生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

この手順の全体的な目標は、サイドポピュレーション細胞の色素押出能力に基づいて、生物学的サンプル中の推定がん幹細胞集団を検出することです。この方法は、生物学的サンプルからがん幹細胞を検出および精製するための信頼性の高い手段に関するがん幹細胞研究における重要な問題に対処します。この手法の主な利点は、機能マーカーを展開するため、解像度が向上することです。

さらに、これらのABC薬物トランスポーターの発現はがん幹細胞間で高度に保存されているため、この手法をさまざまながん実体に使用できます。この手法は、高度に精製されたがん細胞における遺伝子発現プロファイリングや標的検証などの下流解析を容易にするため、抗がん幹細胞治療薬の発見にまで及びます。したがって、この方法は、がん幹細胞の特性についての洞察を提供することができます。

また、この方法を使用して、骨髄などの集団を発現するABC薬物トランスポーターを含むシステムとして特徴付けすることもできます。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるElisabeth Hoflehnerです。まず、10%FBS、2mmのL-グルタミン、および抗生物質を添加した10〜30ミリリットルのRPMI 1640培地で、目的のヒトがん細胞株を摂氏37度で培養します。

細胞が約70〜90%のコンフルエンスに達したら、培地を取り出し、2ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加えて、培養皿の表面から細胞を剥離します。次いで、細胞を10ミリリットルの培地で洗浄し、懸濁液を清潔な15ミリリットルのチューブに移し、4°CでGの250倍で5分間遠心する。細胞がペレット化されたら、スプレナタントを廃棄し、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。

細胞懸濁液の少量アリコートをトリパンブルー溶液と混合し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。試験サンプルを調製するには、細胞を新鮮な培養液に懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の細胞懸濁液を得る。細胞密度を調整した後、サンプルの3ミリリットルをテストとしてラベル付けされた15ミリリットルの丸底チューブに移します。

次に、10マイクロモルのバイオレット染料をサンプルに加え、懸濁液を穏やかにボルテックスします。次に、細胞懸濁液を含む色素500マイクロリットルをコントロールと標識された2本のフローサイトメトリーチューブに移すことにより、阻害コントロールを調製します。最初に50マイクロモルのベラパミルを追加します。

そして、20マイクロモルのフミトレモルギンCを第2のチューブに注入します。そして、静かにピペッティングして溶液を混合します。すべてのチューブをキャップで覆い、暗闇の中で摂氏37度で90分間インキュベートします。

サンプルを15分ごとに穏やかに攪拌します。染色が完了したら、3〜4ミリリットルの氷冷PBSで阻害コントロールを洗浄します。そして、その後の抗体による染色のために、試験サンプルのアリコートを調製します。

このアリコートも洗浄し、すべてのサンプルを70ミクロンのカットオフストレーナーでろ過して、潜在的な細胞凝集体を除去します。次に、懸濁液をGの250倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。得られたペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁した後、氷上の細胞を光から保護するように維持します。

次に、バイオレット色素で染色した細胞にフルロクロム標識抗体の適切なパネルを添加します。懸濁液をボルテックスし、暗闇の中で摂氏4度で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を3〜4ミリリットルの氷冷PBSで洗浄し、必要に応じてサンプルをろ過します。

その後、Gの250倍で摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。最後に、バイオレット色素で染色した細胞に7-AADを添加します。

そして、サンプルを暗闇で5〜10分間インキュベートします。フローサイトメーターを使用して細胞を解析するには、FSC SSCドットプロット上で適切な細胞集団をゲートします。次に、異なるFSCシグナルを使用して、選択した母集団からすべての細胞凝集体を除外します。

7-AAD染色が陽性である細胞を除外して、生存細胞の集団を取得します。青色と赤色の色素放出のドットプロットを作成するには、青色の蛍光チャネルを Y 軸に、赤色の蛍光チャネルを X 軸に表示します。両方のチャンネルをリニアモードに切り替え、それに応じて検出器の電圧を調整して、サイドポピュレーションがプロットの左下部分に配置されるようにします。

次に、サイドポピュレーションをゲートします。そして、買収を停止します。次に、インヒビションコントロールを読み込み、データを取得します。

最後に、x軸に紫色染料の赤色蛍光を表示し、対数モードでプロットされたy軸に適切な蛍光チャネルを表示するドットプロットを作成します。サンプルをロードし、それに応じて検出器の電圧を調整し、調査した表面を発現するサイドポピュレーションセルの派閥を特定します。次に、データを記録します。

ここに提示されているのは、ヒト卵巣癌細胞で実施されたサイドポピュレーション分析の代表的な結果です。青と赤紫の発光の分析によって区別された側集団は、ドットプロットの左下象限で特定され、分析された母集団全体の0.70%を構成しました。その後の排出抑制剤の使用により、以前に同定された細胞で観察された蛍光シグナルが消失し、それらの側集団表現型が確認されました。

最後に、ヒト卵巣細胞もABCG2発現の観点から特徴付けられました。ABCG2陽性染色は、同定された側集団に対応する細胞の0.67%で観察されました。この手順を習得すると、適切に実行すれば、約2〜3時間で完了します。

この手順を試みる際には、サイドポピュレーションの表現型が最適な色素濃度と細胞密度の比率に厳密に依存することを覚えておくことが重要です。したがって、実験の前に両方の変数の水和を強くお勧めします。この手順に続いて、遺伝子発現プロファイリングなどの他の方法を実行して、サイドポピュレーション細胞をさらに特徴付け、将来の医薬品開発のための新しいがん幹細胞特異的な標的を特定することができます。

その開発後、この技術は、幹細胞生物学の分野の研究者がマウスと男性の両方で組織幹細胞と癌幹細胞の特性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、バイオレット色素をトリガーするサイドポピュレーションSAの実施方法と、ご自身の研究室で生体サンプル中の推定がん幹細胞を検出する方法について十分に理解できるはずです。生物学的サンプルの取り扱いは非常に危険であり、この手順で作業する際にはPPEや生物学的安全キャビネットの使用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。