Name: マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるLC3、p62、LAMP1の共局在解析法。Jurkat細胞を用いた定量的オートファジー評価で、客観的かつ統計的に厳密なオートファジーフラックス測定が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

私はMilliporeSigma、Philip J. Morrissey、Sherree L. Friendの同僚に長年の支持と指導をしてくれたことに感謝したいと思います。私はまた、IDEASソフトウェアのBDC3機能、 Ryan P. Jessup、この原稿の編集を手伝ってくれたVidya VenkatachalamとBryan R Davidsonに感謝します。撮影当日のRaymond Kongと特別感謝します。メイクアップアーティストCynthia Xamonthiene。

<ol><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+should+autophagic+flux+be+assessed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Why should autophagic flux be assessed?</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li>
<li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18425443">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li>
<li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li>
<li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li>
<li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li>
<li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li>
<li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li>
<li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008(2015).</li>
<li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li>
<li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li>
<li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
<li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li>
<li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li>
<li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
<li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagy%3A+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li>
<li>IDEAS. <a target="_blank" href="https://www.amnis.com/images/PN_780-00959-00_RevC_IDEAS_User_Manual.pdf">Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2</a>. , (2015).</li>
</ol>

私はこの研究で使用されたAmnisブランドImageStreamの製造元であるMilliporeSigmaに雇われています。

この分析を行う際には、考慮すべき点がいくつかあります。適切な対照試料を有することが重要である。この実験のために、2つの異なる対照、すなわち対照および対照+クロロキンを使用した。対照試料を用いて領域の閾値を設定した。それはリソソーム分解を止めることなくオートファジーの基礎レベルを表し、飢餓状態のサンプルのコントロールです。しかし、対照サンプルは、クロロキン自体がコントロールサンプルに影響を及ぼすため、Starved + Chloroquineサンプルの結果と比較するのに適切なコントロールではありません。したがって、Control + Chloroquineサンプルが必要でした。 オートファジーの分析を行う前に、複数のセルが存在する場合、結果が影響を受ける可能性があるため、フォーカスされている単一セル（ つまり、 60以上の勾配RMS）のみを分析/ゲートすることが重要です。焦点が外れている。自食作用が重要であるesおよびリソソームは、適切なスポット計数およびBDC3分析のために焦点を合わせている。アポトーシス細胞は、オートファジー分析に先立って除去されなければならない。なぜなら、それらは結果を歪曲し、含まれてはならないからである。すべての3つのマーカー（ すなわち、LC3、P62、およびLAMP-1）のための適切な染色があるはずです。例えば、3つのマーカーはすべて細胞内であり、点状のシグナルを有するべきである。シグナルが点状でない場合、または細胞の表面上にある場合、染色は適切ではなく、実験/染色は再度行わなければならない。さらに、BDC3が正確であるためには、関心のある3つの蛍光マーカーすべてについて明るい細胞をゲートすることが不可欠である。非特異的結合、画像化アーチファクト、および/またはノイズに対するBDC3の測定を防止するためには、陽性事象に対するゲーティングが必要である。これは、BDC3が真の信号ではないアーチファクトを増幅する可能性があるため、非常に重要です。 BDC3は明るい陽性事象に対してのみ実施することができるので、多くの細胞は最終分析に含まれないことがある。これは特にLC3、p62、および/またはLAMP1の蓄積を全く有さない対照細胞については真実である。したがって、このアッセイの限界は、BDC3が、すべてのオートファジー実験に適切ではない可能性がある3つのマーカー全てに対して陽性である細胞のみを調べることである。 先に単独でBDC3が大きく、その結果、アカウントに共局在オートファジー細胞小器官の数を取らない15、16、17、20、21、22、23、24、25、26、報告されているBDS、等オートファゴソームの数の変動の可能性がある。したがって、Rajan らによって提示された二変量のアプローチは、を採用した。二変量プロットを見ると、細胞はLC3、p62およびLAMP1に対して陽性でなければならない。どうしてそんなにたくさんの細胞があり、0のスポットがあるのですか？これは、LC3信号が共局在化に十分明るい可能性があるため、ピークマスク（ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4））によって設定されたしきい値を満たさない可能性があるスポット。 ここに提示されたプロトコールは、LC3涙点数をカウントするためにMIFCを用い、自食流束を測定するために3つのオートファジーマーカーの共局在化を用いた。基底状態（対照試料）では、自己好塩基球の数は少なく、「ハイスポット」ではほとんど検出されなかった。オートファゴソーム/リソソーム融合を阻害するクロロキンの添加により、LC3スポットの数が増加した。リソソームは、オートファゴソームおよびオートファゴソームに存在するp62を分解することができないので、LC3、p62およびLAMP1自己リゾソーム蓄積の共局在が増加する。この効果は、栄養のあるスターバットイオン、これはオートファジーを誘発する。しかし、クロロキンの添加がなければ、自己食作用の回転数の増加による可能性が最も高い、自己食作用の数の有意な増加はなかった。細胞がクロロキンの存在下で飢餓状態になると、共局在化および自己貪食細胞数が増加し、飢餓が自食性流動を増加させるという結論を支持する。 EBSSは強力なオートファジーの誘導物質として知られています。したがって、その増加は大きくなると予想される。薬物誘導のような別の方法を用いてオートファジーを誘導する場合、コントロールサンプルと処理サンプルとの差異は微妙である可能性がある。 この特定のプロトコールは、ヒト細胞株におけるオートファジーを測定するために設計されたが、アッセイは、その特定の種の抗体に切り替えることによって、他の種に適合させることができる。さらに、分析方法は、共局在化を必要とする任意の細胞内適用3つのプローブ/マーカーからなる。

以下ではオートファジーと呼ばれるマクロオートファジーは、損傷または機能不全の成分、長命のタンパク質、およびオルガネラがリソソームを介して分解され 、リサイクルされる異化経路である1 。オートファジーは、オートファゴソームの形成を伴うダイナミックな多段階プロセスである。オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリゾソームの形成、および自己オリゴソーム2の内容物の分解が含まれる。哺乳類の系でオートファジーを同定するために使用される重要な生物学的マーカーは、オートファゴソーム膜を構成する微小管関連タンパク質1A / 1B-軽鎖3（LC3）である。オートファジーの間、サイトゾルLC3-1はホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートしてLC3-IIを形成する;次いで、LC3-IIは、自己貪食膜3に取り込まれる。自食性フラックスのためのもう1つの広く使用されるマーカーは、物理的にliであるオ​​ートファジー受容体配列sequestome 1（SQSTM1、p62）オートファジー膜4、5 NKSオートファジー貨物。 伝統的にオートファジーを測定するために使用されてきた方法は、ウェスタンブロットと蛍光顕微鏡です7 。しかし、これらの方法のいずれもがこれらの技術の両方に関連する課題があるとして「ゴールドスタンダード」、2、6であると考えられています。ウエスタンブロットはホモジネートサンプルを使用しているため平均値しか得られないため、観察者は個々の細胞で何が起こっているかを見ることができません。一方、蛍光顕微鏡法は、単一細胞レベルで観察者に情報を与えるが、スループット能力に欠け、客観的かつ統計的に厳密な評価を得ることが困難である。近年、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC、 Table of Materialsを参照）によるLC3およびp62の測定は、定量能力、ハイスループット能力、多重化可能性、すべての細胞を画像化する能力による稀少性があります。 （ 材料の表を参照）、そのコンパニオン解析ソフトウェアと共に、MIFCを使用してオートファジーを測定するために最も広く用いられる方法の一つは、LC3の涙点またはオートファゴソーム8、9、10、11、12、13、14のスポットカウントを介するものです、15、16、17。しかし、オートファゴソームの増加は、オートファジーの増加が必ずしも起こるわけではありません。これは、プロセス2の封鎖にもなる可能性があるためです。 LC3-IIの代謝回転は、細胞の存在下および非存在下で細胞を分析することによって自食流を測定するための有用なパラメーターであり、クロロキンのようなリソソーム分解阻害剤が存在しない。クロロキンは、それによって18を発生する可能性がリソソーム分解の前にオートファジーフラックスを阻止することにより、オートファジーの程度の尺度としてオートファゴソーム形成の定量化を可能にする、リソソームにオートファゴソームの融合を阻害します。また、P62は、主にオートファジーによって分解され、オートファゴソームとその内容のリソソーム分解がブロックされている場合、P62の蓄積は、17、19を期待されています。 オートファジーは多段階のプロセスであり、LC3またはp62の測定だけでは、細胞内で何が起きているのかを完全に把握することはできません。最近の刊行物はautolysosome 2、17、20、21の同時形成を検討する必要性を強調してきました。 MIFCは17、20、21、22、23、24、25、26 - 15リソソームにオートファゴソームの共局在を撮像しautolysosomeの形成を測定する一意できます。さらに、MIFCを用いたp62とLC3の共局在化もまた、自食流束5を測定するために検討されている。参照される分析ソフトウェアでは、共配置を測定する「特徴」は「明細部類似性​​R3」（BDS）と呼ばれ、2つの画像の小さくて明るい画像の詳細を比較するように特別に設計されている。 BDSは、3ピクセル以下の半径を有する局所化された輝点の対数変換されたピアソンの相関係数である。言い換えると、BDSは、2つの異なる蛍光チャネルからのピクセルのバーリング。輝点は、相関している（ すなわち、同じ空間的位置）か、相関していない（ すなわち、異なる空間的位置）かのいずれかである。したがって、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）との間で変化する。係数がゼロと無限大26、27との間の範囲を増加させるために対数変換です。 BDSだけでは十分ではないかもしれません。 Rajan et al。 BDSのみを使用すると、偽陽性または偽陰性の結果につながる可能性があることが判明した21 。 BDSは、オートファジーの2つのマーカーの共局在を評価するが、オートファゴソームの数は考慮しない。オートファゴソームの数を説明するために、Rajan et al。 LC3穿刺21のスポットカウントを含む。 Rajan et al。 BDSに対するLC3スポットカウントの二変量散布プロットを使用して提案された。この二変量プロットを使用して、2つの集団最初に同定されたもの：高レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの、および低レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの。高LC3スポット集団は、低い共局在（ すなわち、自己好中球の蓄積）細胞および高い共局在（ すなわち、自己リソソームの蓄積）を有する細胞という2つの集団にさらに分類された。この二変量プロットは、ごく少数のオートファゴソームを有する細胞と、オートファゴソームおよび/または自己リソソームを蓄積する細胞を区別することを可能にする21 。 今まで、MIFCコンパニオン解析ソフトウェア（ 表の表を参照）の単一の「フィーチャタイプ」を使用して、LC3、p62、およびLAMP1（リソソームマーカー）の同時共局在化は不可能でした。しかし、バージョン6.1で最近導入された新機能は、Bright Detail Colocalization 3（BDC3）と呼ばれています。 BDC3は、3つの画像のそれぞれからの明るいディテール画像（この場合、LC3つのプローブ（ すなわち、 LC3、p62、およびLAMP1）の共局在を定量する。 BDC3機能は、3つの画像に拡張されるように修正されたピアソンの相関係数を計算します。 3つの画像の輝点は相関しているか相関していないので、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）の間で変化する。係数は、0と無限大の間のダイナミックレンジを増加させるために対数変換されます。 BDC3フィーチャを使用してBDSフィーチャを切り替えることにより、Rajan らが提示した解析方法1つのシステムで同時にオートファジーを測定するために3つの最も使用されるマーカーを組み込むことができます。オートファジーのこれらの3つのマーカーを単一アッセイで共局在させる能力は、オートファジーの誘導および調節に対する新規な洞察につながる可能性がある。以下のプロトコールは、Jurkat細胞においてオートファジーを誘導するステップを概説する。細胞をLC3、p62、およびLAMP1抗体で標識する;マルチスピスでデータを取得する外部イメージングフローサイトメーター;自食流束を評価するためにデータを分析する。

<table><tbody><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 Donkey anti-Mouse - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>ロバ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 647。コンクntレーション2 mg / mL。https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>抗ヒト CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>クローン H4A3.濃度400&マイクロ;g/mLです。http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>反ヒトCD45 - AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>クローンHI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>抗ヒトCD45 - PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>クローン HI30.&nbsp;</td></tr><tr><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html 対ヒトCD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>クローン HI30.&nbsp;</td></tr><tr><td>http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&nbsp;濃度 2 mg/mL.&nbsp;https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>抗SQSTM1 / p62抗体 [EPR4844] - オートファゴソームマーカー (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>クローン EPR4844.&nbsp;濃度0.5 mg / mL。http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>クロロキン二リン酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>クレンザー - コールター クレンツ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546931</td><td>容器に200 mLのクレンザーを充填します。&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>容器に200 mLのデバブラーを充填します。&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 10x</td><td>ミリポアシグマ</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp;Ca++Mg++ フリー&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水1x</td><td>ミリポアシグマ</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg ++フリー&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、10%、メタノールフリー、Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>これが4%と1%のホルマリンに使用されているものです。注意:ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入および飲み込むと有毒です。&nbsp;目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。&nbsp;吸入や皮膚接触により感作性を引き起こす可能性があります。目に重大な損傷を与える恐れがあります。&nbsp;潜在的ながんの危険性があります。&nbsp;http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>ハンクス平衡塩溶液 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>405nm、488nm、642nmのレーザーを搭載した2台のカメラImageStreamX Mark IIを使用しました。 http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC解析ソフトウェア - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>MIFC のコンパニオン ソフトウェア (ImageStreamX MKII)。&nbsp;IDEASバージョン6.2</td></tr><tr><td>MIFCソフトウェア - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>これは、MIFC(ImageStreamX MKII)を実行するソフトウェアです。INSPIREバージョン200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体クローンH4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td><td></td></tr><tr><td>ペニクリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>リンス-超純水または脱イオン水</td><td>NA</td><td></td> <td>NA超純水、脱イオン水なら何でも使えます。容器に900mLのリンスを入れます。</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>シース - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>これはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 1X&nbsp;Ca++MG++フリー.&nbsp;容器に900mLのシースを入れます。</td></tr><tr><td>シリコーン化ポリプロピレン微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-681-320</td><td>フィッシャーブラン シリコーン化低保持マイクロ遠心チューブ 1.5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液 (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>滅菌器 - 0.4 - 0.7% 次亜塩素酸</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>これは、クロロックス漂白剤を水で溶出させることで作ることができる10%のクロロックス系漂白剤です。容器に200mLの滅菌器を入れます。</td></tr><tr><td>システムキャリブレーション試薬 - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>各チューブは~10 mLを保持します。&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>T75 フラ</td><td>スコ ファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100、タンパク質グレード洗剤、10% 溶液、滅菌ろ過ミル</td><td>ピポールシグマ</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>水、細胞培養グレード&nbsp;</td><td>ハイクローン</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたlc3、p62、およびlamp1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

オートファジーは、成長および分化中に蓄積する正常または機能不全の細胞成分がリソソームを介して分解され、リサイクルされる異化経路である。オートファジーの間、細胞質LC3タンパク質は脂質化され、オートファゴソーム膜に補充される。次いで、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリゾソームを形成し、オートファゴソームベシクルおよびその内容物の分解が起こる。 LC3に結合するユビキチン関連タンパク質p62もまた、自食性の流れをモニターするために使用される。オートファジーを受けている細胞は、p62、LC3、およびリソソームマーカーの共局在を示すはずである。免疫蛍光顕微鏡法は、細胞ごとにLC3涙点、p62および/またはリソソームを視覚的に同定するために用いられてきた。しかし、客観的かつ統計的に厳格な評価を得ることは困難である。これらの問題を克服するために、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーと、3つのオートファジーマーカー（LC3、p62およびリソソームLAMP1）からの尾部画像を検出し、それらの共局在を定量化し、LC3スポット計数と組み合わせて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定する。

この分析方法は、複数の特徴を用いて自食流束を測定する。最終二変量プロットを完全に理解するためには、まず個々の分析特徴を調査しなければならない。オートファゴソームの計数は、オートファジーを測定する論理的な方法です。しかし、LC3涙のサイズ/形状/輝度は、細胞間で大幅に変化し得る。変異により、自動染色体を手動で数えることが困難になるか、分析ソフトウェアでスポットカウント機能を使用することが困難になります。したがって、オートファゴソームのこの大きな変動のためにスポットカウント機能は完璧ではない。しかし、良いスポットカウント機能は、ほとんどの細胞26上で動作します。 図3は、異なるスポットマスクを用いたJurkat細胞におけるLC3穿刺のスポットマスキングの例を示す。このデータセットで選択されたスポットカウント機能は、Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4です。スポットカウント機能は、スポット対セル背景比率4（Bright、4）でチャンネル11（Ch11-LC3-AF647）のデフォルトチャンネル11マスク（M11）内で識別されたakマスクを生成する。 図4は、抗LC3-AF647で標識した対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのスポットカウントヒストグラムおよび平均スポットカウントの代表的な画像を示す。コントロールスポットと飢えた平均スポット数は大きく異なるわけではありません。クロロキンの添加により、飢餓+クロロキンと比較して、対照+クロロキンの平均に大きな差がある。 調査する次の機能はBDC3です。 BDC3は、3つのマーカー/プローブ（この場合、LC3、p62、およびLAMP1）の共局在化の測定値である。 図 5A〜5Dは、抗p62-AF488で標識された対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのBDC3ヒストグラムを示す、抗LAMP1-PE、および抗LC3-AF647が挙げられる。 Control + MeaningとControl + ChloroquineはStarved + Chloroquineの平均値に差があります。しかし、 図5Eにおける平均BDC3スコアからの細胞の画像を見- 5H、信じるために1つをもたらし得るヒストグラムよりもサンプル間の大きな違いがあります。これは、BDC3は、同じBDC3スコアについて、自己貪食細胞の数の大きな程度の変動をもたらす、共局在する自己貪食細胞小器官の数を考慮しないためである。ほとんどの場合、基底レベルでさえ、p62、LAMP1、およびLC3はある程度、細胞内の同様の領域に共局在または存在すべきであるため、3つのプローブの間に重複が存在する。対照的に、共局在すべきではない3つのプローブの例は、 図6に示すStarved + Chloroquineサンプルの抗p62-AF488、抗LC3-AF647、およびDAPI核色素である。/ p&gt; スポットカウント機能とBDC3機能を組み合わせると、様々なサンプル/条件を区別する能力を向上させる異なるサブポピュレーションの存在が明らかです。 図7は、対照、対照+クロロキン、飢餓、および飢餓+クロロキンの4つのサンプルについて、LC3対BDC3p62 / LAMP1 / LC3のスポットカウントの二変量プロットを示す。 Controlサンプルを使用して、低点、高点/低BDC3、高点/高BDC3の3つの集団のゲーティング戦略を設定しました。対照試料は、細胞の98％より多くが1つ以下のスポットを有することを実証した。 High Spots / Low BDC3とHigh Spots / High BDC3の境界は、対照サンプルの91％以上が1未満のBDC3スコアを有するため、BDC3スコアが1に設定された。二変量プロットの結果の要約表1に示す。 age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> 図1：MIFC計測器の設定この実験で使用されたMIFC計測器設定のスクリーンショット（プロトコルのステップ8で概説）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> 図2：分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのステップ9で概説された分析ソフトウェアゲーティングスキームのスクリーンショット。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：LC3スポットマスキングスポットカウント機能を作成するために使用されるJurkatセル画像とマスク。 BrightField（BF）、LC3-AF647、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、2）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、4）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647 、Bright（5）、Spot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、5,3,1）、およびSpot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、6,2,1）である。表示されたすべてのセルで最も効果的なマスクはPeak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）でした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> 図4：LC3スポットカウントヒストグラム対照（ A 、薄青色）のスポットカウント機能Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4およびLC3-AF647スポットカウントヒストグラムを使用して、Control + Chloroquine（ B 、青）、飢えている（ C 、ピンク）、飢えた+クロロキン（ D 、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均スポット数は、それぞれ0.07,1.33,0.10および2.77である。コントロールスポット（ Eスポット、0スポット）、コントロール+クロロキン（ Bスポット）、 Bスポット、LC3-AF647（赤色）、DAPI核染料（青色）、および平均スポットカウントの代表的な細胞のLC3-AF647およびDAPI画像F 、1スポット）、飢餓状態（ G 、0スポット）、および飢餓+クロロキン（ H 、3スポット）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> 図5：p62 / LAMP1 / LC3のBDC3ヒストグラム。 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3のヒストグラムRコントロール（A、ライトブルー）、コントロール+クロロキン（B、青）、スターブド（ピンクC）、及び飢餓+クロロキン（D、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均BDC3スコアは、それぞれ0.57,0.82,0.74および0.98である。 BF; p62-AF488（緑色）。 LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Control（ E ）、Control + Chloroquine（ F ）、Starved（ G ）、およびStarved + Chloroquineについての代表的な細胞のp62-AF488、LAMP1-PE、およびLC3-AF647画像の複合体が示されているH ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> 図6：p62 / LのBDC3ヒストグラム餓死+クロロキンサンプルのC3 / DAPI。 （ A ）Starved + ChloroquineサンプルのBDC3 p62 / LC3 / DAPIヒストグラムが示されている。平均BDC3スコアは0.07である。 （ B ）BF; p62-AF488（緑色）。 LC3-AF647（赤色）; DAPI（青色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、平均BDC3についての代表的な細胞のp62-AF488、LC3-AF647、およびDAPI画像の複合体が示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> 図7：BDC3 p62 / LAMP1 / LC3に対するLC3スポット数の二変量プロット。 （ A ）Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquine Jurkat細胞に対するLC3スポット数対BDC3 p62 / LAMP1 / LC3の二変量プロット。 （ B ）BF; p62-AF488（緑）; LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、3つの領域（ すなわち、低スポット、高スポット/低BDC3、高スポット/高BDC3）からのp62-AF488、LAMP1-PEおよびLC3-AF647画像の複合体が示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>細胞数</td><td>明るい詳細Colocalization 3平均</td><td>スポットカウントLC3 Mean </td><td>低スポット％ </td><td>ハイスポット/ローBDC3％ </td><td>ハイスポット/ハイBDC3％ </td></tr><tr><td>コントロール</td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td>対照+クロロキン</td><td> 1432年</td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td>飢えた</td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td>飢えた+クロロキン</td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> 表1：Jurkat LC3スポット数対 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3二変量プロットのまとめ

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

本実験の全体的な目的は、客観的、定量的、かつ統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定するため、LC3 punctaの定量化と併せて、3つのオートファジーマーカーの共局在を定量化することです。この手法により、単一のアッセイで3つのオートファジーマーカーの共局在を測定することが可能となり、オートファジーの誘導および調節に関する新たな知見が得られる可能性があります。本技術の主な利点は、3つのオートファジーマーカーを、客観的、定量的、かつ統計的に堅牢な方法で同時に測定できることです。まず、適切なサンプル名を記入した個別の15 mL遠心チューブに、2×10⁶個のJurkat細胞を加えてください。次に、各サンプルの最終容量が15 mLになるまで洗浄バッファーを加え、遠心分離によってサンプルをペレット化します。ペレットを100 µLの4%ホルマリンで再懸濁し、ラベルを貼ったシリコン処理ポリプロピレン製マイクロ遠心チューブにサンプルを移します。室温で10分間放置した後、1 mLの新鮮な洗浄バッファーでサンプルを洗浄します。ペレットを、透過化バッファーで希釈した100 µLの目的の一次抗体で再懸濁し、室温かつ遮光条件下で30分間インキュベートします。標識および透過化処理を施した細胞を1 mLの新鮮な透過化バッファーで洗浄し、先ほど示した方法と同様に、次の目的の抗体で標識します。すべてのサンプルを最終抗体でラベルした後、ペレットを1%ホルマリン溶液で再懸濁し、続いて10 µLの10x DAPI核染色剤を加えます。軽くボルテックスして細胞を混合し、遮光した状態で室温で10分間インキュベートします。インキュベーション終了後、マルチスペクトルイメージングフローサイトメーターにデフォルトテンプレートをロードし、適切なレーザーを選択します。各レーザーボタンの横にあるウィンドウに希望のレーザー出力を入力し、ロードボタンをクリックして1.5 milliliterチューブを装置にロードします。全集団に対してarea M01対aspect ratio M01のドットプロットを作成し、細胞の周囲に領域を描画します。この領域にCellと名前を付けます。取得パラメータを設定します。保存先フォルダとファイル名を指定し、イベント数を5,000に変更して、セル集団を選択し、「acquire」をクリックしてファイルを取得します。その後、同様のレーザー設定で、デモンストレーション通りに残りのサンプルを測定します。ファイルの取得後、「return」をクリックしてサンプルチューブを回収します。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーデータを解析するには、イメージング解析ソフトウェアで [start analysis] をクリックしてオープンファイルウィザードを実行し、次にアポトーシスウィザードのアイコンと [select wizard] ボタンをクリックしてアポトーシスウィザードを開きます。すべてのアポトーシス細胞を解析から除外した後、非アポトーシス細胞を囲む領域を作成し、この細胞集団に「cells」というラベルを付けます。次に、ビルディングブロックのアイコンをクリックします。単色で蛍光陽性細胞を選択し、細胞集団とMCチャンネル3の強度を選択します。X軸にlamp 1の強度というラベルを付け、強度が10,000以上の細胞を含む領域を描画します。この領域にlamp 1陽性とラベルを付けます。同様にP62陽性細胞およびLC3陽性細胞をゲーティングした後、「analysis」タブをクリックし、「mask」を選択します。「new」をクリックし、次に「function」をクリックします。「function」の下で、「peak」を選択します。マスクでM11を選択します。チャンネルでチャンネル11を選択します。スポット対細胞背景比を4に設定します。次に [OK] をクリックして定義済みマスク関数のウィンドウを閉じ、続いて [OK] をクリックしてマスクをマスクリストに追加します。[Close] をクリックしてマスクマネージャーを終了し、再度 [Analysis] タブをクリックして [Features] を選択します。[New] をクリックします。「feature type」の下で「spot count」を選択し、作成したばかりの「peak mask」を選択します。名前に「spot count LC3」と入力し、「okay」をクリックします。再び「new」をクリックします。「feature type」で「bright detail colocalization three」または「BDC3」を選択します。「mask」で「MC」を選択します。「image one」で、P62に対応する「channel two」を選択します。「image two」で、lamp oneに対応する「channel three」を選択します。画像3の下で、LC3用にチャンネル11を選択します。名称にBDC3p62/LAMP1/LC3と入力し、OKをクリックしてフィーチャーマネージャーを閉じます。新しい散布図アイコンをクリックし、LAMP1陽性、p62陽性、LC3陽性の集団を選択します。X軸にBDC3/p62/LAMP1/LC3を、Y軸にスポットカウントLC3機能を選択し、OKをクリックします。ファイルメニューから「データ解析ファイルの保存」を選択し、「保存」および「はい」をクリックして、飢餓およびクロロキン添加データをデータ解析ファイルとして保存し、旧バージョンのファイルを上書きします。次にコントロールファイルを開き、適切な補正マトリックスと、テンプレートとして飢餓およびクロロキン添加のデータ解析ファイルを選択します。OKをクリックします。オートファゴソーム蓄積およびオートリソソーム蓄積の領域を作成するため、コントロールサンプルを開き、X軸座標0.1から3まで、およびY軸座標1.5から0.3までを囲む矩形領域を描画します。この領域をlow spotsと命名します。次に、X軸座標0.1から1、Y軸座標17.5から1.5の範囲に領域を描き、この領域を「high spot low BDC3」と命名します。続いて、X軸座標1から3、Y軸座標17.5から1.5の範囲に領域を描き、この領域を「high spots/high BDC3」と命名します。コントロールファイルを保存してテンプレートとして使用できるようにし、その後、前述の手順に従ってコントロールファイルをテンプレートとして用い、starved plus chloroquineファイルを含む他のファイルを開きます。異なるスポットマスクを用いてJurkat細胞におけるLC3 punctaのスポットマスキングを行った結果、これらの細胞間でLC3 punctaのサイズ、形状、および輝度が大きく異なることが観察されます。この実験で最も効果的だったマスクは、スポットと細胞背景の比率が4のピークでした。anti-LC3で標識したJurkat細胞の代表的なスポットカウントにおいて、コントロール群と飢餓群の平均スポット数に有意な差は見られません。クロロキンを添加すると、コントロールにクロロキンを加えた群の平均値と、飢餓状態にクロロキンを加えた群の平均値との間に大きな差が観察されます。本実験では、測定されたコントロール群のBDC3共局在平均値から飢餓群の平均値へのシフト、およびコントロール＋クロロキン群の平均値から飢餓＋クロロキン群の平均値へのシフトが認められました。BDC3は共局在するオートファジー細胞小器官の数を考慮しないため、同一のBDC3スコアであってもオートファゴゾームの数に大きなばらつきが生じます。実際、BEYZAレベルであっても、p62、LAMP1、およびLC3はある程度細胞内の類似した領域に共局在するため、ほとんどの場合、3つのプローブすべてにオーバーラップが見られます。対照として、共局在しないはずの3つのプローブ（P62、LC3、およびDAPI）におけるBDC3機能の例を以下に示します。スポット数とBDC3機能（特徴量）を組み合わせることで、さまざまなサンプルや条件間の識別能力を向上させる異なるサブポピュレーションの存在が明らかになります。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、約8時間で完了させることができます。ただし、異なるスポット数のカウント機能が必要な場合は、さらに分析時間が必要になります。本手順を試みる際は、適切なコントロール（対照）を使用することを忘れないでください。例えば、コントロールサンプルを用いてBeyzaレベルの閾値を設定し、コントロールにクロロキンを加えたサンプルを飢餓状態にクロロキンを加えたサンプルの対照として使用します。この手順は、対象となる抗体を適切に変更するだけで、3つの異なるマーカーの共局在を必要とする他の細胞内アプリケーションにも適用可能です。このビデオを視聴することで、オートファジーマーカーによる細胞の標識方法、マルチスペクトルイメージングフローサイトメーターによるデータの取得方法、およびオートファジーフラックスを評価するためのデータ解析方法について十分に理解できるはずです。ホルマリンを取り扱う際は極めて危険であるため、本手順を実施する間は、常に適切な個人用保護具を着用するなど、十分な予防措置を講じてください。

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。...

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。...

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH)...

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

オートファジーとマウス肝臓のプロテアソームを介してタンパク質異化の生体リズムを測定するための我々のプロトコルを説明する.

オートプハギックとプロテアソームフラックスにおける日のリズムの測定

マイトファジーは、ミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムです。しかしながら、 in vivoでの マイトファジーの評価は、信頼できる定量アッセイの欠如によって妨げられている。ここでは、細胞透過性の緑色蛍光ミトコンドリア色素と赤色蛍光リソソーム色素を使用して、生細胞内のマイトファジーを観察するためのプロトコルを紹介します。...

ミトコンドリアとリソソームの蛍光色素によるマイトファジーの可視化

このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。...

LC3免疫蛍光を用いた2つの異なる膵臓細胞モデルにおけるオートファジーレベルの評価(英語)

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

ここでは、イムノブロッティングにより細胞外小胞(EV)中のオートファゴソームマーカーLC3-IIレベルを簡潔に評価するための方法論を紹介します。EVのLC3-IIレベル、オートリソソーム形成、オメガソーム形成の解析により、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害された場合のLC3-II陽性EVの放出におけるSTX6の新たな役割が示唆されました。...

細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 -...

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

学ぶマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるLC3、p62、LAMP1の共局在解析法。Jurkat細胞を用いた定量的オートファジー評価で、客観的かつ統計的に厳密なオートファジーフラックス測定が可能です。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

さらに動画を探す