Name: 2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の解析法。胚様体形成と免疫蛍光・免疫ブロッティングによるマーカー分析で、神経分化の遺伝子発現とタンパク質産生を追跡し、再生医療への応用に資する効率的なプロトコル開発に貢献します。

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マウス胚線維芽細胞の1文化（MEFの） <ol><li> MEF培地中、15％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）を、準備します。 </li><li>室温（RT）で30分間0.5％ゼラチン溶液でコート100ミリメートル細胞培養皿を。 </li><li>サイトメーターを使用したMEFを数えます。ゼラチン溶液を除去し、直ちに37℃に予め温めMEF培地を注ぎます。急速100mmのゼラチンコートディッシュあたり2.8×10 6のMEFを播種次いで、2分間37℃の水浴中でマイトマイシンC処理したMEFのバイアルを解凍します。他のサイズのお皿を使用している場合はそれに応じて細胞数を調整します。 37°C、5％CO 2で一晩のMEFをインキュベートします。 </li><li>翌日のメディアを変更します。 MEF層まで2-3日間培養が合流です。 </li></ol> 2.マウスESC文化<ol><li> 15％FBSおよび10を補充したESC培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を調製3 U / mlの白血病抑制因子（LIF）、0.1mMの非必須アミノ酸、55mMの2-メルカプトエタノール、ペニシリン（100U / ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mLの）、ゲンタマイシン（200μgの/ mL）に溶解し、0.2％マイコプラズマ抗生物質。 </li><li>ステップ1で調製した皿からMEF培地を除去し、37℃で予熱したESC培地で置き換えます。 </li><li> MEF層の上にESCバイアルおよび種子細胞を解凍。 ESCがコンフルエンスに達するまで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li> MEFののコンフルエントな単層を含む新しい細胞培養皿を準備します。通路へのESCは、PBSで1回洗浄し、37℃、5％CO 2で2-5分間0.25％トリプシン/ EDTAを用いて取り外します。剥離細胞を、15％FBSを含む新鮮なIMDMを添加することによりトリプシン処理を停止し、15 mLの試験管に細胞懸濁液を転送し、そして室温で5分間、160×gで遠心分離。 </li><li>上清を除去し、それぞれの新しいMEFで被覆された皿への細胞の新鮮なIMDM通路五分の一でのESCを再懸濁。細胞までインキュベート（通常4〜5日）の合流に達します。 </li></ol> 3.ゼラチンでコーティングされたプレート上のMEFと文化のESCを撤回<ol><li> ECSSは、ステップ2.4のように0.25％トリプシン/ EDTAを用いてそれらとのMEFを切り離し、コンフルエンスに達した新鮮なIMDM中で細胞を再懸濁し、非接着細菌ペトリ皿に移し、37℃、5％COで40分間インキュベート後2。 </li><li>注意深くESCを繰り返しピペッティングを回避5mLのピペットを用いて新たなゼラチンコートプレートにMEFを含有培地を移します。 ESCのが付着しないので、ペトリ皿に残った細胞は、MEFのです。 </li><li>パッセージのESC 3〜4日毎に。あまり頻繁に継代はESCの多能性を減らすことができます。それは差別を好むこととして、60％の密集度を超えないようにしてください。 </li><li> MEFのは確かのMEFが存在しないにするために、20Xの対物レンズを用い、細胞培養顕微鏡によってもはや検出されるまで繰り返して、必要に応じて、3.2から3.3まで3回以上のステップはありません。 </li><li> ESCをチェックすることにより、ESCの多能性を確認してください細胞は、典型的なESC多角形形態（ 図1A）との密なコロニーを形成するかどうかを確認するために培養。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）17によってテストセル幹細胞性、17をイムノブロッティング、またはコア多能性転写の免疫蛍光17（ 図2）の要因に依存します。 </li></ol> 4. EBの形成<ol><li> DMSO中10mMでのオールトランスRAのストック溶液を調製し、そして1.5 mLのアリコートに光保護微量遠心管。解決策は2週間まで-80℃で安定しています。光から保護します。 </li><li>ステップ2.4のようにトリプシン処理のESC;単一細胞懸濁液として、LIFを含まない新鮮なIMDMでreplate。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、0.5μMのRAを有するIMDM中、5×10 5細胞/ mLの懸濁液を調製します。 </li><li>プレート100 8チャンネルピペットを用いて100 mmのペトリ皿当たり20μL-滴200μLのヒント、反転食器、乾燥からぶら下がっ滴を防ぐために、PBSで反転蓋を埋めます。光からRA含有培地を保護します。 </li><li>ハンギング培養EBを、4日間、37℃、5％CO 2で低下します。 </li></ol> 5. 2D EB文化<ol><li> RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンでコーティング12ミリメートルの円形カバーガラス。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置き、そしてウェル当たり1 mLのIMDMを加えます。 </li><li>収穫3日成長ドロップEBを200μLピペットチップとの一つずつをぶら下げと同じピペットチップを使用して、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にウェル当たり20のEBSをそれらをシード。 注：彼らはカバースリップに良好に接着するので3日間のEBは、4日間のEB上で好ましいです。 </li><li> LIFなしIMDM-15％FBSと文化を続行します。 3〜4日毎に培地交換してください。必要に応じてタンパク質分泌分析のために用いられる培地を収集します。 </li></ol>分泌タンパク質の6の検出<ol><li> EBのメディの500μLを転送UMへの10kDaカットオフの遠心フィルタ、4°Cで60分間20,000×gでスピン。 </li><li>遠心フィルター内の過度の濃縮を防ぐために、すべての15-20分を残りのメディアを調べます。残りの培地の体積は25μlに低下したときに遠心分離を停止します。 </li><li>製造者の指示に従って、フィルタを反転し、4℃で160×gでスピンした後に残った濃縮培地を収集します。 </li><li>特異的抗体17を用いたイムノブロッティングによって分泌されるタンパク質を検出します。 </li></ol> 7. 3D EB文化<ol><li>ステップ5.2で説明したように懸滴中で4日間成長させたEBを収集し、そして1.5mLの遠心管（チューブ当たり30件のEB）に置きます。 </li><li> （ 材料/機器の表を参照）、3Dコラーゲン培養キットの説明書に従ってコラーゲンゲル溶液を調製します。コラーゲン溶液と5×DMEM（キット構成要素）の適切な量を希釈します。 n個を追加eutralization溶液（キット構成要素）と、すぐによく混ぜ、氷の上にこれを維持します。 </li><li> EBSを含む1.5mlチューブに冷却したコラーゲン溶液の適切な体積をピペット穏やか1mLのピペットチップを用いて、6ウェルプレートのウェルに移します。泡を作ることは避けてください。 </li><li>直ちにコラーゲンの重合を開始するために60分間、37°C​​、5％CO 2にプレートを転送します。 </li><li> IMDMでEBを含有するプレートを重ねます。 </li><li> 3〜4日毎に培地交換。 </li></ol> 8. EB解離<ol><li> 200μlのピペットチップを用いて、一枚ずつ（ステップ4から）4日目のEBを収集し、15％FBSを有する非接着性細菌ペトリ皿を含有するIMDMに転送します。さらに4日間、37℃、5％CO 2で培養。彼らは一番下に取り付けていないことを確認するために二回、毎日のEBを確認してください。穏やか底にEBの付着を防止するために、皿を振ります。 </li><li> 5分間遠心185×gでのEBで卓上遠心機でRT、。 </li><li>上清を除去します。ペレットは、各チューブに100μLを超えてはなりません。 </li><li> PBS中20％FBSを補充したIチューブ当たりコラゲナーゼEBを1mLの0.25％のタイプを、ペレット化するために追加。 </li><li> 、37°C​​、5％CO 2で1時間EB-コラゲナーゼ混合物をインキュベート1mLのピペットチップを使用して、穏やかに20分毎にそれをピペッティング。 </li><li> PBSで穏やかに3倍の細胞を洗浄。細胞凝集体が存在している場合は、それらを削除するには、100ミクロンのメッシュでセルストレーナーを使用しています。 </li><li> IMDMでゼラチン被覆の60mm皿に細胞をReplate。次いで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol>解離EBの9.トランスフェクション<ol><li> QRT-PCRおよび免疫ブロット法、0.5％ゼラチンでコート6ウェルプレートのために。 </li><li>免疫蛍光法、RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンで被覆ガラスカバースリップのために。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置きます。 IMDMを追加します。 </li><li>シード4.75×10 5または1×10 5 </SUP&gt;それぞれ、6-または24ウェルプレートにウェル当たりEB細胞（8.4から8.7ステップ）を解離しました。 </li><li>トランスフェクション前に70％コンフルエンスまで細胞を成長させます。 </li><li>製造業者の指示に従って、（ マテリアル/機器 の表を参照のこと）非リポソーム脂質幹細胞最適試薬17で細胞をトランスフェクトします。 注：我々が使用した試薬は、一般的には50％のトランスフェクション効率に達した（ 代表的な結果を参照してください）。 </li><li> QRT-PCRにより、または、それぞれ、17 2、3日、トランスフェクション後に免疫ブロット法によってサンプルを分析。 </li></ol>免疫蛍光によってEB分化の10分析<ol><li>洗浄2DのEBまたはPBSで解離3D EBを、室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定された細胞は浮遊細胞残屑を除去するためにPBSで3回洗浄します。 注：パラホルムアルデヒドは皮膚や眼への刺激性です。それを取り扱う際は注意してください。 </li&gt; <li>その後、RTで20分間、細胞を透過性PBSで3回洗浄するPBS中1％トリトンX-100を加えます。 </li><li> PBSを除去し、30分間PBS中5％BSAでブロックします。 </li><li> 1％BSA中の一次抗体希釈液を調製/ PBS、0.03％のトリトンX-100を補いました。一次抗体溶液によってブロッキング液を交換してください。 RTで3時間インキュベート、または4℃で一晩、次いで細胞をPBSで3回洗浄します。 </li><li>製造元の指示に従ってPBSで二次抗体を適用します。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、RTで1時間インキュベートします。 </li><li>マウントは、光学顕微鏡のための抗フェード媒体をガラススライド上にカバースリップ。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らは、競合や金融利害関係を持たない宣言します

このプロトコルでは、我々は、マウスESCの神経分化を研究するため、比較的簡単で、アクセス方法を提示します。以前のプロトコルでは、RA、または直ちにEBドロップ・アグリゲーション21を吊り下げた後に、それぞれ、2日目又はEBのハンギングドロップ8又は懸濁培養7によるの4日目に培地に添加しました。私たちが考案したプロトコルでは、RAは、以前に追加されました。懸濁培養によって形成されたEBにRAの初期の導入にもかかわらず、このプロトコルは、神経分化マーカー8のより高い発現を生じました。 ここでは、RAを適用し、ハンギングドロップ培養開始時に神経分化を誘導好みます。それらは単一細胞懸濁液中に残っている場合、この変更は、EB凝集前のESCに等しいRA露出を可能にします。 RAは、凝集のEBに追加されたときに、EB内塊中の細胞は、RA concentrati下部を感知する可能性があります外層中の細胞より上...

ESCは胚盤胞の内部細胞塊に由来します。彼らは起源の生物の任意の細胞型に分化する能力を持っている、すなわち、これらの細胞は、多能性があります。 ESC のin vitro分化は、発生経路とメカニズムを調べるための実験システムとして幅広い重要です。それは、細胞や組織の機能不全を補正するための新しい治療アプローチをテストするための強力かつ柔軟なモデルシステムを提供しています。 EBは、初期胚発生時の細胞分化の多くの側面を再現します。胚致死は難しい胚欠陥1,2の細胞の基礎を決定することができる場合、特に、EBを使用することができます。 EBを懸滴または液体懸濁液技術3のいずれかによって形成することができます。前者の利点は、このように、実験の再現性を容易に、一貫したサイズおよび密度のEBSを生成する能力です。 4の10種類によって認識される基底膜成分です。 RAは、神経分化5,6を誘導するビタミンAの小さな親油性代謝物です。 RAの高濃度は、神経遺伝子の発現を促進し、EB形成の7,8の間中胚葉遺伝子発現を抑制する。 RAは、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ9により最終製品にレチンアルデヒド酸化、続いてのいずれかでアルコールまたはレチノールデヒドロゲナーゼによってレチンアルデヒドへの酸化ビタミンAによって製造されます。神経分化は、細胞質からRAの輸送を必要とします<html>セルラRA結合タンパク質2（CRABP2）によって核へ。核内で、RAは、RAR-RXRヘテロ二量体10からなるその同族受容体複合体に結合します。これは、転写コアクチベーターの動員、および転写9、11の開始をもたらします。さらに、RAは、このようにBMPとSMAD 12シグナル伝達拮抗、リン酸化（活性）SMAD1の分解を促進します。これらの活動に加えて、RAは、Pax6の発現、神経分化13を支持する転写因子を増加させます。 RAシグナリングはサーチュイン1（SIRT1）、核ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD +）により変調される- CRABP2を脱アセチル化依存性酵素、核へのトランスロケーションを妨害し、したがってRAは、RAR-RXRヘテロダイマー14,15に結合すると、 16。 e_contentは&quot;&gt;ここで説明するRA処理したEBのプロトコルを設計する際の我々の目標は、神経前駆細胞へのESCの分化を調節するシグナル伝達経路のin vitroでの解析を容易にするために、神経分化を最適化することである。このプロトコルの利点の一つの促進であります免疫蛍光法による細胞機能の分析。3DのEBが十分な抗体が貫通し、画像に困難であるれていない。EB解離2D単層に特定の時点で神経分化中には、共焦点顕微鏡による細胞の免疫標識及びイメージングを容易にします。

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEFs</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>ESC フィーダー層</td></tr><tr><td>ESC</td><td>EMD Millipore</td><td>CMTI-2</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 (60 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>シャーレ (100mm)</td><td>コーニング351029</td><td></td><td>ハンギングドロップ</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>2D EBs</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>エッペンドルフ</td><td>30720113</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>ダーク 1.5 mL 遠心分離管</td><td>セルトリート・サイエンティフィック・プロダクツ</td><td>229437</td><td>RA ストック溶液</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-545-80</td><td>円形、直径12 mm</td></tr><tr><td>Superfrost-plus 顕微鏡スライド</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>3D collagen culture kit</td><td>EMD Millipore</td><td>ECM675</td><td>3D culture</td></tr><tr><td>Effectene Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301427</td><td>Stem cell transfection</td></tr><tr><td>Microcon&nbsp;遠心式フィルター (10 kDa)</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCPRT010</td><td>Protein concentration</td></tr><tr><td>Name&nbsp;</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ロンザ</td><td>12-709F</td><td>MEFs culture</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>ESCs 培養</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td>ESCs 培養</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625</td><td>ディッシュコーティング</td></tr><tr><td>LIF</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ8878-LF-025</td><td>ESCの多能性を維持するために</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 溶液</td><td>ギブコ</td><td>11140050</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ギブコ</td><td>21985023</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15750060</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>MycoZapPlus-PR</td><td>ロンザ</td><td>VZA-2022</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>神経分化誘導</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td>ブロッキングと抗体希釈&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>細胞膜透過</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold アンチフェード試薬 DAPI</td><td>Life Tech.</td><td>P36931</td><td>封入試薬</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>R&D Systems</td><td>1030-FN</td><td>ディッシュ コーティング</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>Worthington Biochem.Corp</td><td>LS004196</td><td>EB dissociation</td></tr><tr><td>名&nbsp;<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin (Rat-401)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-33677</td><td>神経分化の検出</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-5279</td><td>の検出神経分化</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-398A</td><td>神経分化の検出</td></tr><tr><td>Sox2</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3579</td><td>神経分化の検出</td></tr><tr><td>チューブリン b3 (AA10)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-80016</td><td>神経分化</td></tr><tr><td>の検出名前&nbsp;</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウス-Alexa555</td><td>Life Tech.</td><td>A31570</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスAlexa488&nbsp;</td><td>ライフテック。</td><td>A21202</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>名義&nbsp;</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>広視野顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス TS100</td><td>細胞培養イメージング</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>C2</td><td>免疫蛍光イメージング</td></tr></tbody></table>

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

（典型的には、日E3.5で）胚盤胞の内部塊から単離されたマウス胚性幹細胞（ESC）は、初期胚発生を研究するためのin vitroモデル系として使用することができます。白血病抑制因子（LIF）の非存在下で、ESCの神経前駆細胞にデフォルトで分化します。彼らが原因初期段階の胚との類似性に球状凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれる3次元（3D）に集めことができます。 EBは、それらが2次元（2D）の拡張を成長させることによって展開ここで、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、またはそれらは球状体として成長し続けると、3つの胚葉に分化する3次元コラーゲンマトリックスに埋め込むことができる：内胚葉、中胚葉、および外胚葉。 3Dコラーゲン文化がより密接に、2DのEBより生体内環境を模倣します。 2D EB培養物は、分化を追跡するために、免疫蛍光法およびイムノブロッティングによる分析を容易にします。私たちは、二段階の神経differentiaを開発しましたションプロトコル。第1のステップでは、EBを、ハンギングドロップ法によって生成され、そして、同時に、レチノイン酸（RA）への曝露によって分化するように誘導されます。第二工程において、RAの非存在下での2Dまたは3D形式の神経分化が進行します。

OCT4、Nanogの、およびSOX2は、ESCの自己再生および多能性を付与するコア転写因子です。我々は、野生型からとSYX、RhoAの特異交換因子SYXをコードする遺伝子は、破壊された遺伝子改変マウスの株からESCの神経分化を比較するために上記のプロトコルを適用しました。我々は、血管新生18でSYXを関与していました。 ESCは、および場合SYXの神経分化をテストするために進ん- - / -私たちは、EBの行動の違いはSYX + / +およびSYXから集約気づい/ -のESCは、彼らのSYX + / +対応のものよりも高速です。 SYX</e...

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

この手順の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞の神経分化における遺伝子およびタンパク質マーカーの発現と産生をそれぞれ分析することです。この手法により、DPAsの未精製状態が神経分化を抑制するメカニズムを解明することができ、治療目的で幹細胞をニューロンに分化させるためのより優れたプロトコルの策定につながります。この技術の主な利点は、光学顕微鏡による観察を含め、エメリンおよびタンパク質レベルで神経分化の過程を追跡できることです。本手順の実演は、私の研究室のリサーチアソシエイトであるJunning Yang博士が行います。まず、37 °C、5% CO2の条件下で、0.25% Trypsin-EDTAを用いて2〜5分間胚性幹細胞を回収し、胚様体形成を開始します。剥離した細胞に15% FBS含有の新鮮なIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）を加え、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。室温で160 x Gにて5分間遠心分離します。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントし、0.5 µMのレチノイン酸を含むIMDMを用いて、1 mLあたり5 x 10⁵個の細胞懸濁液を調製します。続いて、8チャンネルピペットと200 µLチップを使用し、100 mmペトリ皿1枚につき120 µLを滴下して播種します。ディッシュを反転させ、吊り滴が乾燥するのを防ぐために、反転させた蓋にPBSを満たします。37°C、5% CO2の条件下で3〜4日間培養します。3日間成長させた吊り滴胚様体を回収するために、200 µLのピペットチップを使用します。ピペットチップで胚様体を軽く触れ、24ウェルプレート内のフィブロネクチンコート済みカバーガラスに転移させます。2〜3日ごとに培地を交換してください。培地交換の際は、必要に応じてタンパク質分泌解析のために使用済みの培地を回収します。培地中の分泌タンパク質を検出するため、胚体様体培地 500 µL を分画分子量 10 kDa の遠心フィルターに移し、4 °C、20,000 x G で遠心分離します。過剰な濃縮を防ぐため、15～20分ごとに遠心フィルター内の残存培地量を確認してください。残存培地量が 25 µL に達した時点で遠心分離を停止します。フィルターを反転させ、4 °Cで160 x Gにて遠心分離し、その後、製造者の指示に従って残った濃縮培地を回収します。3D培養では、前述と同様に、ハンギングドロップ法で4日間培養した胚様体を200 µLピペットチップで回収します。30個の胚様体を1.5 mL遠心チューブに移し、適切な量のコラーゲン溶液と5X DMEMを希釈し、中和溶液を加えて直ちに十分に混合することで、コラーゲンゲル溶液を調製します。コラーゲンゲルを氷上に置きます。次に、適切な量の冷却したコラーゲン溶液を胚様体を含むチューブにピペットで加え、気泡が入らないように胚様体懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに静かにピペットで分注します。すぐにプレートを37 °C、5% CO2の条件下で60分間静置し、コラーゲンの重合を開始させます。60分後、胚様体を含むプレートにIMDMを重層させます。胚様体の解離のため、再度、4日間の吊り下げ滴法で形成した胚様体を200 µLピペットチップで回収します。今回は、15% FBS含有IMDMを入れた非接着性の細菌学用ペトリ皿に移し、37 °C、5% CO₂条件下でさらに4日間培養します。胚様体が底面に接着していないか、1日2回確認してください。胚様体の接着を防ぐため、ディッシュを静かに揺らします。4日後、胚様体を遠心チューブに移し、室温で185 x Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去します。ペレットの体積は100 µLを超えないようにしてください。次に、20% FBSを添加したPBS調製の0.25% I型コラゲナーゼ 1 mLを、胚様体の入ったチューブにピペットで加えます。混合物を37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。20分ごとに1 mLのピペットチップを用いて、懸濁液を穏やかにピペッティングしてください。インキュベーション後、細胞をPBSで3回穏やかに洗浄します。細胞凝集塊が存在する場合は、100 µmメッシュのセルストレーナーを使用してこれを除去します。細胞をIMDMを含むゼラチンコートしたカバーガラス上に播種し、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。2Dまたは分散させた3D胚様体をPBSで洗浄します。次に、4% パラホルムアルデヒドおよびPBSを用いて、室温で30分間固定します。固定した細胞をPBSで3回洗浄して浮遊している細胞残渣を除去した後、1% Triton X-100含有PBSを加え、室温で20分間細胞を透過処理します。前と同様に洗浄した後、最後の洗浄液を取り除き、5% BSA含有PBSで30分間ブロッキングします。インキュベーションの終了が近づいたら、0.03% Triton X-100を添加したPBS中の1% BSAで一次抗体希釈液を調製します。30分が経過したら、ブロッキング液を一次抗体溶液に交換します。室温で3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。洗浄後、PBSで希釈した二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。最後に、光学顕微鏡観察用に、抗退色剤を用いてカバーガラスをガラススライドに封入します。この画像は、ESCsから形成された胚様体からの芽の出現を示しており、GTPase RhoAを活性化するグアニン核酸交換因子をコードするSyx遺伝子の2コピーについて陽性となっています。この画像は3D培養6日後に撮影されたものです。SyxノックアウトESCから形成されたこの胚様体は、同期間の培養後、発芽の増加を示しています。ここでは、2D胚様体の端の位相差画像により、Syxノックアウト細胞はSyx野生型よりも速く増殖したことが示されています。これらの免疫蛍光画像は、赤色で示された神経分化マーカーのNestinが、Syx野生型の胚様体と比較して、6日間の2D6ノックアウト胚様体から展開した細胞においてより多く発現していたことを示しています。ここでは、13日間の3D6ノックアウト胚様体から解離させた細胞において、神経分化マーカーであるNestinおよびbeta III Tubulinが、Syx野生型の対照群よりも豊富であったことを免疫蛍光画像で示しています。胚様体の成長と分化に時間を要するため、これは時間のかかる手順となります。少なくとも8日間を要するだけでなく、場合によっては最大24日間まで分化を追跡します。この手順を行う際は、胚様体全体で分化速度を均一にするため、胚様体の直径を制限することが重要です。

analysis-retinoic-acid-induced-neural-differentiation-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

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レポーター細胞を共培養に用いたマウス胚細胞によるレチノイン酸産生の研究

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無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

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F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

学ぶマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の解析法。胚様体形成と免疫蛍光・免疫ブロッティングによるマーカー分析で、神経分化の遺伝子発現とタンパク質産生を追跡し、再生医療への応用に資する効率的なプロトコル開発に貢献します。

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

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