評価プライマリ ブラスト効果の in Vitro

この方法の全体的な目標は、ブラストイベント中に発生する可能性のある代表的な衝撃波を生成し、この機械的ショックが培養中の初代細胞の生存率に与える影響を評価することです。この方法は、衝撃波への曝露などの高エネルギーイベントに対する個々の細胞タイプの応答に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、組織や臓器レベルの応答とは対照的に、単一の衝撃波に対する異なる細胞応答を評価できることです。

この技術の意味するところは、衝撃波への曝露によって引き起こされる一次爆風損傷の結果として変化する細胞メカニズムの特定にまで及びます。この方法は、特定の関心のある細胞タイプで実証されていますが、任意の細胞を培養して試験装置内に配置し、衝撃波に対する細胞特異的な応答を評価することができます。まず、目的の細胞株を標準培養で80%コンフルエントに達するまで培養します。

次に、媒体を吸引します。細胞をPBSで2回洗浄し、2ミリリットルのトリプシン-EDTAを加えます。それらを標準的な培養条件で5分間インキュベートします。

細胞がフラスコから正常に解離したことを簡単に確認します。次に、トリプシンを中和し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移すために、4ミリリットルのFBS含有培地をフラスコに加えます。細胞を200倍gで4分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

次に、ペレットが外れないように注意しながら、上清をゆっくりと吸引します。そして、ペレットを5ミリリットルの媒体に再懸濁します。35ミリリットルのラベルが付いた3つの皿を90ミリリットルの皿の中に入れます。

次に、各皿に2ミリリットルの培地を加え、それぞれに7万個の細胞を播種します。細胞を衝撃波にさらす前に、細胞が十分に付着するように、細胞を一晩インキュベートします。ショックチューブの組み立てを開始する前に、スチール製のつま先の作業用ブーツや実験室用コートなど、適切な個人用保護具を着用してください。

まず、出口フランジの水平面にあるボルト穴に 2 本の整列バーを挿入します。次に、アライメントバーの端にニトリルゴムガスケットシートを置き、出口フランジとex vivo臓器培養装置の間に座るようにします。EVOCリグをショックチューブのアウトレットフランジに取り付けます。

ペトリ皿を保持するセクションがその基部に位置するように、正しい向きになっていることを確認してください。次に、残りの穴にM24ボルトとワッシャーを4本挿入し、EVOCリグとショックチューブがうまく揃ったことを目視で確認しながら、ナットとボルトを斜め対称に順番にしっかりと固定します。次に、圧力トランスデューサをEVOCリグに取り付け、センサーケーブルを使用して電流源に接続します。

さらに、BNCケーブルを使用して電流源をオシロスコープに接続します。ショックチューブのすべてのリリースバルブとフローコントロールが閉じていることを確認します。次に、内蔵の外部圧縮エアラインを開き、圧力レギュレーターを手動で時計回りに回して、ソレノイドを2.5バールまで充電します。

圧縮空気シリンダーを開き、圧力レギュレーターを時計回りにゆっくりと回して、圧力を約15バールに上げます。次に、厚さ0.125ミリリットルのプラスチックシートを10cm×10cm四方に切り出してダイヤフラムを準備します。テープでハンドルを作成し、ダイヤフラムの上部と下部に固定します。

それらを使用して、ブリーチチャンバーのそばのフロントの小さなフランジの隣にダイヤフラムを慎重に配置します。ブリーチを閉じる前に、ダイヤフラムがまっすぐで正しい位置にあることを確認してください。次に、4つのM24ボルトとナットを使用して所定の位置に固定します。

滅菌フードの内側には、35ミリリットルのシャーレ1枚の上部を覆うのに十分な大きさになるように、接着性ガス透過膜を準備します。次に、3つの実験サンプルが入った90ミリリットルのペトリ皿をフードに移します。皿の1つから培地を吸引し、2つの膜部分で覆い、膜と皿の端との間にしっかりと密閉されていることを確認します。

サンプルをEVOCリグに移し、ディッシュの上部がショックチューブの内側のベースと揃うように、フィクスチャのベースに固定します。この時点で、イヤーディフェンダー、アイゴーグル、安全ブーツ、白衣を装着します。レギュレーターのフローコントロールノブを時計回りに回して、ショックチューブシステムを加圧します。

コントロールパネルの下部で、短時間の衝撃波の場合はダブルブリーチインレット、波の持続時間が長くなる場合はドライバーチューブインレットのいずれかを選択します。次に、DC電源とオシロスコープの電源を入れて、波形データを要求します。次に、ショックチューブの充電中に他の研究者が部屋に入らないように他の研究者に通知するために、コントロールパネルの反対側の壁にあるスイッチを使用して安全ライトをオンにします。

ソレノイドコントロールボックスで、スイッチを押してソレノイドを閉じます。次に、コントロールパネルで、ノブを反時計回りに回してフローコントロールをゆっくりと開き、圧縮チャンバー内の圧力を徐々に上げます。ダイヤフラムの破裂圧力に達すると、ダイヤフラムが破裂し、バンという音が聞こえます。

このノイズが聞こえたら、フロー制御ノブをすばやく閉じます。次に、ソレノイドコントロールボックスのスイッチをオフにしてソレノイドを開き、安全ライトをオフにしてください。細胞サンプルを滅菌フードに移します。

そこで、接着剤のガス透過性メンブレンをはがし、2ミリリットルの新鮮な成長培地を皿に満たします。200マイクロリットルの酸化還元指示薬試薬を、2ミリリットルの新鮮な増殖培地を補充した直後に、各実験皿に加えます。次に、皿を標準的なインキュベーターに4時間移します。

インキュベーション後、各ディッシュから2つの100マイクロリットルアリコートを適切な96ウェルプレートに移します。蛍光プレートリーダーでプレートを読み取り、データをエクスポートして保存します。生細胞と死細胞の蛍光イメージングでは、細胞を最初に35ミリリットルの培養プレート内のガラスカバースリップに播種する必要があります。

衝撃波処理後、培地を吸引し、1ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、イメージングキットから100マイクロリットルの生死試薬を各サンプルに移します。そして、細胞と試薬を室温でインキュベートし、15分間光から保護します。

インキュベーション後、試薬を取り出し、1ミリリットルのPBSを使用して細胞を一度洗浄します。細い先端鉗子を使用して、35ミリリットルの皿からカバースリップを慎重に取り外し、ガラス顕微鏡スライドに伏せて置きます。開口数0.25の5倍対物レンズを搭載した蛍光顕微鏡を使用して、各サンプルの画像を取得します。

次に、画像解析ソフトウェアを使用して、各画像から生きた緑色の細胞と赤色の死細胞の数を手動または自動でカウントします。ここで述べた方法を用いて、単層で増殖させた細胞を、ショックチューブで発生した衝撃波に曝露した。ショックチューブ内のセンサーは、チューブに沿ったさまざまな場所で観察された圧力プロファイルを表示します。

酸化還元適応アッセイを用いて、127キロパスカルの衝撃波の適用により、培養24時間後の対照と比較して、毛乳頭細胞の生存率を大幅に低下させることができることがわかりました。衝撃波の72キロパスカル以下を適用しても、生存率は低下しなかった。これらの観察を裏付けるために、ライブデッドアッセイでは、対照群と比較して、127キロパスカルの衝撃波に曝露された人々の細胞生存率の低下も示されました。

一度習得すると、この手法は1時間あたり60サンプルの速度で迅速に迅速に行うことができます。ショックチューブは、衝撃波を発生させて、さまざまな一次爆風損傷を探索するために使用できます。これらは、芽球肺から異所性骨化(体の軟部組織内での骨の不適切な形成)まで多岐

この手順を試行する際は、圧縮ガスや高エネルギーの衝撃波を扱う際のリスクを覚えておくこと、そして常に正しい安全ガイドラインに従うことが重要です。ショックチューブのわずかな変更により、衝撃波を変更することができます。次に、さまざまな爆風シナリオを表すさまざまな圧力プロファイルと強度に対する細胞応答を評価できます。

この手順に続いて、次世代シーケンシングを実施して、衝撃波への曝露が細胞内の自然な刻印をどのように変化させるかなど、追加の研究課題に答えることができます。