Name: 生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ：バイオレット色素を用いた側母集団アッセイで、ABCトランスポーター活性に基づきがん幹細胞を検出・分離する手法。ヒト卵巣がん細胞で約0.7%のSP細胞を同定し、治療標的探索や遺伝子発現解析に応用可能。

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Maximilian Boeschはオーストリア科学基金FWFのErwinSchrödingerFellowship（助成金番号J-3807）の支援を受けています。

このプロトコルは、標準的な制度倫理審査委員会のガイドラインを完全に遵守しています。ここに示すプロトコールを用いてヒトまたは動物の組織を調査する場合、研究者はその機関または国の関連する審査委員会からの承認を得ることが義務付けられている。 注意：生物学的サンプルを安全に取り扱うための標準的な予防措置がこのプロトコルに適用されます。これには、手袋とラボコートを着用し、できる限りバイオセーフティキャビネットの下で作業を行うことが含まれます。 1.細胞の調製<ol><li> 癌細胞株 <ol><li>適切な培地（ 例えば 、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640）中で、37℃でそれぞれのヒトまたはマウス癌細胞株を培養し、収穫する0.05％トリプシン-EDTAまたはいくつかの他の脱アタッチメントによる消化を用いて、サブコンフルエンス（ すなわち、 70〜90％）の細胞審査手続。細胞数を測定し、カウントチャンバーおよびトリパンブルー染色を使用して生存率をチェックする。生存細胞の割合は85％を超えるべきである。 注：SP区画を含むヒト癌細胞株の例には、MCF7 / HTB-22およびSKBR3 / HTB-30（乳癌）、A2780およびSKOV-3 / HTB-77（卵巣癌）およびA549（肺癌） 26が含まれる 。 </li></ol></li><li> 生体外の腫瘍組織 <ol><li>新鮮な外科的腫瘍標本を採取するか、あるいは移植可能なまたは遺伝子操作されたマウス腫瘍モデルから腫瘍組織を採取する。 200〜1,000mgの組織を採取し、機械的解離（ 例えば 、はさみまたはメスを使用）および酵素消化（ 例えば 、コラゲナーゼ/ディスパーゼ/ DNaseカクテルを使用）によって単一細胞懸濁液を生成する。 </li><li>サンプルを70μmカットオフストレーナーでろ過する。細胞数を決定し、カウントチャンバーおよびトリパンblを用いて生存率をチェックする。染色する。 注：消化カクテルには、200μg/ mLコラゲナーゼP、0.8 U / mLディスパーゼおよび25μg/ mL DNase Iが含まれていることが多く、インキュベーション時間は通常20〜50分です。理想的には、組織解離は、調査中の組織27,28,29に最適化されたプロトコルに従って行われる。 </li></ol></li></ol> 2.サンプルのテスト<ol><li>新鮮な培養液中で細胞濃度を1×10 6 cells / mLに調整してください（栄養素を含むビヒクルは、色素の抽出が活性なエネルギーを消費するプロセスで重要です）。最後に、1mLのサンプルを通常のフローサイトメトリー/ FACS丸底チューブ（「試験」と表示）に移す。 注：最適な結果を得るには、細胞濃度を滴定する必要があります（例えば、5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 106細胞/ mL）が、19より高い解像度が得られる。最大数のSP細胞を回収するソートのアプリケーションでのみ、細胞濃度を1×10 7細胞/ mLまで上げることを推奨します。 </li><li>穏やかなボルテックスまたは3〜5倍の再懸濁のいずれかにより、10μMのDCVを試料に加え、よく混合する。阻害コントロールに進む。 注：最適な結果はトリガー色素の滴定（例えば2.5; 5; 10;20μM）に依存するかもしれませんが、より高い色素濃度は一般により高い解像度19をもたらす。 </li></ol> 3.阻害制御<ol><li> 250μLの色素含有細胞懸濁液を新しいフローサイトメトリー/ FACS丸底チューブ（「対照」と表示）に移す。 50μMのベラパミルまたは20μMのFTCを添加し、ピペッティングによりよく混合する。 注：ベラパミルおよびFTCは、SP分析のための最も確立された阻害剤であるが、異なる流出ポンプ特異性を有するy：ベラパミルは、ABCB1およびABCB5を含むいくつかのABC薬物トランスポーターを阻害するが、FTCはABCG2に特異的である（6,19）。個々のサンプルのSP状態が不明な場合、別のチューブでベラパミルとFTCの両方を使用することを推奨します。 </li></ol> 4.染色<ol><li> &#39;テスト&#39;チューブと &#39;コントロール&#39;チューブの両方をキャップし、37℃で暗所で90分間インキュベートし、15分おきに穏やかに攪拌します。 SP細胞の色素抽出の大半は最初の45分以内に起こるが、非SP細胞（分解に寄与する）の色素蓄積は75〜90分後に最大である。 </li><li>染色が完了した後、細胞を3〜4mLの氷冷PBSで洗浄し、100μL（PBSも同様）の容量でペレットを再懸濁する。細胞を暗所に保ち、氷上で冷却し、追加のマーカーの染色に進む。あるいは、フローサイトメトリーアナライト溶解。 </li></ol> 5.他のマーカーの費用<ol><li> DCVで染色した細胞に所望の蛍光色素結合抗体パネルを加え、よく混合し、4〜4℃で暗所で20〜30分間インキュベートする。細胞を3〜4 mLの氷冷PBSで洗浄し、死細胞の識別に進む。 注：DCVとの互換性があり実質的に補償を必要としない抗体フォーマットには、PerCPまたはPerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、Alexa Fluor 647、APC-Cy7、APC-H7、BV711、Alexa Fluor 750およびBV786 。 DCVと互換性があるが補償が必要なフォーマットには、FITC、Alexa Fluor 488、PE、BV650などがあります。実質的にDCVと互換性のないフォーマットには、BV421、V450、V500などがあります。 </li><li>特定の製造業者が推奨する濃度でDCV染色細胞に7-AAD（またはPI）を添加し、暗所で5〜10分間サンプルをインキュベートする。 70μmのカットオフストレーナーを通してサンプルを濾過し、フローサイトメトリー分析に進む。</li></ol>フローサイトメトリー分析注：染色工程中に各フローサイトメトリー機器をオンにしておくと、サンプルの準備が整うとすぐにすべてが設定されます。これには、システム性能の追跡やタンク補充などの標準保守手順も含まれます。 <ol><li> フローサイトメーター上の細胞を取得し、二変量FSC / SSCドットプロット（図1B）でそれらをゲート。 FSCの異なるシグナル（ すなわち、高さ、幅、面積）を比較することにより、ダブレットおよび凝集物を除外する（図1C）。 <ol><li>死細胞マーカーが含まれている場合、生存細胞画分（ 例えば 、7-AAD陰性）上にゲートする（ 図1D ）。生存可能な一重項細胞を「青色」および「赤色」のDCV発光について二変量点プロット上で可視化する。この目的のために、y軸上に「青色」蛍光チャネル（ 例えば 、450/50）を表示し、X軸上の「赤色」蛍光チャネル（ 例えば 、525/50）。 </li><li>両方のチャンネルをリニアモードに切り替え、それに対応して検出器の電圧を調整して、SPが左下象限のプロットの側面に位置するようにします。逆に、非SPは、細胞周期分布（G1およびG2）を反映するプロットの右上象限に位置する。 SPをゲートし、捕捉を停止する（ 図1E ）。 注：DCVで定義されたSP細胞は、紫色レーザー励起源（ すなわち 、405nmレーザーライン）を備えたフローサイトメトリー機器を用いて検出することができる。放出された蛍光が線形モードで測定され、二変量ドットプロット上に表示された2つの別個のチャネルにおいて測定されることは、SP分析に特有のものである。 DCVの「青色」発光は約450nmで測定され（ 例えば 、450/40標準フィルターで）、DCVの「赤色」発光は約510-585nmで測定される（ 例えば 、510/50、a 525/50または585/15フィルター） 19 。アッセイの特定の化学的性質のために、SPおよび非SP細胞間の分離は、一般に、「赤色」蛍光チャネル19においてより高い。 </li></ol></li><li>禁止コントロールをロードし、データを取得します。 SP細胞は、現在消失しているか、または実質的に減少している（ 図1F ）。必要に応じて、これらのデータに基づいてSPゲートを調整します。 </li><li> SP細胞による表面マーカー発現を調べるために、x軸上にDCVの「赤色」蛍光を残し、対数モード（ 例えば 、APC）でy軸上にそれぞれの蛍光チャネルを表示する。それに対応して検出器の電圧を調整し、調べられたマーカーについて陽性に染色されたSP細胞の画分をゲートする（ 図1G ）。 SP細胞による特定のマーカーの同時発現は、プロット30の左上象限にそれぞれのシグナルを生じる。 </li><li>そのSPセルをデータ化および/またはソートする。 </li></ol>

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</ol>

著者らは宣言する利益相反はない。原稿の作成には、著者以外の人の関与もない。

癌の臨床管理の進歩は、CSCを標的とする治療様式の開発にも依存する。生物学的サンプルからのCSCの確実な単離を可能にする方法は、適切な標的の同定を促進し、したがって、この努力において非常に重要である。 SP分析は、ABCの薬物トランスポーターを発現するCSC集団を同定するための確立された、そして貴重な技術であり、DCVの実施は、標準的なフローサイトメトリー機器へのその適用性を拡大した。メカニズム的には、SP識別は、ABC薬物輸送体による活性色素流出を利用して、低い蛍光に基づいてCSCを検出し、対応する非SPに残されたプロットの下側に特徴的な局在を伴う。重要なことに、DCVベースのSP検出は、堅牢で直接的な方法であり、最も重要なステップは、細胞の調製（ii）染色プロセス（iii）適切な阻害剤の選択そして（iv）フローサイトメトリー分析。色素押出は活性なエネルギーを消費するプロセスであるため、特に良好な細胞生存率で開始することが重要です。生存可能な（薬物輸送体を発現する）細胞のみがSPを産生することができる。さらに、色素濃度と細胞密度との比を最適化し、それによってSP細胞の分離を増強することがしばしば意味をなさない（これは、DCVと細胞の両...

原発性癌治療の有効性は、この疾患の遺伝的および分子的理解の魅力的進歩、治療用抗体および小分子阻害剤などの標的薬物の出現のために、過去10年間で実質的に改善されている。対照的に、転移性および再発性の疾患は依然として典型的に治癒不可能であり、罹患率および死亡率はこれらの臨床的状況において依然として高いままである。 CSCは、腫瘍内の別個の亜集団を表し、クローン原性/腫瘍原性、多剤耐性および非対称細胞分裂1,2などの標準的な幹細胞特性を付与される。したがって、CSCは、転移性の進行および腫瘍の異種性を促進するだけでなく、患者の再発の素因となる治療中も持続する。したがって、治療的CSC除去は、疾患の再発を予防し、がんの長期治癒を可能にする重要な医学的必要性である3 </sup&gt;。 脆弱性の特定およびCSCを根絶する戦略の解明は、その後の発現プロファイリングおよび/または機能検査のための生物学的サンプルからの精製を可能にする方法に大きく依存する。次に、そのような方法は、これらの細胞に特異的な表面、細胞内または機能的マーカーに依存する。 CSC特異的表面マーカーには、CD44、CD133、CD24およびCD90が含まれるが、これらに限定されず、乳癌および大腸癌を含む様々な腫瘍実体におけるCSC集団を同定するために使用されてきた4 。別のマーカーであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）は、細胞内局在を示し、機能的に検出することができ、その酵素的変換により光を生じるそれぞれの基質を提供することができる。この試験を用いて、CSC集団は多様な腫瘍実体においても同定されている5 。一般にSP分析と呼ばれ、ここではm<html> ABC薬物輸送体による活性色素流出を利用して、蛍光dim型幹様細胞の小さな集団を同定する6,7,8。これを達成するために、所与の試料を、受動拡散によってすべての細胞に入り、結合のために核およびミトコンドリアDNAを標的とする親油性DNA結合フルオロフォアの存在下でインキュベートする。 ABC薬物輸送体発現を欠いている非CSCsは染料を蓄積し、明るい蛍光をもたらし、CSCsは蛍光を減少させる染料を能動的に押し出す。薬物輸送体活性の薬理学的阻害は、SP表現型を排除し機能的に確認し、制御目的に使用すべきである。 SP特性を示すCSC集団が、とりわけ、卵巣癌9,10 、前立腺癌11 、&gt; 12、乳癌13 、肺癌14 、子宮内膜癌15 、神経膠腫16,17および骨肉腫18 。重要なことには、特定の腫瘍細胞識別戦略（ある種の宿主細胞集団もSP特性を示すことができる）のような追加の課題があるにもかかわらず、SPアッセイは癌細胞株および原発腫瘍組織の両方に適合する19,20 。 2つの最も確立されたSPを与える薬物輸送体は、ABCB1 / P-糖タンパク質/ MDR1 / CD243およびABCG2 / Bcrp1 / CD338である。しかし、他の薬物トランスポーターもSP表現型の分子決定因子（ 例えば 、ABCB5）であり得る22 。 ABCB1ABCG2の活性は、fumitremorgin C（FTC）6,19を用いて特異的に排除することができるが、ベラパミルで効率的にブロックすることができる。 SP分析の特別な強さは、他の染色（ 例えば 、表面マーカーおよびALDH）と組み合わせることができ、生細胞の回収を可能にし、下流の機能検査と互換性があることである。さらに、SPC検出は、CSC集団の中でABC薬物輸送体の高い保存率のために広く適用可能である（9,23）。 もともと、SP検出は、Hoechst 33342をトリガー色素24として用いて行われている。この染料は優れた解像度を達成するが、紫外線レーザー励起を必要とする。したがって、その適用性は当然、ハイエンドフローサイトメトリー機器に限定される。 DyeCycle Violet（DCV） 25の登場により、新しいAvenuこの方法を紫外線レーザー源を欠く標準的なフローサイトメトリー機器（DCV-SP細胞を分解するのに紫色レーザー源で十分）に応用することができました。重要なことに、Hoechst 33342およびDCVは共通のポンプ特異性を共有しており、どちらの色素も同じ細胞集団を同定する必要があることを示しています。 ここでは、DCVベースのSP分析の詳細な実験プロトコルを提供し、独立したラボで素早く簡単に再生することができます。我々は、この有用な細胞生物学的方法の最適化と標準化に貢献すべきであるCSC研究者のための資料としてこの論文を認識する。

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>V35003</td><td>すぐに使える</td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>エタノールに溶解</td></tr><tr><td>フミトレモルギンC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD(またはヨウ化プロピジウム - PI)</td>に溶解 <td>BioLegend</td><td>420403</td><td>すぐに使える</td></tr><tr><td>標準的な細胞培養試薬(例:、培地、FBS、L-グルタミン、抗生物質、PBS、トリプシン-EDTA、etc.)</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>目的のサンプル/細胞(例:、ヒトまたはマウスのがん細胞株、ヒトまたはマウスの腫瘍組織)</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー機器(FACS;分析装置またはセルソーター)</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>紫色のレーザー光源は、</td></tr><tr><td>必要なFACSチューブ(丸底)</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>キャップ付きチューブを推奨</td></tr><tr><td>70&マイクロ;mカットオフストレーナー</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>オプションだが推奨</td></tr><tr><td>消化酵素ミックス(例:、コラゲナーゼ/ディスパーゼ/Dnase)</td> <td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>組織解離にのみ関連</td></tr><tr><td>関心のある表面マーカーに対するフルロクロム標識抗体</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>オプションの</td></tr><tr><td>ALDEFLUORキット</td><td>STEMCELLテクノロジー</td><td>01700</td><td>オプション</td></tr></tbody></table>

生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのdna色素誘発側母集団表現型の活用

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

がんは幹細胞に起因する疾患であり、これらの細胞の根絶が主要な治療目標となっている。 Cancer Stem Cells（CSCs）の脆弱性を解読し、適切な分子標的を特定することは、細胞系やex vivo腫瘍組織などの異種試料での特異的差別を可能にする方法に依存しています。フローサイトメトリー/ FACSは、単一細胞レベルで生物学的サンプルをマルチパラメトリックに解剖するための強力な技術であり、下流の分析のために生きた細胞を回収するための選択方法である。 CD44およびCD133のような表面マーカーならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出は、FACSによる腫瘍サンプルからのCSCを定義および分類するためにしばしば用いられてきた。ここで方法論的詳細に示されている相補的アプローチは、一般に側方集団（SP）と呼ばれる蛍光dim細胞の明確な集団を同定するABC薬物トランスポーターによる機能的色素押出を利用する。 SPがん細胞は、標準的な幹細胞の特徴を示し、色素押し出し薬物輸送体（最も頻繁にはABCB1 / P-糖タンパク質/ MDR1 / CD243およびABCG2 / Bcrp1 / CD338）を阻害する物質を使用して廃止され、機能的に確認され得る。さらに、SPアッセイは、表面抗原の染色、アルデヒドデヒドロゲナーゼ検出、および死細胞識別（ 例えば 、7-AADまたはヨウ化プロピジウム（PI））などの他のフローサイトメトリー評価と適合する。したがって、我々は、表現型パラメータではなく機能的に基づいて、CSC同定、単離およびサブキャラクタリゼーションを機械的に行うための価値ある、広く適用可能な方法を記載する。もともとHoechst 33342をトリガー色素として使用していましたが、ここではバイオレットレーザー光源を備えたフローサイトメーターで分解可能な、より新しいViolet色素に基づくSP表現型に焦点を当てます。

A2780細胞の代表的なSP分析であり、これは、以前に細胞の1％未満を占めるSPを保持することが示されたヒト卵巣癌細胞株である9 。細胞を、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI1640中で37℃で培養し、0.05％トリプシン-EDTAでの処理を用いて85％コンフルエンシーで採取した。細胞をPBSで洗浄し、70μmのカットオフストレーナーで濾過した。計数チャンバおよびトリパンブルー染色を使用して細胞数を測定し、1×10 6細胞/ mL（新鮮培地）を10μMDCVで暗所で37℃で90分間染色した。並行して、そのアリコートを全く同じ条件下で20μMのFTCの存在下でインキュベートした。細胞を4mLのPBSで洗浄し、ABCG2に対するAPC結合抗体を、事前に滴定した濃度で「試験管」に添加した。インキュベート後4℃で25分間、細胞をPBSで洗浄し、7-AADを添加して死細胞を標識した。試料を氷上で冷却し、FACS装置で...

生物学的試料からの幹細胞集団の特徴付けおよび単離を可能にする方法は、癌およびそれを超える幹細胞標的化治療の進歩にとって重要である。ここでは、色素誘発性の側方集団表現型を用いた癌幹細胞単離のための詳細なプロトコールを提供する。

生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

本手順の全体的な目的は、サイドポピュレーション細胞の染料排出能に基づいて、生物学的試料中の推定がん幹細胞集団を検出することです。本手法は、生物学的試料からがん幹細胞を検出および精製するための信頼性の高い手段という、がん幹細胞研究における重要な課題に対処するものです。本技術の主な利点は、機能的マーカーを利用するため、より高い解像度が得られる点にあります。さらに、これらのABC薬剤輸送体の発現はがん幹細胞間で高度に保存されているため、この手法を多くの異なるがん疾患に適用することが可能です。本手法は、高度に精製されたがん細胞における遺伝子発現プロファイリングや標的バリデーションなどのダウンストリーム解析を容易にするため、抗がん幹細胞治療薬の探索への応用が期待されます。したがって、本手法はがん幹細胞の特性に関する知見を提供することができます。また、この方法を用いて、骨髄などの ABC ドラッグトランスポーターを発現する細胞集団を含むシステムを特性評価することも可能です。以下、私の研究室の技術者である Elisabeth Hoflehner が手順を実演します。まず、目的のヒトがん細胞株を、10% FBS、2 mM L-glutamine、および抗生物質を添加した 10 ～ 30 mL の RPMI 1640 培地を用い、37 °C で培養します。細胞が約70〜90%コンフルエントに達したら、培地を除去し、0.05% trypsine-EDTAを2 mL加えて細胞を培養皿の表面から剥離させます。次に、10 mLの培養培地で細胞を洗浄し、懸濁液を清潔な15 mLチューブに移し、4 °Cで250 ×gにて5分間遠心分離します。細胞がペレット状になったら、上清を捨て、ペレットを1 mLの培養培地で再懸濁します。細胞懸濁液の少量分注液をトリパンブルー溶液と混合し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。テストサンプルを調製するために、細胞を新鮮な培地で懸濁し、1 × 10⁶ cells/mLの細胞懸濁液を作成します。細胞密度を調整後、サンプルの3 mLを「test」と表記した15 mLラウンド底チューブに移します。次に、サンプルに10 µMのバイオレット色素を加え、懸濁液を穏やかにボルテックスします。続いて、色素を含む細胞懸濁液500 µLを「control」とラベルした2本のフローサイトメトリー用チューブに分注し、阻害コントロールを調製します。そのうちの1本に50 µMのVerapamilを加えます。2番目のチューブに20 µMのFumitremorgin Cを加え、ピぺッティングにより穏やかに溶液を混合します。すべてのチューブをキャップで密閉し、37 °Cの暗所で90分間インキュベートします。15分ごとにサンプルを緩やかに攪拌します。染色の完了後、阻害コントロールを3〜4 mLの氷冷PBSで洗浄します。続いて、テストサンプルを分注し、抗体による共染色に備えます。これらの分注液も同様に洗浄し、細胞凝集塊を除去するために、すべてのサンプルを70 micronのカットオフストレーナーでろ過します。その後、懸濁液を4 °C、250 ×gで5分間遠心分離します。得られたペレットを100 µLのPBSで再懸濁した後、細胞を遮光して氷上で保持します。次に、バイオレット染料で事前染色した細胞に、適切なフルオロクロム標識抗体パネルを添加します。懸濁液をボルテックスし、4°Cの暗所で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、3〜4 mLの氷冷PBSで細胞を洗浄し、必要に応じてサンプルをろ過します。その後、4 °Cで250 ×gにて5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を100 µLのPBSで再懸濁します。最後に、バイオレット染料で事前染色した細胞に7-AADを添加します。サンプルを暗所で5〜10分間インキュベートします。フローサイトメーターを用いて細胞を解析するために、FSC SSCドットプロット上で適切な細胞集団をゲートします。次に、異なるFSCシグナルを用いて、選択した集団からすべての細胞凝集塊を除外します。生存細胞の集団を得るため、7-AAD染色陽性の細胞を除外します。青色および赤色色素の放出に関するドットプロットを作成するには、y軸に青色蛍光チャンネル、x軸に赤色蛍光チャンネルを表示させます。両方のチャンネルをリニアモードに切り替え、サイドポピュレーション（side population）がプロットの左下に位置するように検出器の電圧を調整します。次に、サイドポピュレーションをゲートします。そして、データ収集を停止します。続いて、阻害コントロールをロードし、データを収集します。最後に、x軸にバイオレット染料の赤色蛍光を、y軸に適切な蛍光チャンネルを対数モードでプロットしたドットプロットを作成します。サンプルをロードし、検出器の電圧を適切に調整して、調査対象の表面マーカーを発現しているサイドポピュレーション細胞の割合を特定します。その後、データを記録してください。ここでは、ヒト卵巣がん細胞において実施されたサイドポピュレーション分析の代表的な結果を示します。青色および赤紫色発光の分析によって区別されたサイドポピュレーションは、ドットプロットの左下象限に同定され、分析した全集団の0.70%を占めていました。その後、エフルックス阻害剤（排出阻害剤）を使用したところ、 previously identified cells（以前に同定された細胞）で観察された蛍光シグナルが消失し、これらの細胞がサイドポピュレーションの表現型を持つことが確認されました。最後に、ヒト卵巣細胞についてABCG2の発現を評価しました。同定されたサイドポピュレーションに相当する0.67%の細胞にABCG2の陽性染色が観察されました。この手順に習熟し、適切に実施すれば、約2〜3時間で完了させることができます。この手順を試みる際は、サイドポピュレーション（side population）の表現型が、染料濃度と細胞密度の比率の最適化に厳格に依存することを留意することが重要です。したがって、実験前に両方の変数を十分に検証することを強く推奨します。本手順の後、遺伝子発現プロファイリングなどの他の手法を実施することで、サイドポピュレーション細胞をさらに特性解析し、将来的な薬剤開発に向けた新規のがん幹細胞特異的な標的を同定することが可能です。本技術の開発により、幹細胞生物学分野の研究者が、マウスおよびヒトの両方において組織幹細胞およびがん幹細胞の特性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、バイオレット染料によるトリガーを用いたサイドポピュレーション（SP）解析の実施方法、およびご自身の研究室で生物学的サンプル中の推定がん幹細胞を検出する方法について、十分に理解できるはずです。生物学的サンプルを取り扱う際は極めて危険な場合があるため、本手順の実施にあたっては、PPE（個人用保護具）の使用や生物学的安全キャビネットの利用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

がん幹細胞（CSC）が悪性腫瘍の数が同定されている。このプロトコルでは、ヒト膵臓腺癌の異種移植片からCSCを分離するアルデヒド脱水素酵素活性とCD44とCD24の発現を利用したフローサイトメトリー法を説明します。これらの生細胞は、機能的分析の研究で使用することができます。...

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

このビデオでは、蛍光活性化セルソーターまたはFACSを使用して、頭頸部扁平上皮癌細胞株から癌幹様細胞の亜集団を分離する方法について説明します。細胞の分離された側集団は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。...

がん側集団弁別アッセイ:Hoechst Dye Efflux Assayを用いたがん幹様細胞の単離法

この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133...

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

直接ヒト組織からがん幹細胞（CSCが）の単離は、それらの生物学的特性評価のために必要である。また、難しい手順のトラブルシューティングのヒントを提供しながら、この原稿は、ヒト組織からの前立腺のCSCを単離するための方法論を説明します。...

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

膵臓がん幹細胞(CSC)は、アンカレッジ非依存球体培養技術を使用してin...

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

腫瘍の再発と治療に対する抵抗性における癌幹様細胞の役割を理解することは、過去10年間で大きな関心事となっています。この記事では、頭頸部扁平上皮がん細胞株(HNSCC)からのがん幹様細胞の亜集団の単離と特性評価について説明します。...

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

この方法論の目的は、癌細胞株および原発ヒト腫瘍試料中の癌幹細胞(CSC)を、細胞細胞の機能性アッセイと表現型特性評価を用いて堅牢に同定することである。しみ。...

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

固体腫瘍細胞株における側集団細胞の割合を測定する便利で迅速かつ費用対効果の高い方法が提示される。...

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。...

HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo...

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

ここでは、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、サイドポピュレーション(SP)細胞検出用の355...

フローサイトメトリーによるHoechst側集団細胞の効果的な検出

学ぶ：バイオレット色素を用いた側母集団アッセイで、ABCトランスポーター活性に基づきがん幹細胞を検出・分離する手法。ヒト卵巣がん細胞で約0.7%のSP細胞を同定し、治療標的探索や遺伝子発現解析に応用可能。

生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

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