Name: 生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ単分子FRETを用いた高精度分子間距離測定法。NMDA受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定し、構造モデル構築のための正確な距離情報を提供する革新的な手法です。

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VJとHSは、NIH R01 GM094246からVJへのサポートを承認します。 HSは、クレムソン大学創造的調査プログラムとクレムソン大学の光学材料科学技術技術センターからスタートアップ資金を受け取ります。このプロジェクトは、ガルフコーストコンソーシアムの学際的なバイオサイエンストレーニングのためのケックセンター（NIGMS助成金番号1 T32GM089657-05）と一般ヒト疾患の翻訳研究のためのシスラー基金研究奨学金によっても支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

すべての著者は、この記事の内容と競合する金銭的利益がないと宣言しています。

この研究では、PIE-MFD単分子FRET実験を使用して、高精度で粒子間距離を整列させ、較正し、測定するプロトコルが提示されている。すべての機器パラメータを慎重に較正することにより、測定距離の精度を高め、オングストロームの精度に達することができます。これを行うために、様々な多次元ヒストグラムを用いて、さらなる特徴付けのために集団を分析および同定する。測定されたサンプルの安定性を検証するために平均マクロ時間を使用して、供与体および受容体の光退色を補正し、化学量論的パラメータに基づいてFRET集団を選択することが可能である。しかしながら、受容体の光物理的特性は、標識の位置に応じて変化し得る。したがって、アクセプタ量子収率を適切に補正するために、 S PIE分布を使用することができる。ガンマ因子（χ）を決定するには、適切な光物理的特徴付けが必要であり、それは、他の補正事実（ 例えば、クロストークの場合は α、ドナーレーザーを用いたアクセプタ励起の場合はβ）を使用して、測定された眼間距離の精度を高めることができる。このアプローチは、2つの設計されたdsDNA標準試料を使...

構造生物学研究の基本的な目的は、生体分子機械の構造と機能との関係を解明することである。生体分子（ 例えば、タンパク質や核酸）の最初の視覚的印象は、1950年代にX線結晶構造解析1,2によって生じました。 X線結晶解析は、結晶充填によって制約される高分解能、静的構造情報を提供する。したがって、X線構造モデルの固有の不動性は、ほとんどの生物学的機能に影響を及ぼす因子である生体分子の動的性質を排除する3,4,5。核磁気共鳴（NMR） 6,7,8 は、水溶液中の構造モデルを分解することによって、この問題に対する代替の解決法を提供した。大きな利点NMRは、構造、力学、および機能3,4,5の間の内在的な関係を明確にするのに役立つ、生体分子および立体構造アンサンブルの固有の動的性質を回復する能力である。それにもかかわらず、NMRは、試料の大きさおよび試料の大量によって制限され、より大きなシステムのための複雑な標識方法を必要とする。したがって、構造生物学における代替法を開発することが急務である。 歴史的に、フォルスター共鳴エネルギー移動（FRET） 9は、FRETが低精度の距離測定を提供するという誤解のために、構造生物学において重要な役割を果たしていない。このプロトコールの目的は、FRETがナノメートルスケールでの距離を決定する能力を再考することであり、そのような距離は、生体分子の構造モデルを構築するために使用することができる。最初の実験的検証FRET効率に対するR - 6依存の変化は、様々な長さのポリプロリンを「分光学的定規（spectroscopic ruler）」として測定することにより、1967年にStryerによって行われた。同様の実験が2005年の単一分子レベルで達成された11 。ポリプロリン分子は理想的ではないことが判明したので、後で二本鎖DNA分子を使用した。これにより、正確な距離測定のためのウィンドウが開き、FRETを使用して生体分子の構造特性を同定するというアイデアが開かれました。 眼間距離範囲が〜0.6〜1.3 R 0である場合、FRETは最適である。ここで、R 0はフォルスター距離である。単一分子FRET実験に用いられる典型的なフルオロフォアについては、 R 0は約50Åである。典型的には、FRETは、他の方法よりも多くの利点を提供し、その構造および動態を（i）蛍光の究極の感度のために、単分子FRET実験13,14,15,16は、個々のメンバーの構造を直接的に計数し同時に特徴付けることにより、異種アンサンブルを分解することができる。 （ii）複雑な反応経路は、アンサンブルの同期化が必要ないため、単一分子FRET研究で直接解読することができる。 （iii）FRETは、10年以上にわたる幅広い時間的領域にアクセスし、生物学的に関連する様々なダイナミクスをカバーすることができる。 （iv）FRET実験は、 インビトロおよびインビボの任意の溶液条件で行うことができる。 FRETと蛍光顕微鏡との組み合わせは、生きた細胞の分子構造および相互作用の直接的な研究を可能にする15,16 、 </<html>高精度20であっても17 ° 、 18 ° 、 19 °である。 （v）FRETは、ほぼ任意のサイズの系（ 例えば、ポリプロリンオリゴマー21,22,23,24、Hsp90 25 、HIV逆転写酵素26 、およびリボソーム27 ）に適用することができる。 （vi）最後に、生体分子のすべての次元性を含む距離のネットワークを用いて、静的分子または動的分子18,28,29,30,31,32,33,34,36の構造モデルを導出することができる。ref &quot;&gt; 35,36,37。 したがって、単一分子FRET分光法を使用して、距離制限構造モデル26に使用するのに十分正確な距離を導出することができます。これは、8つの次元の蛍光情報（ すなわち、励起スペクトル、蛍光スペクトル、異方性、蛍光寿命、蛍光量子収率など）を利用するマルチパラメータ蛍光検出（MFD）28,38,39,40,41,42を利用することによって可能である。巨視的時間、蛍光強度、および蛍光体間の距離）を正確かつ正確に提供して、距離制限を提供する。さらに、パルスインターリーブド励起（PIE）は、MFD（PIE-MFD） 42を用いて、直接励起アクセプター蛍光をモニターし、1：1ドナー - アクセプター化学量論を含むサンプルから生じる単一分子事象を選択する。典型的なPIE-MFDセットアップは、共焦点顕微鏡本体に接続された2パルスインターリーブ励起レーザーを使用し、光子検出は、異なるスペクトル窓および偏光特性の4つの異なるチャネルに分割される。詳細は図1を参照してください。 FRETは、FRET結果26,30と一致する原子的様構造モデルを達成するために、計算方法とFRETを組み合わせなければならないことに注意することが重要です。現在の議定書の目標は、関連する方法論を踏襲して、FRETに由来する距離を有する構造モデルを構築することではない。しかしながら、これらのアプローチは、他の技術（ 例えば、小角X線散乱または電子常磁性共鳴）、統合的な構造生物学の分野を生み出す43,44,45,46。現在の目標は、構造生物学の定量的ツールとしてFRETの道を開くことです。一例として、この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）における3つの構造状態を同定した。最終的な目的は、前述の限界を克服し、測定距離を高精度で提供することによって生体分子の構造決定に使用される統合的方法の中でFRETをもたらすことである。

<table><tbody><tr><td>炭</td><td>メルクKGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-719C</td><td>サイズ:0.20&マイクロ;m</td></tr><tr><td>チャンバーカバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>155409</td><td>1.5ホウケイ酸ガラス、8ウェル</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>063014-9</td><td>サイズ:24 x 60-1.5</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>148859</td><td>ヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>フリーtween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>ポリソルベート20</td></tr><tr><td>アクセプターDNA鎖の10%溶液(高FRET)</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>178124895</td><td>5&acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>アクセプターDNA鎖(低FRET)</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>ズ 177956424</td><td>5&acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)ド</td></tr><tr><td>ナーDNA鎖</td><td>DNAテクノロジー</td>ズ<td>177951437</td><td>5&acute; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)DNA</td></tr><tr><td>鎖(FRETなし)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&acute; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>E6331000025</td><td>ネクサスグラディエント</td></tr><tr><td>アレクサフロー488 C5&nbsp;Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td>は、<td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>for culture of E. coli</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>100 & マイクロで使用。プラスミド選択を維持するための選択的LB培地中のg/mL最終濃度</td></tr><tr><td>Tetracyline&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>12.5 &micro で使用。ジスルフィド結合酸化を促進するためのOrigami B(DE3)株のゴア(フルタチオンレダクターゼ)変異を維持するための選択的LB培地中のg / mL最終濃度</td></tr>カナ<tr><td>マイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-515</td><td>およびマイクロで使用。ジスルフィド結合酸化を促進するためのB(DE3)染色中のtrxB(rhioredoxinレダクターゼ)変異を維持するための選択的LB培地中のg/mL最終濃度</td></tr><tr><td>Origami B(DE3)コンピテントセル</td><td>ミリポア</td><td>70837-3</td><td>ジスルフィド架橋を持つタンパク質の発現のためのコンピテントE.大腸菌細胞</td></tr><tr><td>イソプロピル-&β;-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>For induction of E. coli expression</td></tr><tr><td>HiTrap Chelating HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>Hisタグ付きタンパク質の大規模FPLC精製用</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Life Sciences</td><td>28406264</td><td>FPLC 機器</td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボ</td><td>132562</td><td>15 kD MWCO 24 mm フラット幅、10メートル/ロール</td></tr><tr><td>ダイクロイクス</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50ビームスプリッター偏光子</td><td>Qioptiq Linos&nbsp;</td><td>G33 5743 000</td><td>10 x 10 フィルム偏光子</td></tr><tr><td>グリーンパスフィルター</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m 直径 25 mm マウント</td></tr><tr><td>レッドパスフィルター</td><td></td><td>Chroma ET720/150m</td><td>ET720/150m 直径 25 mm マウント</td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度計</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 蛍光光度計</td><td>堀場</td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorohub TCSPCコントローラー</td><td>堀場製作所</td><td>Fluorohub-B</td><td>アンサンブル測定用TCSPCエレクトロニクス</td></tr><tr><td>NanoLED 485L</td><td>堀場製作所</td><td>485L</td><td>青色ダイオードレーザー</td></tr><tr><td>NanoLED 635L</td><td>堀場製作所</td><td>635L</td><td>赤色ダイオードレーザー</td></tr><tr><td>オリンパスIX73 顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX73P2F</td><td>顕微鏡フレーム</td></tr><tr><td>PMA 40 ハイブリッド検出器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>緑色検出に最適化</td></tr><tr><td>PMA 50 ハイブリッド検出器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>ed シフター感度に最適化</td></tr><tr><td>485 nm レーザー</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>640 nm レーザー</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Hydraharp 400 および TTTR 取得ソフトウェア</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>ピコ秒イベントタイマーと時間相関シングルフォトンカウティングユニットには、TTTR取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828とピ</td>コ秒パルス用の<td>SEPIAソフトウェアPicoQuant</td><td>910028</td><td>レーザードライバーが含まれ、SEPIAソフトウェアコントローラーが含まれています。</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>optiplex 7010</td><td>CPU:i7-3770 RAM:16GB</td></tr><tr><td>FRETポジショニングおよびスクリーニング(FPS)ソフトウェア</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>MFDスイートで利用可能なAccesibel Volume clacualtorが含まれています</td></tr> ハ<tr><td></td><td>インリッヒ・ハイネ http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html Univiesity</td><td></td><td>これには、BIFLソフトウェアパッケージParisが含まれています。マルチパラメータヒソトラムの視覚化のためのマルガリータ、および確率分布分析ソフトウェアが利用可能で http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td></tr></tbody></table>

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度fret

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

マルチパラメータ蛍光検出（MFD）モードにおいて、単分子レベルでのフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて高精度の眼間距離測定を行う方法に関するプロトコールをここに示す。 MFDは、光物理学的および実験的アーチファクトを減少させるために蛍光のすべての「次元」の使用を最大にし、剛性生体分子において〜1Åまでの精度での粒子間距離の測定を可能にする。この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインの3つの構造状態を同定し、リガンド結合時の受容体の活性化を説明した。既知の結晶学的構造を実験測定と比較すると、より動的な生体分子については3Å未満で合意した。生体分子の全次元をカバーする一組の距離制限を集めることにより、動的生体分子の構造モデルを提供することが可能になるes。

MFDセットアップ（レーザーライン：60μWで485nm、23μWで640nm、セクション5.1）を用いた典型的なsmFRET実験では、蛍光サンプルを低ピコモル濃度（10 -12 M = 1pM）に希釈し、サブナノ秒のレーザーパルスが励起分子を介して自由に拡散する標識分子を励起する共焦点顕微鏡で行う。典型的な共焦点体積は&lt;4フェムトリットル（fL）である。このような低濃度では、一度に一つの分子しか検出されない。標識された分子から放出された蛍光は、対物レンズを通して集められ、ピンホールを用いて空間的に濾過される。このステップは、有効な共焦点検出ボリュームを規定する。次に、信号は、2つ（またはそれ以上）の異なるスペクトルウインドウ（ 例えば、 「緑」および「赤」）で平行および垂直成分に分割される。各光子検出器チャネルは、次に、時間相関単一光子計数（TCSPC）電子機器のデータ登録（ 図1 ）。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

このプロトコルの全体的な目標は、F のマルチパラメーター蛍光検出を使用して高精度の色素間距離測定を行うことです。

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。...

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

シングルフルオロフォアはFIONAを使用して、ナノメートルの精度で定位させることができる。ここでFIONA技術の概要が報告され、そしてどのようにFIONA実験を実施する方法について説明する。...

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

TIRF顕微鏡を用いて大規模なドナー・アクセプターネットワークからsmFRETデータを取得するためのセットアップと実験手順を提示します。ベイズ推論ソフトウェアFast-NPSを使用したこれらの測定値の段階的な解析では、適応色素モデルの適用により、高解像度の構造情報が得られます。...

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

この研究は、原子分解能透過電子顕微鏡イメージングにおける原子位置追跡のワークフローを提示する。このワークフローは、オープンソースのMatlabアプリ(EASY-STEM)を使用して実行されます。...

電子顕微鏡によるピソメーク精度原子位置追跡

この記事では、オープンソースの安価なsmfBoxを使用して、スイッチオンからアライメント、フォーカス、データ収集と分析まで、個々の生体分子を自由に拡散して、個々の正確なFRET測定を行うためのステップバイステップの手順を説明します。...

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

時間分解された単一分子タンパク質誘導蛍光増強は、タンパク質の局所的な構造変化に敏感な蛍光分光性近接センサとして有用である。ここでは、より長い範囲のFRET定規を使用して測定した場合、球状に非構造化および不安定として知られているα-Synucleinの安定した局所的な立体構造を発見するために使用できることを示す。...

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。...

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

この研究は、標識部位の選択、色素の選択、取得、およびデータ分析を含むFRETマッピングの方法論を詳述している。この方法論は、タンパク質系における結合部位、立体構造変化、および動的運動を決定するのに有効であり、既存の3D構造情報と組み合わせて実行される場合に最も有用である。...

フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論

ここでは、共焦点顕微鏡モードで単一分子レベルでの時間分解蛍光異方性を使用して、生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究するためのプロトコルを紹介します。...

生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性

学ぶ単分子FRETを用いた高精度分子間距離測定法。NMDA受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定し、構造モデル構築のための正確な距離情報を提供する革新的な手法です。

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

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