2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

この手順の全体的な目標は、マウス胚性幹細胞の神経分化の遺伝子とタンパク質マーカーの発現と産生をそれぞれ解析することです。この方法は、DPAの生の年齢による神経分化の阻害に関与するメカニズムを決定するのに役立ち、治療目的で幹細胞をニューロンに分化するためのより良いプロトコルにつながる可能性があります。この技術の主な利点は、光学顕微鏡法を含む、エメリンおよびタンパク質レベルでの神経分化のプロセスの追跡を容易にすることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるJunning Yang博士です。胚様体の形成は、0.25%トリプシンEDTAを含む胚性幹細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で2〜5分間採取することにより、胚様体形成を開始します。剥離細胞に15%FBSを添加した新しいIscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)を加え、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

160 x Gで室温で5分間遠心分離します。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、0.5マイクロモルのレチノイン酸を含むIMDM中の5 x 10〜5番目の細胞/ミリリットル懸濁液を調製します。次に、8チャンネルピペットと200マイクロリットルのチップを使用して、100ミリメートルのシャーレあたり120マイクロリットルの滴をプレートします。

皿をひっくり返し、逆さにした蓋にPBSを充填して、ぶら下がっている水滴が乾くのを防ぎます。摂氏37度、二酸化炭素5%で3〜4日間培養します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、3日間成長した吊り下げ式胚体を採取します。

ピペットチップで胚様体に触れ、24ウェルプレートのファイバーネクチンコーティングされたカバースリップに移します。2〜3日ごとに培養液を交換してください。培地を交換する場合は、必要に応じてタンパク質分泌分析に使用した培地を回収してください。

培地中の分泌されたタンパク質を検出するには、500マイクロリットルの胚様体培地を10キロダルトンのカットオフ遠心フィルターに移し、摂氏4度で20, 000 x Gで回転させます。遠心フィルター内に残っている媒体を15〜20分ごとに検査して、過度の濃縮を防ぎます。残りの培地の容量が25マイクロリットルに減少したら、遠心分離を停止します。

フィルターを反転させ、摂氏4度で160 x Gで回転させ、残りの濃縮媒体をメーカーの指示に従って回収します。3D培養では、以前と同様に、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、吊り下げ液として4日間成長した胚様体を採取します。30個の胚様体を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、適量のコラーゲン溶液と5倍のDMEMを希釈してコラーゲンゲル溶液を調製し、中和溶液を添加し、すぐによく混合します。

コラーゲンジェルを氷の上に置きます。次に、胚様体が入ったチューブに適量の冷却コラーゲン溶液をピペットで入れ、次に胚様体懸濁液を泡を作らずに6ウェルプレートのウェルに静かにピペットで入れます。すぐにプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に60分間移し、コラーゲン重合を開始します。

60分後、胚様体を含むプレートをIMDMで重ねます。胚様体の解離のために、200マイクロリットルのピペットチップで4日間の吊り下げ型胚様体を再度収集します。今回は、15%FBSのIMDMを含む非接着性の細菌学的ペトリ皿に移し、摂氏37度、二酸化炭素5%でさらに4日間培養します。

胚体が底に付着していないことを確認するために、毎日2回胚体をチェックします。胚様体の付着を防ぐために、皿を優しく振ってください。4日後、胚体を遠心チューブに移し、室温で5分間185 x Gで遠心分離します。

遠心分離後、上清を取り除きます。パレットの容量は100マイクロリットルを超えてはなりません。次に、PBS中の20%FBSを補充した0.25%I型コラゲナーゼを1ミリリットル、胚様体のチューブにピペットで移します。

混合物を摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。懸濁液は、20分ごとに1ミリリットルのピペットチップを使用して静かにピペットで固定します。インキュベーション後、PBSで細胞を3回やさしく洗浄します。

細胞凝集体が存在する場合は、100ミクロンメッシュのセルストレーナーを使用して細胞凝集体を除去します。ゼラチンでコーティングされたカバースリップに細胞をIMDMで播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。2Dまたは解離した3D胚様体をPBSで洗浄します。

次に、4%のパラホルムアルデヒドとPBSで室温で30分間固定します。固定細胞をPBSで3回洗浄して浮遊細胞の破片を除去した後、PBSに1%triton X-100を添加して細胞を室温で20分間透過化します。前回と同様に洗浄した後、最後の洗浄液を取り出し、PBS中の5%BSAで30分間ブロックします。

インキュベーションの終わりに向けて、0.03%トリトンX-100を添加したPBS中の1%BSA中の一次抗体希釈液を調製します。30分が経過したら、ブロッキング溶液を一次抗体溶液に交換してください。室温で3時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。

洗浄後、PBSに二次抗体を塗布し、室温で1時間インキュベートします。最後に、マウントカバーは、光学顕微鏡用の退色防止媒体を使用してスライドガラスに滑ります。この画像は、ESCから生成された胚様体からの発芽を示しており、GTPase RhoAを活性化するグアニン交換因子をコードするSyx遺伝子の2つのコピーに陽性です。

画像は6日後に3D培養で撮影されました。Syx KnockOut ESCから形成されたこの胚様体は、培養中の同時期以降に発芽が増加したことを示しています。ここでは、2D胚様体エッジの位相画像は、Syx野生型よりもSyx KnockOutsの方が細胞が速く増殖することを示しています。

これらの免疫蛍光画像は、神経分化マーカーであるネスチン(赤)が、Syx野生型対応物よりも6日間の2D6 KnockOut胚様体から増殖する細胞に多く存在していたことを示しています。ここで、免疫蛍光画像により、神経分化マーカーであるNestinとβIIIチューブリンは、13日間の3D6 KnockOut胚様体から解離した細胞において、Syx野生型からよりも多く存在していたことが示されています。これは、胚様体の成長と分化の期間が長いため、時間のかかる手順です。

少なくとも8日かかるだけでなく、場合によっては最大24日間で微分を追跡します。この手順を試みる際には、胚体に沿った同様の分化率を確保するために、胚様体径の生存率を制限することを覚えておくことが重要です。