションがある配置バーで器具をスライドして衝撃波管の出口フランジに EVOC リグを取り付けます</li>。
	<li>は、残りの穴に 4 つの M24 ボルトとワッシャーを挿入します。彼らに触れるフランジ ナットを配置します</li>。
	<li>しっかりと EVOC リグおよび衝撃管が正常に整列しているを視覚的にチェックしながらナットとボルトを対角的に対称的固定順にします</li>。
	<li>圧力トランスデューサー EVOC リグにしセンサー ケーブルを使用して現在のソースにそれを接続します。その後、電流をオシロ スコープに接続する BNC ケーブルを使用しています</li>。
	<li>ことを確認すべてのリリース バルブと衝撃波管のコントロールの流れが閉鎖されています。内蔵外部圧縮空気ラインを開き、手動で圧力調整弁を時計回り 2.5 バーにソレノイドを充電に回して</li>
	<li>反時計回り 180 ° 回して圧縮ガス容器の安全弁を開きます</li>。
	<li>ゆっくり回す圧力レギュレータ、時計回りに約 15 バーに圧力を高めるガス容器の上部にある 
	注: このレギュレータの設定ポイント必要があります少し上最高破裂する実験に使用される厚いダイヤフラムの圧力します</li>。
	<li>は、10 cm × 10 cm の正方形に 0.125 mm の厚さのプラスチック シートを切断することによってダイヤフラムを準備します 。
	注: ダイヤフラムの厚さ (すなわち、 厚いダイヤフラムに衝撃波大きいピーク圧力となります衝撃波のピーク圧力を変更する、破裂圧力に関連します。テーブル 1).</li>
</ol> < テーブルの fo:keep-together.within-ページ =「1」> <tbody><tr><td>マイラー ダイヤフラム寸法 (cm)</td> <td>バースト (棒) 圧力</td> <td>センサー 3 圧レンジ (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x0.023</td> <td>2 ± 0.2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 × 10 × 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9.5 ± 0.5</td> <td>127 ± 12.5</td></tr></tbody> </tできる > テーブル 1: ダイヤフラムの厚さとピーク圧に対応する圧力をバーストします。
<ol start="11"> <li>テープからハンドルを作成、横隔膜の上下にそれらを修正および慎重に砲尾の部屋によってフロントの小さなフランジの横にあるダイアフラムの位置にそれらを使用します。骨盤を閉じる前に、横隔膜がストレートと位置が正しいことを確認します</li>。
	<li>は 4 つの M24 ボルトとナットを使用してこれに安全します。斜め対称的に順番にナットとボルトをしっかりと固定します</li>。
</ol> 3。衝撃波にセルだけ事前の準備 <ol><li>紫外線殺菌を行い組織層流フードの準備。それを消毒ソリューションと 70% エタノールできれい。細胞事前に/ポスト-shock 処理に必要なすべての項目の露出を波し、無菌フード内に配置を収集します 。
	注: これには、ピペット、ピペット、滅菌はさみ接着ガス透過性膜新鮮な媒体が含まれていますヒント</li>。
	<li>無菌フードにインキュベーターから 3 つの実験サンプルを含む 1 つの 90 mm シャーレを転送します</li>。
	<li>接着剤のガス透過性膜シート (材料の表 を参照してください)、六つの正方形にそれぞれが 1 つの 35 mm のペトリ皿の上をカバーするのに十分な大きさになるようカットします</li>。
	<li>35 mm シャーレから培地を吸引、片側にふたを閉めて密封膜と皿の端の間は、接着剤のガス透過性膜の 2 つのセクションでカバーします</li>。
	<li>EVOC リグにサンプルを転送し、皿の上が衝撃波管のインナー ベースと揃うように、治具のベースに固定します</li>。
</ol> 4。管操作に衝撃を与える <ol><li>ショック チューブ システムを加圧時に耳の守備、目のゴーグル、安全ブーツ、研究室コートを着用します</li>。
	<li>衝撃波管に圧縮空気シリンダーを接続するフレキシブル ホースに流れるガスを許可する、時計回りにレギュレータを流量調節ノブをオンにします</li>。
	<li>コントロール パネルの下部には、いずれかを選択、&#34; ダブル骨盤 &#34; 短期衝撃 wav の入口e または &#34; ドライバー管 &#34; 増加の波の持続期間のための入口です</li>。
	<li>直流電源、オシロ スコープで波形データを集録するスイッチ。50.0 MS にオシロ スコープのサンプリング レートを設定/s、レコード長は 1 m のポイントします。50 の範囲を設定 2 バーで発射、100 mV 4 バー上の mV</li>
	<li>は、コントロール パネルの反対側の壁にスイッチを使って安全ライトをオンにします 。
	注: この衝撃波管を充電時部屋に入るが他の研究者に指示します</li>。
	<li>は、ソレノイドを閉じますソレノイド制御ボックスのスイッチをオンにします 。
	注: この安全機能は、課金システムを可能にするダブル砲尾の部屋にあるバルブを閉じます</li>。
	<li>コントロール パネルでゆっくりとノブを反時計回りに圧縮チャンバー内の圧力を徐々 に増やすことでフロー制御を開きます。コントロール パネルのディスプレイを使用して圧力を監視します</li>。
	<li>一度横隔膜破裂圧力に達すると、横隔膜が破裂と &#34; バン &#34; 音が聞こえます。ノブを回すことによってフロー制御をすぐに閉じます 。
	注: 衝撃波管が旅行されますセルのサンプルとチューブの端をします</li>。
	<li>ソレノイド コントロール ボックスのスイッチをオフにするソレノイドを開き、(コントロール パネルの反対側の壁にスイッチを使用して) 安全光スイッチをオフ</li>。
	<li>無菌フードにセルのサンプルを転送する、接着剤のガス透過性膜を削除、新鮮な成長培地 2 mL で皿を満たし。セルを手順 5 で説明したように評価のためすぐに使用または長期的な研究のためのインキュベーターに返されますできます</li>。
</ol> 5。細胞生 <ol><li>査定セル実行可能性次の酸化還元インジケーター試金とライブとデッド細胞の蛍光イメージングの組み合わせを使用して衝撃波 。
	注: 蛍光イメージングのセルする必要がありますシード滅菌ガラス カバーガラス上セクション 1: 細胞文化およびサンプル準備。これらは 35 mm のペトリ皿内に配置することができます</li>。
	<li>転送 200 μ L 酸化還元インジケーター試薬 (材料の表 を参照してください) 2 ml 中ショック後の補充直後に各実験的料理波露出。4 h の標準培養条件で孵化させなさい</li>
	<li>各料理のいずれかブラック 2 × 100 μ 因数 (暗い無菌フード) に転送または蛍光や吸光度が生存率を評価するために使用されるかどうかによって、96 ウェル プレートをオフにします</li>。
	<li>96 ウェルのプレートを正しいフィルター装備適切なプレート リーダーに転送し、蛍光または 570 励起バンド 530ex/590em を使用して読み取る nm 吸光度の 600 nm リファレンスと組み合わせます。エクスポートし、データを保存します</li>。
	<li>細胞生存率の低下を示すことができますこの衝撃波にさらされたサンプルと非露出コントロール、違いを識別するためにデータを分析します 。
	注: 陰性対照も実験的なデザインに含まする必要があります。セルの数値を計算するさらに、標準曲線の補間を使用できます</li>。
	<li>は、酸化還元インジケーター試薬を含む培地を吸引します。新鮮な培地 2 mL に置き換えるし、24 時間の標準的な培養条件で細胞をインキュベート</li>
	<li>2 番目の生存時間ポイントを取得する必要に応じて上記の手順を繰り返します</li>。
	<li>ライブとデッド細胞の蛍光イメージング、培地を吸引し、2 回 1 mL の PBS のセルを洗浄します。転送 100 μ L イメージングは、完全な試薬の各サンプル キット (材料の表 を参照) と 15 分のためのライトから保護された室温でインキュベート</li>
	<li>試薬を吸引させ 1 mL の PBS を使用。細かい点鉗子を使用して、慎重に、coverslip 35 mm ディッシュから取り外してガラス顕微鏡スライド上に下向きに配置します</li>。
	正しい刺激および放出フィルター装備 (10 X 対物レンズ開口数 0.50) 蛍光顕微鏡を用いた各サンプルの <li>取得画像 (ex/em 488 nm/515 nm と 570 nm/602 nm). 
	注: 生きているセルは強烈な制服、緑の蛍光を出します。死亡または危険にさらされた細胞膜細胞が取り込み死んでキット コンポーネント、セルの核の領域で主に見つけた赤い蛍光性の放出の結果します</li>。
	<li>画像解析ソフトウェアのいずれかを手動でまたは自動的にそれぞれのイメージからライブとデッドの細胞の数をカウントを使用します</li>。
</ol>

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</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

爆発イベントへの暴露から得られた主要な傷害はまだ完全に理解されません。識別し、外傷性脳傷害3,などの爆発による傷害を発生させるメカニズムを理解すること4異所性骨化6、7の開発に重要な最初のステップであります。予防の効果的な方法です。この目標を達成するためには、爆発イベント露出11,12,13,14,18,19 をレプリケートする実験システムの数が開発されて.説明する手法は、ここで全身 (すなわち、齧歯動物)、組織、または細胞のサンプルでの圧力の範囲で衝撃波を発射可能な衝撃管装置 (図 2) を使用します。組織全体ではなく個々 のセル型をロードする機能は、損傷がメカニズム1,2の範囲で同時に発生することが明確な細胞応答を解析する能力。たとえば、外傷性をモデル化する脳損傷、神経細胞やアストロ サイトなどの個々 のセル型の評価をセル固有の損傷の同定に許可できます。また、全臓器応答は、脳組織を使用して評価できます。個々 のセルの種類と組織標本値を有し、さまざまな情報を与えることができます。また、ダブル砲尾またはドライバー管の入口を選択することにより衝撃を生成する加圧空気の量を変更することが可能です。これは衝撃波の持続期間を制御します。別の可能性は、ダイアフラム材質と厚さ25ピーク圧力を変更するを変更することです。
考慮する別の要因は、サンプル住宅は本システムに記載されている EVOC リグにあるなど、無隔膜ショック ・ チューブの出口近くに位置するときに存在することができます干渉終了効果です。チャンドラらブラスト波プロファイル圧縮駆動衝撃波管のさまざまな場所で発見し、発見フリードランダー波形が深い衝撃管15内の場所で表された最高を見た。Kuriakoseらまた、サンプルのセカンダリの読み込みを学び、衝撃波管の終わりにエンド プレートの配置は16不要な反射波を除去することができることがわかった。この資料に記載されているショック チューブ システムを改善する将来的な変更は駆動チューブ内のより深い位置に EVOC リグの配置を含むことができるこれら出版物15,16で見つかったデータを考慮したり、また、無隔膜ショック ・ チューブのエンド プレートを含めること。この方法の制限は、サンプルのスループットが比較的低くてを含めることができます。単一のユーザーは周りの出力で安全に衝撃波管を操作できる時間あたりのサンプル数 6-8。現時点では、システムは単一の 35 mm シャーレの使用を回避設計されています。したがって、複数のグループと生物の複製を含むより大きい実験は達成することは困難することができます。
このメソッド記事付着毛乳頭細胞の生存率が単一衝撃波への露出によってどのように影響を受けるかを示しています。短時間の衝撃波 (&#60; 10 ms) コントロール (図 3および図 4) と比較した場合の生存率が ≤72 の kPa に影響しなかった。酸化還元インジケーター試金 (図 3) と蛍光画像解析 (図 4) の両方で示すように、対照的に、127 kPa で衝撃波は、24 h 後爆発で生存率で大幅な低下を刺激します。細胞は、いずれかにさらされたとき、ミラーらがラット脊髄海馬スライス培養における細胞生存率の同様なリスク減少を報告 147 kPa またはオープン エンド、ヘリウム駆動ショック チューブ14を使用して 278 kPa 衝撃波。対照的に、VandeVordらは報告の短時間の超過圧力にさらされたラット アストロ サイトにおける生存力に効果がなかった &#62; 200 kPa、ショック チューブ18ではなく、barochamber が使用されました。しますがそのため、荷重の性質をティッシュか細胞の機械的特性に大きく依存して、本体内で複雑な応力波、外部圧力が爆風波に依存していることに注意してください。爆発イベントに対する細胞応答のさらに特性評価研究が必要です。さらに、この手法で示すように、細胞レベルでの衝撃波を評価する、ことによって生物学的応答シグナル伝達経路やエピジェネティックな変化の摂動などの損傷からトリガーを識別してさらに検討します。
結論としては、この作品は、ステンレス鋼衝撃波管と一次電池文化を組み込む変更された EVOC リグの使用について説明します。衝撃波圧力の範囲内では、生成され、爆風波への暴露から発生する効果を複製する生きているセルを介して伝達することができます。このプロトコルは細胞の生存率を評価する方法を示しますが、個々 のセルの種類を長期的な変化を検討もできます。今後からは、我々 は複雑な衝撃波は爆発による主な傷害の私達の理解を促進することを目的と異なったセルタイプで引き出すことができる差動効果を評価する予定です。

モダンウォー フェアと民間人に対するテロ行為の即席に作られた爆発物の使用傾向の最近、大きい重要性の爆発的なイベントの人体に及ぼす影響を理解することです。爆発イベントへの暴露を介して得られる傷害が致命的な 4 つのカテゴリに分割されている損傷の物理的なプロセスと、致命的なことができます。膜及び軟部組織1の混乱を引き起こし、圧縮でその後広範な方法でボディとローカル相互作用する爆風への直接暴露から主要な傷害の結果。二次傷害は、外傷または浸透の傷による影響、爆風によって高速で推進する低質量オブジェクトに含まれます。第三紀の負傷は、爆風波に高い質量またはオブジェクトに対して個人のオブジェクトをスローするように十分なエネルギーがある場合に発生します。最後に、第四紀の爆風損傷はフラッシュやけど2など、他のカテゴリに適合しないその他の他傷害によって定義されます。次の爆発のようなイベントへの暴露, 主傷害は、外傷性脳傷害3,4、5、異所性骨化6、7ブラスト肺傷害8聴覚の損失9、その他10。
爆発イベントから一般的観測波形は、自由音場、閉鎖空間ではなく爆発を表すフリードランダー波です。波形は、肯定的な圧力で急激かつ急速な上昇として定義することができます爆発前で構成されています。これは高速で大気中濃度以下に圧力を減らすリリース波移動空気の爆風によって直後に。部分的な真空空気の遅い逆流の結果初期の爆発のままです。ブラスト波1のプッシュ ・ プルの動き波 (図 1 a) の正および負のフェーズがあります。プライマリ爆風損傷の背後にあるメカニズムを解明するには、細胞や組織に直面するだろう本物の爆発イベントに露出されたときフリードランダー波などの波形を生成する実験モデルを作成されています。文献に記載されている現在のシステムは、ショック チューブ11,12,13,14,15,16,17、します。制御された環境で代替爆発イベントのレクリエーション、ホプキンソン圧力バー22高度なブラスト シミュレータ21Kolsky バー20barochambers18,1923はテトラ硝酸塩ペンタのエリスリトール。利用可能なモデルの広い範囲にかかわらず多くの変数を適用する前のストレスを含む爆発波および個々 のセル型または評価24の下の組織の機械的性質から得られる傷害に影響を与えます。一方、組織または臓器の研究組織の変形と爆発イベントの結果として持続的な総体の形態学的変化に光を当てることができます、細胞レベルでの解析は衝撃波によって影響を受け転写およびエピジェネティックな変化を検出できます。
この方法の記事では、衝撃波圧力の範囲内で生きている細胞単層を伝達する手法について説明します。衝撃波からの潜在的な損傷しきい値を解明、細胞生存率の即時の特性評価が可能になります。さらに、標準的な培養条件に実行可能なセルを返すことができる、爆発イベントから長期的生物学的影響を評価することができます。以下のプロトコルでは、培養細胞に使用することができます 2 つの細胞の生存率の技術について説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
図 1:フリードランダー波の近似します。(A) 無隔膜ショック ・ チューブの 3 センサーで観測されたフリードランダー波の近似。(B) 代表的なデータの衝撃波管の 3、2、1 のセンサーで観測された異なる圧力プロファイルを表示します。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>MEM&、ヌクレオシド</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>22571020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認証、米国原産</td><td>のサーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td>サプリメントで完全な増殖培地を作成します。</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15070-063</td><td>完全な成長培地を作成するためのサプリメント。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー15400-054</td><td>使用前に10分の1を希釈してください。</td></tr><tr><td>CytoOne T-75 フラスコ、TC 処理、通気付き</td><td>Starlab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>TC ディッシュ (PS) 35 mm、8.5 cm2</td><td>トリプル レッド</td><td>TCD010035</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ ディッシュ (PS) 90 x 14.2 mm 通気口なし</td><td>VWR UK</td><td>391-0453&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガス透過性粘着プレートシール</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Alamarblue 細胞生存率試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>13494309</td><td></td></tr><tr><td>Virkon 錠</td><td>VWR UK</td><td>115-0020</td><td>生存率制御試薬として 2% 溶液を作成するために使用します。</td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>SurgicalTools</td><td>11295-10</td><td>ペトリ皿からカバースリップを取り外すために使用します。</td></tr><tr><td>カバーガラス、正方形</td><td>VWR UK</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR UK</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、黒無垢</td><td>アップルトンウッズ</td><td>CC760</td><td>蛍光測定に使用するプレート。</td></tr><tr><td>96ウェルプレート、透明、(PS)</td><td>VWR UK</td><td>734-1799</td><td>吸光度測定に使用するプレート。</td></tr><tr><td>ライカ DMi1 カメラスタンド</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td>細胞培養用光学顕微鏡。</td></tr><tr><td>ZEISS PALM マイクロビームレーザーキャプチャ Microdisseciton</td> LIVE/DEADイメージングに使用される<td>Zeiss</td><td></td><td>Fluorescence microsopeです。</td></tr><tr><td>EnVisionマルチラベルリーダー</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010A</td><td>蛍光/吸光度の読み取りに使用するプレートリーダー。</td></tr><tr><td>マイラーエレクトリカル&化学絶縁フィルム、304 mm x 200 mm x 0.023 mm&nbsp;</td><td>RSコンポーネンツ</td><td>785-0782</td><td>ショックチューブダイアフラムの作成に使用します。</td></tr><tr><td>マイラーエレクトリカル&化学絶縁フィルム、304 mm x 200 mm x 0.05 mm&nbsp;</td><td>RSコンポーネンツ</td><td>785-0786</td>ショック<td>チューブダイアフラムを作成するために使用します。</td></tr><tr><td>マイラーエレクトリカル&化学絶縁フィルム、304 mm x 200 mm x 0.125 mm&nbsp;</td><td>RSコンポーネンツ</td><td>785-0798</td><td>ショックチューブダイアフラムの作成に使用します。</td></tr><tr><td>電流源パワーユニット</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td></td><td>4103C2300V1センサー用の電源。</td></tr><tr><td>IEPE圧力センサ</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>2300V1</td><td>ショックチューブに配置された圧力センサー。</td></tr><tr><td>デジタル・フォスファー・オシロスコープ</td><td>Tektronix</td><td>DPO 4104B</td><td>センサー2300V1データを収集し、保存するために使用します。</td></tr></tbody></table>

評価プライマリ ブラスト効果の in vitro

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

爆発イベントへの露出は肺、耳や脳など重要な臓器に重篤な外傷を引き起こす可能性が。現代の戦争とテロ関連の事件の爆発物の使用への最近の動向を考慮した非常に重要なはそのような爆発による傷害の背後にあるメカニズムを理解すること。爆発による傷害を完全に理解するに、制御された環境で再現可能な方法を使用してこのような爆発イベントを複製することはまずなりません。この手法は衝撃管装置を使用して、衝撃波圧力の範囲内では、2 D で成長して生きた細胞を伝播できるし、細胞のマーカーは酸化還元インジケーター試金とライブとデッド細胞の蛍光イメージングを使用してすぐに分析できます。このメソッドは、127 kpa ピーク爆発圧力の増加、大幅な低下がセル実行可能性未処理のコントロールと比較して刺激することを示した。テスト サンプルは付着性の細胞に限定されないが、細胞懸濁液を含めることができますショック チューブ セットアップするマイナーな修正によって、全身と組織のサンプル。組織や細胞が発生する本物の爆発イベントに露出されたとき厳密な条件を複製することは困難です。この記事で示す 1 つなどのテクニックは、損傷しきい値を定義し、衝撃波の暴露から生じる細胞内転写およびエピジェネティックな変化を識別に役立ちます。

上記の方法を使用して、単分子層で育った細胞衝撃波衝撃波管 (図 2 b) を使用して生成する 3 通で公開されていた。細胞のマーカーを評価しました。酸化還元インジケーター試金を使用して、127 kPa の衝撃波のアプリケーションだった文化 (図 3) で 24 時間後のコントロールと比較して毛乳頭細胞の生存率を大幅に削減することができることが分かった。衝撃波 ≤72 kPa の生存率は下がりませんでした。これらの観察をサポートするには、それぞれ、緑または赤の fluorophores が付いている生きているか死んでいる細胞を蛍光ラベリングできる蛍光イメージ分析を使用しました。生物あたり 13 蛍光画像からライブとデッド細胞の定量は、127 kPa 衝撃波制御 (図 4) と比較した場合に被曝者に細胞生存率の減少を示した。統計分析はテューキーの多重比較検定、p が続く一方通行 ANOVA を使用して行った &#60; 0.05 を有意と判断します。グループあたりのサンプル サイズは、酸化還元インジケーター試金のための 9 と定量的蛍光イメージング分析用 39 になりました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
図 3: 衝撃波暴露後の時間経過を示す酸化還元インジケーター アッセイ データ細胞生。大幅より少ないセルは 127 kPa 衝撃波暴露群と比較対照すると、24 時間後に観察されました。2% と 30 s の処置から成って陰性対照消毒は T0 で 24 h すべての他のグループと比較して大幅に少ない細胞を示した (材料の表を参照してください)。各バーが表す平均 ± 1 標準偏差 (SD);生物学的にレプリケート、N = 3;技術を複製する n = 3。p = &#60; 0.0001。* = p &#60; 0.05。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
図 4: 蛍光イメージング。(A) 24 h 後衝撃波露出で蛍光顕微鏡を使用してキャプチャしたライブとデッドの細胞の蛍光画像から収集された定量的データ。127 kPa 大幅少なく実行可能な細胞が観察された (意味 = 93.42) 47 kPa と比較して衝撃波にさらされたサンプル (意味 = 98.18)、72 kPa (意味 = 98.87) と対照群 (意味 = 99.10)。24 h 後陰性対照グループに実行可能なセル認められなかった (意味 = 0)。(B) 代表的な蛍光画像。グリーンは、赤は、死んだ細胞を示していますしながら生きているセルを示しています。各ボックス プロット テューキーひげ; と上部と下部四分位数を示しています。生物学的にレプリケート、N = 3;技術を複製する n = 13。p = &#60; 0.0001。スケールバー = 300 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

衝撃波への露出によって細胞を変調する方法を理解することは爆発イベントからトリガーの傷害の背後にあるメカニズムを識別するを助けることができます。このプロトコルは、細胞膜に圧力の範囲で衝撃波を適用して細胞生存率のそれ以降の効果を識別するために、特注の衝撃波管装置を使用します。

評価プライマリ ブラスト効果の in Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

本手法の全体的な目的は、爆発事象の際に発生しうる代表的な衝撃波を生成し、この機械的衝撃が培養中の初代細胞の生存率に及ぼす影響を評価することです。本手法は、衝撃波への曝露などの高エネルギー事象に対する、個々の細胞型の応答に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、組織や臓器レベルの応答ではなく、単一の衝撃波に対する個別の細胞応答を評価できることです。本手法の意義は、衝撃波への曝露によって引き起こされる一次爆風損傷の結果として変化した細胞メカニズムの特定にまで及びます。本手法では特定の関心細胞種を用いて実演していますが、任意の細胞を培養して試験系に配置することで、衝撃波に対する細胞特異的な応答を評価することが可能です。まず、目的の細胞株を標準的な培養条件下で、コンフルエンスが80%に達するまで培養します。次に、培地を吸引して除去します。PBSで細胞を2回洗浄し、Trypsin-EDTAを2 mL加えます。標準的な培養条件下で5分間インキュベートします。細胞がフラスコから十分に解離していることを簡潔に確認します。次に、トリプシンを中和させるためにFBSを含む培地4 mLをフラスコに加え、細胞を15 mLコニカルチューブに移します。200 ×gで4分間遠心分離し、細胞をペレット化します。次に、ペレットを剥がさないように注意しながら、上清をゆっくりと吸引します。そして、ペレットを5 mLの培地で再懸濁させます。ラベルを貼った35 mmディッシュ3枚を、90 mmディッシュの中に入れます。次に、各ディッシュに2 mLの培地を加え、それぞれに7万個の細胞を播種します。衝撃波に曝露させる前に、細胞を十分に接着させるため、一晩インキュベートします。衝撃波管の組み立てを開始する前に、安全靴や白衣を含む適切な個人用保護具を着用してください。まず、出口フランジの水平面にあるボルト穴に2本の位置決めバーを挿入します。次に、位置決めバーの端にニトリルゴム製のガスケットシートを配置し、出口フランジとex vivo器官培養装置（EVOCリグ）の間に挟み込みます。器具を位置決めバーに沿ってスライドさせ、EVOCリグをショックチューブの出口フランジに取り付けます。ペトリ皿を保持するセクションが底部に位置するように、正しく方向を合わせてください。次に、残りの穴に4本のM24ボルトとワッシャーを挿入し、EVOCリグと衝撃管が正しく整列していることを目視で確認しながら、ナットとボルトを対角線上の対称的な順序でしっかりと締め付けます。その後、圧力トランスデューサをEVOCリグに取り付け、センサーケーブルを使用して電流源に接続します。さらに、BNCケーブルを使用して電流源をオシロスコープに接続します。衝撃波管のすべての放出バルブと流量制御装置が閉じていることを確認してください。次に、内蔵の外部圧縮空気ラインを開き、圧力レギュレーターを手動で時計回りに回して、ソレノイドを2.5 barまで加圧します。圧縮空気シリンダーを開き、圧力レギュレーターをゆっくりと時計回りに回して、圧力を約15 barまで上げます。次に、厚さ0.125 mmのプラスチックシートを10 cm × 10 cmの正方形に切り出し、ダイアフラムを準備します。テープでハンドルを作成し、ダイアフラムの上下に固定します。これらを使用して、ダイアフラムをブリーチチャンバー横の前面小型フランジの隣に慎重に配置します。ブリーチを閉じる前に、ダイアフラムが真っ直ぐに、かつ正しく配置されていることを確認してください。その後、4本のM24ボルトとナットを用いて固定します。滅菌フード内で、35 mLペトリ皿の蓋を十分に覆える大きさに粘着性ガス透過膜を準備します。次に、3つの実験サンプルが入った90 mLペトリ皿をフード内に移します。皿の一つから培地を吸引し、2枚の膜セクションで覆い、膜と皿の縁との間に隙間なく密閉されていることを確認します。サンプルをEVOCリグに移動させ、ディッシュの上端が衝撃管の内底と一致するように固定具のベースに固定します。この時点で、イヤーマフ、保護メガネ、安全靴、および実験衣を着用してください。レギュレーターの流量制御ノブを時計回りに回して、衝撃管システムを加圧します。コントロールパネルの下部で、短時間の衝撃波を得るためのダブルブリーチインレットか、波形持続時間を延長するためのドライバーチューブインレットのいずれかを選択します。次に、DC電源とオシロスコープのスイッチを入れ、波形データの取得準備を整えます。続いて、コントロールチューブの充電中に他の研究者が入室しないよう通知するため、コントロールパネルの反対側の壁にあるスイッチを使用して安全灯を点灯させます。ソレノイド制御ボックスのスイッチを押し、ソレノイドを閉じます。次に、コントロールパネルのノブを反時計回りに回して流量制御をゆっくりと開き、圧縮室内の圧力を徐々に上昇させます。ダイアフラムの破裂圧力に達すると、ダイアフラムが破裂し、破裂音が聞こえます。この音が聞こえたら、すぐに流量制御ノブを閉じます。次に、ソレノイド制御ボックスのスイッチを切ってソレノイドを開き、安全灯を消灯します。細胞サンプルを滅菌フードへ移動させます。そこで、粘着性のガス透過性メンブレンを取り除き、ディッシュに2 mLの新鮮な増殖培地を満たします。2 mLの新鮮な増殖培地を補充した直後に、各実験用ディッシュに200 µLの酸化還元指示薬試薬を加えます。その後、ディッシュを標準的なインキュベーターに4時間移します。インキュベーション後、各ディッシュから100 µLずつ2つの分注量を、適切な96ウェルプレートに移します。蛍光プレートリーダーでプレートを読み取り、データをエクスポートして保存します。生細胞および死細胞の蛍光イメージングを行う場合は、あらかじめ35 mL培養プレート内のガラスカバースリップ上に細胞を播種しておく必要があります。衝撃波処理後、培地を吸引し、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、イメージングキットの生死判定試薬を100 µLずつ各サンプルに分注します。そして、細胞と試薬を室温で、遮光した状態で15分間インキュベートします。インキュベーション後、試薬を除去し、1 mLのPBSで細胞を1回洗浄します。精密ピンセットを用いて、35 mLディッシュからカバーガラスを慎重に取り出し、顕微鏡用ガラススライドの上に裏返して置きます。開口数0.25の5倍対物レンズを装着した蛍光顕微鏡を用いて、各サンプルの画像を撮影します。次に、画像解析ソフトを使用して、各画像から生存している緑色の細胞と死滅した赤色の細胞の数を手動または自動でカウントします。ここで説明する方法を用いて、単層で培養した細胞をショックチューブで発生させた衝撃波に曝露させました。ショックチューブ内のセンサーにより、チューブ沿いの異なる位置で観察される圧力プロファイルが表示されます。酸化還元指示アッセイを用いた結果、培養後24時間において、127 kPaの衝撃波を照射すると、対照群と比較して真皮乳頭細胞の生存率が有意に低下することが判明した。一方で、72 kPa以下の衝撃波照射では生存率の低下は見られなかった。これらの観察結果を裏付けるため、生死判定アッセイ（live dead assay）においても、127 kPaの衝撃波に曝露した細胞は、対照群と比較して細胞生存率が低下することが示された。この手法を習得すれば、1時間あたり60検体という速いペースで処理することが可能です。衝撃波管を使用して衝撃波を発生させることで、さまざまな一次爆風損傷を探索できます。これらは爆風肺から、体の軟部組織内に不適切に骨が形成される異所性骨化まで多岐にわたります。本手順を実施する際は、圧縮ガスや高エネルギー衝撃波を扱う際のリスクを念頭に置き、常に適切な安全ガイドラインに従うことが重要です。衝撃管に軽微な修正を加えることで、衝撃波を変化させることができます。これにより、異なる爆風シナリオを想定した、さまざまな圧力プロファイルや強度に対する細胞応答を評価することが可能になります。この手順に続き、次世代シーケンシングを行うことで、「衝撃波への曝露は細胞内の自然な刻印をどのように変化させるか」といったさらなる研究上の問いに対する答えを得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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