体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

模擬微小重力下におけるマウス前胞状卵胞のin vitro育成。全手順は4つのパートに分かれます。パート1では、実体顕微鏡下で針を用いて卵巣から卵胞を機械的に単離します。

第2部では、単一の卵胞を各アルギン酸ビーズの中央にピペッティングし、封入します。第3部では、単一卵胞を含むアルギン酸ビーズを、模擬微小重力を生成する回転培養システムの培養液滴へと移送します。第4部では、アルギン酸ビーズを回収し、Alginate lyaseを添加した培地中で37°C、30分間インキュベートすることで、アルギン酸ビーズから卵胞を脱封入します。

卵胞の単離およびカプセル化。ハンドリング培地を用いて卵巣を回収し、さらにセンターウェルプレートに卵巣を配置する。実体顕微鏡下で、2本の針を用いて卵巣から卵胞を単離する。

血管膜を損傷させないように注意してください。培地を滴下したディッシュを用意し、オイルで覆います。卵胞を準備したディッシュに移します。

濾胞を新しい培地で洗浄し、培地のドロップレットに転移させます。培地1ドロップレットにつき1つの濾胞を配置します。センタードカルチャーディッシュを準備し、外周のサークルに封入溶液を加えます。

0.8%アルギン酸溶液をバイアルで調製します。ディッシュの中央にアルギン酸溶液を0.5 µL分注します。ディッシュの外側の円形領域にある封入溶液に、アルギン酸溶液を滴下します。

濾胞をディッシュ中央のアルギン酸溶液に移動させます。濾胞をアルギン酸溶液で洗浄します。溶液の柔らかい表面を通じて、各アルギン酸ビーズの中央に濾胞を移動させます。

各アルギン酸ビーズには単一の濾胞が含まれています。カプセル化溶液でアルギン酸ビーズを洗浄し、ビーズを凝固させます。その後、アルギン酸ビーズをハンドリング培地が入った新しいディッシュに移します。

擬似微小重力処理下でのカプセル化卵胞のin vitro培養。コントロール群について、新しいディッシュに150 milliliterの培養液を加え、オイルで覆う。3つのアルギン酸ビーズを培養液滴の中へ移す。

培養のため、ディッシュを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートします。模擬微小重力処理を行う場合は、オイルを入れたディッシュを準備し、ポートキャップを取り外し、容器がほぼ満たされるまで、開いたポートからオイルを注入します。オイルに50 milliterの培地を1つ加えます。

3個のアルギン酸ビーズを培地ドロップへと転移させます。オープンポートキャップを閉めます。容器内の気泡は完全に取り除いてください。

シリンジポートのキャップを取り除きます。オイルを入れた2本のシリンジをシリンジポートに装着します。シリンジポートの下にある気泡を追い出します。

気泡をシリンジ内に吸い出し、別のシリンジから同量のオイルを注入します。容器内に気泡が残っていないことを確認してください。バルブを閉じ、シリンジを取り外して、シリンジポートキャップを付け直します。

アルギン酸ビーズを入れた4つの容器の準備が完了しました。次に、これらの容器を回転ベースに固定します。培地液滴が平衡状態になるまで、回転速度を調整してください。

容器とベースの両方を、培養用の二酸化炭素インキュベーターに移します。培地を交換します。オープンポートキャップを取り外し、アルギン酸ビーズとオイルを新しいディッシュに回収します。

アルギン酸ビーズを探し出し、ハンドリング培地を入れたディッシュに移します。前回と同様に血管培養システムを再構築します。卵胞を回収します。

オープンポートキャップを取り外し、アルギン酸ビーズとオイルを新しいディッシュに回収します。アルギン酸リアーゼを添加したハンドリング培地中で37°Cで30分間インキュベートし、アルギン酸ビーズからアルギン酸ビーズおよび脱カプセル化した卵胞を回収します。結果：細胞生存率アッセイの結果、正常重力条件下で培養した単一卵胞は、模擬微小重力条件下で培養した卵胞よりも生存細胞が多く、死細胞が少ないことが示されました。

どちらの重力条件下においても、卵胞サイズは有意に増加しました。結論。本手法は、模擬微小重力条件下における卵母細胞および顆粒膜細胞のin vitroでの発生プロセスに関与するメカニズムを研究するためのモデルを提供します。