Name: 光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色モドキTribolium castaneum胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶ光シート蛍光顕微鏡法によるTribolium castaneum胚の長期非侵襲的観察技術。3種類のマウント法と新規トランスジェニック系統を用いて、胚発生の形態形成と細胞動態を詳細に解析する方法です。

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私たちは、技術サポートのためのスヴェン・プラス感謝します。グリア青いトランスジェニックラインは、グレゴール・ブッチャー（ゲッティンゲン、ドイツ）から寄贈されました。研究は、ゲーテのBuchmann分子生命科学研究所（BMLS、ディレクターエンリコ・シュリーフ）でEHKSに一部付与された高分子複合体（CEF-MC、EXC 115、スピーカーボルカー・ドッツチ）用のメイン午​​前優秀フランクフルトのクラスタによって賄われていました理学部フランクフルトはドイツForschungsgemeinschaft（DFG）によってメインです。

著者は、開示することは何もありません。 著者の貢献 FSとEHKSは、研究を考案しました。 FSは、トランスジェニックAGOCラインを生成しました。光シートベースの蛍光イメージングは​​、FS及びSKによって行いました。 FSとEHKSはSKからの入力で原稿を書きました。

品質管理 ライブイメージングアッセイでは、準備と記録手順は、非侵襲的でなければならない、 すなわち観察中（コレクション、dechorionation、サンプルホルダーに取り付け）も統合されたエネルギー負荷を処理する機械的および化学的でもないが、試料の生存率に影響を与える必要があります。 WTの開発を特徴づける研究のために、それは胚が正常に取得され、記録処理を存続し、健康な成人に発展した実験からのみ利用データに推奨されます。大人は肥沃である必要があり、任意の形態学的収差を示してはならないし、その子孫も肥沃でなければなりません。特に長期のライブイメージングアッセイで生存率が低い、のための3つの主要な理由があります。 まず、胚の表面は、おそらくイオンとガス交換を妨げ、胚mechanを収縮ステップ7中アガロースで広範囲に覆われましたICALLY。影響を受けた胚は、初期胚発生中に画像化する場合は特に、一般的に、数時間のために目立たない開発突然逮捕し、迅速に蛍光シグナルを失います。クモ...

darklingのカブトムシ（ゴミムシダマシ科）の大ファミリーに属するコクヌストモドキTriboliumののcastaneumは 、農業と生命科学の中に長い歴史を持っており、果実はキイロショウジョウバエを飛ぶした後、第2最高の研究のモデル昆虫モデル生物です。最後の四十年の間に、それは、様々な理由のための胚の形態形成に、過去20年の間に、進化の発生生物学では、発生遺伝学における強力かつ人気のある昆虫のモデル生物になったと： ショウジョウバエとモドキTribolium両方がHolometabolaに属しているが、約300万年前に1、2、3、4分岐しました。 ショウジョウバエの胚発生は、一般に、高度に誘導されたとみなされているが、 モドキTriboliumは develのより祖先モードを示します昆虫種5、6、7、8、9のかなり大きい割合で発見されるopment。その口器とアンテナは胚10、11、12、13、14、15の間に既に出現すなわちまず、 モドキTriboliumは 、非インボリュートヘッドの開発を示します。第二に、 モドキTriboliumが短生殖発達の原理に従う、 すなわち、腹部のセグメントがgermband伸び16、17、18、19の間に後部成長ゾーンから連続的に添加されます。第三に、 モドキTriboliumが開発し、後に劣化します2胚体外膜は唯一の腹側に胚をカバー羊膜、および完全に20、21、22胚を包む漿膜を、 すなわち 。両方の膜は、非常に重要な形態形成23と同様に、微生物24、25、乾燥26に対して保護的な役割を果たしています。第四に、胎生開発脚は幼虫のライフステージの間に完全に機能していると蛹変態27、28、29、30、31時の大人の足のための原基としての役割を果たす。 それらの小さなサイズと控えめな要求に、研究室でモドキTriboliumの栽培は非常に簡単です。野生型の培養物（WT）株またはトランスジェニック系統は、典型的には約100~300成人から成り、フルグレイン小麦から成る増殖培地で3〜4センチ高い（約50g充填した1リットルのガラス瓶（フットプリント80センチメートル2））内に維持することができます小麦粉は非アクティブ乾燥酵母を補いました。水の供給は不要です。これは、小規模または中規模の市販の昆虫インキュベーター内甲虫培養物の多数を維持するために小さな研究所を可能にします。 モドキTriboliumの後の発生段階（幼虫後約第四齢、蛹及び成虫）を容易にふるい分けすることにより成長培地から分離されます。同期胚は産卵中に短い期間の成人をインキュベートすることによって得られます。在庫管理は、典型的には22〜25°C（世代あたり約10週間）で行っている間に急速な発展のために、甲虫の培養物を、32°C（世代あたり約4週間）に保たれています。 最後の10年以内に、多くの標準テック新興モデル生物ブック32にまとめたようhniquesは徐々に、 モドキTriboliumに適応され、最適化されています。非常に重要で、このような胚33、幼虫34、35または親36、37 RNA干渉に基づく遺伝子ノックダウン、 のpiggyBac 38、39又はミノス 40トランスポザーゼシステムおよびCRISPR / Cas9ベースゲノムのいずれかと生殖細胞系変換などの高度な遺伝学的方法でありますエンジニアリング41。また、 モドキTriboliumゲノムは、42十年ほど前に配列決定されており、効率的かつゲノムワイドな同定及び遺伝子44の系統的な分析を可能にするゲノムの第三ラウンドアセンブリ43を解放し 、中であります</sアップ&gt;または他の遺伝的要素45、46。また、他の4つの鞘翅目の種のゲノムは、比較遺伝的アプローチ47、48、49、50のために用意されています。配列決定ゲノムとの関連では、二つの大規模な遺伝子分析は、挿入突然変異誘発画面51、画面52、53をノックダウン系統的RNA干渉ベースの遺伝子、すなわち 、実行されています。 広視野共焦点または光シートベース顕微鏡（LSFM）と蛍光ライブイメージングは、多次元コンテキスト（ 表1）に（ すなわち、形態形成）時間の関数としてモドキTriboliumの胚の形態を観察することができます。広視野と共焦点蛍光顕微鏡では、excitエーション発光光が同じ対物レンズを介して導かれます。両方のアプローチにおいて、試料全体がすべて記録された2次元平面のために照射されます。したがって、試料は、非常に高いエネルギーレベルに供されます。 LSFMにおいて、焦点面における唯一のフルオロフォアは、2枚の垂直に配置された対物レンズ（ 図1）を用いて照明および検出の分離に励起されます。単一平面照明顕微鏡（SPIM）とデジタル走査されたレーザ光のシートベースの蛍光顕微鏡（DSLM、 図2） - - LSFMは、二つのカノン実装で来て、従来のアプローチに比べていくつかの重要な利点を提供する：（I）固有の光学セクショニング能力（ii）は、良好な距離分解能、（iii）の光退色を強く減少したレベル、（IV）、非常に低い光毒性、（V）高い信号対雑音比、（VI）、比較的高い取得速度、（VII）イメージング複数の方向および（vi沿って低い開口数の照明対物レンズ54、55、56の使用へII）より深い組織浸透。 LSFMはすでに正常ほぼ全胚の形態形成57を文書化すると背側の閉鎖23の先頭に胚体外膜の破裂の原則を分析するためモドキTriboliumに適用されています。一般的にモドキTriboliumコミュニティで昆虫科学のためLSFMの魅力を高めるために、それは標準的な操作手順を確立し、方法、プロトコルおよび顕微鏡は、使いやすさのとなりのレベルにリソースのプールを改善するために非常に重要です発生生物学研究所での標準的なツールを-use、および生物学的な質問は注目の的に滞在。 このプロトコルはモドキTriboliumの基礎から始まります&lt;/ em&gt;の栽培、 すなわちメンテナンス、生殖および胚のコレクション。次に、2つの実験戦略が示されている：（I）カスタムメイドのトランスジェニック系統のライブイメージングおよび蛍光色素（ 表2）を用いて染色した固定された胚の（ii）のイメージング。その後、わずかに異なる目的を持つ3つの取り付け技術は、（ 図3および表3）について詳細に説明する：（I）アガロースカラム、（ii）のアガロース半球および（iii）新規クモの巣ホルダ。プロトコルは、LSFMとデータ取得手順を説明します。イメージングモダリティとキーの考慮事項が概説されています。最後に、胚の検索について説明すると、基本的なデータ処理のための提案が提供されます。代表的な結果で、よりライブイメージングデータを2つの新規カスタムメイドおよびグリアブルー58個のトランスジェニック系が示されており、それぞれの撮像データセットをダウンロード可能なリソースとして提供されます。また、画像蛍光色素の様々な染色された固定胚のデータが提示されています。議論は、品質管理、ライブイメージングアプローチの現在の制限および他の種へのプロトコルの適応に焦点を当てています。 プロトコルは、試料室及び典型的には、直径を有する金属、プラスチックまたはガラス製の円筒状の要素である標準化された試料ホルダ54、59、60、のための回転可能なクランプ機構が装備されている光シートベースの蛍光顕微鏡用に書かれていますミリの範囲です。プロトコルはまた、両方のカノン実装、 すなわち SPIMとDSLM、ならびに二つ以上の照明および検出腕61、62、63とのセットアップのために適しています。代表的な結果は、2つのスペクトル・チャネルのデータを示し、緑色（IL488nmレーザー、50分の525バンドパスフィルタを介して検出）および561 nmレーザーと赤色（照明、70分の607バンドパスフィルタを介して検出）を有する部分の光量が、プロトコルは、3つのまたは4つのスペクトル・チャネルに拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>全粒小麦粉</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E + 08</td><td>US:全粒粉、UK:全粒</td></tr>粉<tr><td>405上質な小麦粉</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E + 08</td><td>米国:ペストリー粉、英国:軟粉</td></tr>不<tr><td>活性ドライイースト</td><td>Flystuff / Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝セイン(PBS)、pH 7.4</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム、~12% 活性 Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>425044-250ML</td><td>注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です</td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス <td>カールロス</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Orange Scientific</td><td>4430300</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー、内部 & Oslash; 0.46 mm</td><td>Brand GmbH + Co KG</td><td>7087 09</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>57020</td><td>染色液の調製は表 2 で説明されています</td></tr><tr><td>ヨウ化物 YOYO-1 ヨウ化物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Y3601</td><td>染色液の調製は表2で説明</td></tr>されています <tr><td>BOBO-3 ヨウ化物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B3586</td><td>染色液の調製は表2で説明されています</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12379</td><td>染色液の調製は表2で説明</td></tr>されています <tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A22283</td><td>染色溶液の調製は、表2</td></tr><tr><td>ふるい、800&microで説明されています。mメッシュサイズ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-051</td><td></td></tr><tr><td>ふるい、710&micro;mメッシュサイズ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-050</td><td>成長培地調製(ステップ1.1)</td></tr><tr><td>ふるい、300&micro;mメッシュサイズ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-040</td><td></td></tr><tr><td>ふるい、250&micro;mメッシュサイズ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-038</td><td>産卵培地調製用(ステップ1.2)</td></tr><tr><td>ガラス皿、およびOslash; 100 mm&times; 20 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165102</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー、100 & マイクロ;m メッシュサイズ</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ、ヘッド & Oslash; 2 mm</td><td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1.0 mL</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1152-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>注意:パラホルムアルデヒドは有毒で腐食性があります</td></tr><tr><td>n-ヘプタン &Ge;99%</td><td>Carl Roth</td><td>8654.1</td><td>注意:n-ヘプタンは可燃性で有毒です</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>注意:Trition X-100は腐食性です</td></tr></tbody></table>

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキtribolium castaneum</em&gt;胚

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

コクヌストモドキTriboliumののcastaneumは、発生遺伝学と進化の発生生物学における重要な昆虫モデル生物となっています。光シートベースの蛍光顕微鏡とモドキTribolium胚の観察は、従来の広視野および共焦点蛍光顕微鏡を介して複数の利点を有します。光シートベース顕微鏡のユニークな特性のために、生きた標本の3次元画像は、高信号対雑音比で記録することができ、大幅にいくつかの持続期間にわたって光退色ならびに複数の方向に沿って光毒性を減少させ日々。以上の4方法論開発の年とデータの継続的な増加に伴い、時間がモドキTriboliumコミュニティでだけでなく、大規模で昆虫コミュニティに光シートの技術の利用のための標準的な操作手順を確立することが適切と思われます。このプロトコルは、適切なF 3つの取り付け技術を説明しますまたは異なる目的、長期的なライブイメージングに適した2つの新規カスタムメイドトランスジェニックモドキTriboliumラインを提示し、固定胚の細胞内構造を標識するのに5つの蛍光色素を示唆して記録されたデータのタイムリーな評価のためのデータの後処理についての情報を提供します。代表的な結果は、長期ライブイメージング、光学セクショニングおよび複数の方向に沿って同じ胚の観察に集中します。それぞれのデータセットは、ダウンロード資源として提供されています。最後に、プロトコルは、ライブイメージングアッセイ、電流制限および他の昆虫種に概説した手順を適用するための品質管理について説明します。 このプロトコルは、主に標準的な実験設備をアウトパフォームイメージングソリューションを模索発達生物学者を対象としています。これは、開発し、ミクロスを絞り込む技術志向の研究室/コミュニティ間のギャップを埋めるために継続的な試みを促進します方法論的にコピーして、技術的な課題への「プラグ・アンド・プレイのソリューションを必要とする生命科学研究所/コミュニティ。さらに、それは注目の的に生物学的な質問を移動公理的アプローチをサポートしています。

このプロトコルは、生活の蛍光イメージング又はLSFMで固定し、染色しモドキTribolium胚の実験の枠組みを記載しています。光退色及び光毒性の低いレベルに、その光学切片機能の直接の結果は、LSFMは長期的なライブイメージングのために特に適しています。 新規AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald}＃1トランスジェニックラインは、α-チューブリン1プロモーター74の制御下histone2B-mEmerald融合タンパク質を発現します。蛍光シグナルは、主に漿膜、卵黄嚢およびいくつかの神経細胞塊から得られるので、それは、エンハンサートラップのような発現パターン51を示しています。この行を使用して、室温（23±1℃）で、胚発生の66時間はgermband引込み及び背側閉鎖（補足映画1）を覆う、記録しました。このライ...

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

本プロトコルの全体的な目的は、コククズン（Tribolium castaneum）の胚の発育を、極めて長期間にわたって非侵襲的に観察することです。ライトシート蛍光顕微鏡を用いることで、初期原胚から筋肉の運動が始まるまでにおける細胞の遊走および増殖パターンを解析し、新興の昆虫モデル生物であるTribolium castaneumの形態形成に関する課題を解決することが可能になります。本手法の最大の利点は、胚を数日間にわたって観察する場合でも、光退色や光毒性などの決定的な要因を最小限に抑えられる点にあります。アガロースカラムを用いて胚をサンプルチャンバーに固定するには、まず1 mmのシリンジに蒸留水を満たし、小さなゴムホースを使用してシリンジをガラスキャピラリーに接続します。キャピラリーの半分まで蒸留水を満たし、次に絵筆を用いて胚をガラスキャピラリー開口部の内側に移動させ、キャピラリーを液体アガロースの中に挿入し、胚とともに数µLのアガロースをゆっくりとキャピラリー内に吸い込みます。胚が適切な位置に配置されたとき、胚の上下に数µLのアガロースが存在している必要があります。アガロースが凝固したら、キャピラリーを約5 mmの長さに短く切断します。残った断片の中はアガロースで完全に満たされており、胚が第2四分位にあることを確認してください。次に、ピン付きのスチールシリンダーをサンプルチャンバーに挿入し、キャピラリーの断片をピンの上に固定します。アガロースカラムは、胚が含まれているキャピラリー断片の領域から数ミリメートル突出させてください。アガロース半球を用いて胚をサンプルチャンバーに固定するには、まず1 mmのシリンジに液状アガロースを200 µL吸引し、そのシリンジを用いて、底部の開口部に半球状に溜まるまで、サンプルチャンバーを備えたスチールパイプの上部からアガロースを満たします。アガロースが凝固したら、絵筆の先で胚を拾い上げ、前端が操作しやすい向きに調整します。アガロース半球を液状アガロースに浸して半球を薄い膜で覆い、アガロース半球の頂点に胚の前端を上にした状態で配置します。スチールパイプを回し、必要に応じてブラシを使用して胚の位置を調整します。理想的には、胚の表面の半分未満がアガロースで覆われ、側面が可能な限り急峻であるようにします。胚の表面にアガロースが多くつきすぎると、機械的な圧迫が生じ、ガスやイオンの交換が減少するため、胚の生存率に劇的な影響を及ぼします。その後、スチールパイプをサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。Cobweb Holderを用いて胚をサンプルチャンバーに固定するには、まずペイントブラシで胚を選択し、ペイントブラシを脇に置きます。次に、cobweb holderのスロット穴を5〜8 µLの液体アガロースで覆い、薄いアガロース膜だけが残る

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Developmental Biology

発生生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

この記事では、ライトシート蛍光顕微鏡のサンプル調製について説明します。また、ゼブラフィッシュの生きた胚を長時間イメージングする方法も示しており、これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録することができます。...

ライトシート顕微鏡サンプル調製:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウント

Source: Liau, E. S. et al. マウス胚における運動軸索ナビゲーションの可視化とマウス胚における軸索樹状化の定量化 J. Vis. Exp. (2018).

ライトシート蛍光顕微鏡による運動ニューロンの投射と軸索分岐の可視化

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。...

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。...

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション...

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM)...

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。...

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

学ぶ光シート蛍光顕微鏡法によるTribolium castaneum胚の長期非侵襲的観察技術。3種類のマウント法と新規トランスジェニック系統を用いて、胚発生の形態形成と細胞動態を詳細に解析する方法です。

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