光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色モドキTribolium castaneum胚

このプロトコルの全体的な目標は、Tribolium castaneum胚の発達を非常に長期間にわたって非侵襲的に観察することです。ライトシートベースの蛍光顕微鏡法は、初期の胚盤葉から筋肉運動の開始までの細胞移動と増殖パターンに対処する新興昆虫モデル生物Tribolium castaneumの形態形成関連の質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、胚が数日間観察された場合でも、光退色や光毒性などの重要な要素が最小限に抑えられることです。

アガロースカラムを使用して胚をサンプルチャンバーにマウントするには、まず1mmシリンジに蒸留水を満たし、小さなゴムホースを使用してシリンジをガラスキャピラリーに取り付けます。キャピラリーの半分を蒸留水で満たし、ペイントブラシを使用して胚をガラスキャピラリー開口部の内側に移し、キャピラリーを液体アガロースに突き刺し、アガロースの数マイクロリットルを胚と一緒にキャピラリーにゆっくりと引き込みます。胚が所定の位置にあるとき、胚の上下に数マイクロリットルのアガロースがあるはずです。

アガロースが固まったら、キャピラリーを約5ミリメートルの長さに短くします。残りのフラグメントはアガロースで完全に満たされ、胚は第2四分位数内で見つける必要があります。次に、ピン付きのスチールシリンダーをサンプルチャンバーに挿入し、ピンの上に毛細管片を貼り付けると、アガロースカラムは胚を含む毛細血管片の領域から数ミリメートル突き出ている必要があります。

アガロース半球を使用して胚をサンプルチャンバーに取り付けるには、まず200マイクロリットルの液体アガロースを1mmシリンジに引き込み、シリンジを使用して、パイプの上部から下部の開口部に半球が形成されるまで、鋼管にアガロースをサンプルチャンバーで満たします。アガロースが固まったら、ペイントブラシの先端で胚を拾い上げ、前端にアクセスできるように胚を再配置します。アガロース半球を液体アガロースに浸して半球を薄膜で覆い、胚の前端を直立させてアガロース半球の極に置きます。

鋼管を回し、必要に応じてブラシを使用して胚の位置を修正します。理想的には、胚表面の半分未満をアガロースで覆い、側面をできるだけ急勾配にする必要があります。胚の表面にアガロースが多すぎると、機械的な収縮とガスとイオンの交換の減少につながり、胚の生存率に劇的な影響を及ぼします。

次に、鋼管をサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。クモの巣ホルダーを使用して胚をサンプルチャンバーに取り付けるには、まずペイントブラシで胚を選択し、ペイントブラシを脇に置きます。次に、クモの巣ホルダーの長穴を5〜8マイクロリットルの液体アガロースで覆い、薄いアガロースフィルムだけが残るまでほとんどのアガロースを取り除きます。

胚をアガロースフィルムに置き、その位置を調整し、胚を長穴のx軸中心に慎重に移動させ、その細長い前後軸を長穴の細長い軸に合わせます。適用後10〜15秒以内に、つまりアガロースがまだ液体である間に、胚をアガロースフィルム上に置くようにしてください。次に、クモウェブホルダーをサンプルチャンバーにゆっくりと挿入し、励起光と発光を妨げないようにホルダーを配置します。

ライブイメージングアッセイでは、最初にタイムラプスを設定し、次に透過光モードで、胚をレーザーにさらすことなく、X軸とY軸に沿って胚を視野の中心に配置します。胚を360度90度回転させて、マウントプロセス中に発生した可能性のある損傷について組織を調べます。蛍光モードでは、各方向のZスタックを定義し、胚の前後に25〜50マイクロメートルの空間バッファーを追加し、Z間隔を定義します。

長期間のイメージングでは、サンプルチャンバーに十分なイメージングバッファーが充填されていることを確認し、サンプルチャンバーの開口部を覆ってください。次に、イメージングプロセスを開始し、すべての胚のすべてのチャネルのすべての方向に沿った正しい取得を監視します。イメージング期間の終了時に、サンプルホルダーをサンプルチャンバーから取り出し、胚をオブジェクトスライドに移します。

アガロースカラムを使用した場合は、鋭利な刃を使用して周囲のアガロースから胚を抽出します。アガロース半球を使用した場合は、平らな面を持つ半球をオブジェクトスライドに移します。クモの巣ホルダー法の場合は、ペイントブラシを使用して、アガロースフィルムから胚を優しく取り外します。

次に、幼虫が孵化するまで、標準条件下で飽和湿度雰囲気中で小さなガラス皿に胚を装填した物体スライドをインキュベートします。観察された胚のデータを処理するには、適切なイメージング解析ソフトウェアで目的のファイルを開き、必要に応じてZスタックを回転させて胚の前後軸をY軸に合わせます。ZスタックをX軸とY軸に沿ってクロップして、最小限の背景だけが残るようにしてから、各ZスタックのZ最大投影を計算します。

次に、トランスジェニックラインとイメージングモダリティに応じて、タイムスタックの適切な動的強度調整を行い、必要に応じて光退色や発現変動の植物相を補正します。α-tububblin one promoterの制御下でHistone 2B M-Emerald融合タンパク質を発現するトランスジェニックラインを使用して、胚バンドの収縮から背側閉鎖まで室温で66時間の胚発生が記録されました。このエンハンサートラップラインは、頭部付属器内のニューロンクラスターと、背側閉鎖中の巻石移動のダイナミクスを視覚化するために使用できます。

同じ導入遺伝子を運ぶがゲノム上の位置が異なる類似のトランスジェニック系統をイメージングすると、原腸陥入から生殖細胞帯伸長への移行の光学切片は、出現する生殖細胞帯の内部細胞配置を示しています。グリアブルートランスジェニック系統を使用すると、サンプル回転を介して複数の方向に沿ってZスタックを取得することで、腹側神経索に沿っておよび周囲のグリア細胞の再編成、および同じ胚の頭葉の背側の増殖ダイナミクスを観察できます。小さな蛍光色素は、細胞間構造の特異的な標識にも使用でき、肝硬変、後腹側肝硬変細胞、または漿膜窓閉鎖中に現れる漿膜羊膜胚帯組織三層などの特定の胚の特徴を強調することができます。

2色の蛍光色素染色により、同じ胚の2つの細胞間構造をさらに可視化することができます。例えば、アクチン細胞骨格や核膜などです。記録が終了したら、実験の品質管理のために胚を回収し、健康な肥沃な成体に育てることが重要です。

この手順は、Parental RNA Differenceなどの他の手法と組み合わせて、ノックダウンされた表現型を解析することができます。