生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

本手順の全体的な目的は、サイドポピュレーション細胞の染料排出能に基づいて、生物学的試料中の推定がん幹細胞集団を検出することです。本手法は、生物学的試料からがん幹細胞を検出および精製するための信頼性の高い手段という、がん幹細胞研究における重要な課題に対処するものです。本技術の主な利点は、機能的マーカーを利用するため、より高い解像度が得られる点にあります。

さらに、これらのABC薬剤輸送体の発現はがん幹細胞間で高度に保存されているため、この手法を多くの異なるがん疾患に適用することが可能です。本手法は、高度に精製されたがん細胞における遺伝子発現プロファイリングや標的バリデーションなどのダウンストリーム解析を容易にするため、抗がん幹細胞治療薬の探索への応用が期待されます。したがって、本手法はがん幹細胞の特性に関する知見を提供することができます。

また、この方法を用いて、骨髄などの ABC ドラッグトランスポーターを発現する細胞集団を含むシステムを特性評価することも可能です。以下、私の研究室の技術者である Elisabeth Hoflehner が手順を実演します。まず、目的のヒトがん細胞株を、10% FBS、2 mM L-glutamine、および抗生物質を添加した 10 ～ 30 mL の RPMI 1640 培地を用い、37 °C で培養します。

細胞が約70〜90%コンフルエントに達したら、培地を除去し、0.05% trypsine-EDTAを2 mL加えて細胞を培養皿の表面から剥離させます。次に、10 mLの培養培地で細胞を洗浄し、懸濁液を清潔な15 mLチューブに移し、4 °Cで250 ×gにて5分間遠心分離します。細胞がペレット状になったら、上清を捨て、ペレットを1 mLの培養培地で再懸濁します。

細胞懸濁液の少量分注液をトリパンブルー溶液と混合し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。テストサンプルを調製するために、細胞を新鮮な培地で懸濁し、1 × 10⁶ cells/mLの細胞懸濁液を作成します。細胞密度を調整後、サンプルの3 mLを「test」と表記した15 mLラウンド底チューブに移します。

次に、サンプルに10 µMのバイオレット色素を加え、懸濁液を穏やかにボルテックスします。続いて、色素を含む細胞懸濁液500 µLを「control」とラベルした2本のフローサイトメトリー用チューブに分注し、阻害コントロールを調製します。そのうちの1本に50 µMのVerapamilを加えます。

2番目のチューブに20 µMのFumitremorgin Cを加え、ピぺッティングにより穏やかに溶液を混合します。すべてのチューブをキャップで密閉し、37 °Cの暗所で90分間インキュベートします。

15分ごとにサンプルを緩やかに攪拌します。染色の完了後、阻害コントロールを3〜4 mLの氷冷PBSで洗浄します。続いて、テストサンプルを分注し、抗体による共染色に備えます。

これらの分注液も同様に洗浄し、細胞凝集塊を除去するために、すべてのサンプルを70 micronのカットオフストレーナーでろ過します。その後、懸濁液を4 °C、250 ×gで5分間遠心分離します。得られたペレットを100 µLのPBSで再懸濁した後、細胞を遮光して氷上で保持します。

次に、バイオレット染料で事前染色した細胞に、適切なフルオロクロム標識抗体パネルを添加します。懸濁液をボルテックスし、4°Cの暗所で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、3〜4 mLの氷冷PBSで細胞を洗浄し、必要に応じてサンプルをろ過します。

その後、4 °Cで250 ×gにて5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を100 µLのPBSで再懸濁します。最後に、バイオレット染料で事前染色した細胞に7-AADを添加します。

サンプルを暗所で5〜10分間インキュベートします。フローサイトメーターを用いて細胞を解析するために、FSC SSCドットプロット上で適切な細胞集団をゲートします。次に、異なるFSCシグナルを用いて、選択した集団からすべての細胞凝集塊を除外します。

生存細胞の集団を得るため、7-AAD染色陽性の細胞を除外します。青色および赤色色素の放出に関するドットプロットを作成するには、y軸に青色蛍光チャンネル、x軸に赤色蛍光チャンネルを表示させます。両方のチャンネルをリニアモードに切り替え、サイドポピュレーション（side population）がプロットの左下に位置するように検出器の電圧を調整します。

次に、サイドポピュレーションをゲートします。そして、データ収集を停止します。続いて、阻害コントロールをロードし、データを収集します。

最後に、x軸にバイオレット染料の赤色蛍光を、y軸に適切な蛍光チャンネルを対数モードでプロットしたドットプロットを作成します。サンプルをロードし、検出器の電圧を適切に調整して、調査対象の表面マーカーを発現しているサイドポピュレーション細胞の割合を特定します。その後、データを記録してください。

ここでは、ヒト卵巣がん細胞において実施されたサイドポピュレーション分析の代表的な結果を示します。青色および赤紫色発光の分析によって区別されたサイドポピュレーションは、ドットプロットの左下象限に同定され、分析した全集団の0.70%を占めていました。その後、エフルックス阻害剤（排出阻害剤）を使用したところ、 previously identified cells（以前に同定された細胞）で観察された蛍光シグナルが消失し、これらの細胞がサイドポピュレーションの表現型を持つことが確認されました。

最後に、ヒト卵巣細胞についてABCG2の発現を評価しました。同定されたサイドポピュレーションに相当する0.67%の細胞にABCG2の陽性染色が観察されました。この手順に習熟し、適切に実施すれば、約2〜3時間で完了させることができます。

この手順を試みる際は、サイドポピュレーション（side population）の表現型が、染料濃度と細胞密度の比率の最適化に厳格に依存することを留意することが重要です。したがって、実験前に両方の変数を十分に検証することを強く推奨します。本手順の後、遺伝子発現プロファイリングなどの他の手法を実施することで、サイドポピュレーション細胞をさらに特性解析し、将来的な薬剤開発に向けた新規のがん幹細胞特異的な標的を同定することが可能です。

本技術の開発により、幹細胞生物学分野の研究者が、マウスおよびヒトの両方において組織幹細胞およびがん幹細胞の特性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、バイオレット染料によるトリガーを用いたサイドポピュレーション（SP）解析の実施方法、およびご自身の研究室で生物学的サンプル中の推定がん幹細胞を検出する方法について、十分に理解できるはずです。生物学的サンプルを取り扱う際は極めて危険な場合があるため、本手順の実施にあたっては、PPE（個人用保護具）の使用や生物学的安全キャビネットの利用などの予防策を講じることを忘れないでください。