Name: 心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ心筋細胞を用いた自己安定化バイオロボットの作製法。PDMSカンチレーバーと複合材料ベースの構築により、浮力と磁気特性を制御し、生体ハイブリッドロボットの開発に応用可能です。

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MT HolleyはLouisiana Board of RegentsのGraduate Fellowsプログラムによって支持されており、C. DanielsonはHoward Hughes Medical Institute教授プログラムの支援を受けています。この研究は、NSFグラント番号：1530884で支持されています。著者は、先端微細構造デバイスセンター（CAMD）のクリーンルームのサポートに感謝したいと思います。

PDMSと添加剤の質量を計算する<ol><li>以下の式を使用して、以下の手順で特定の高さに必要なPDMSの質量を求めます。 M =ρ* V =ρ*高さ*面積（1）、 「高さ」は層の高さ、「面積」はPDMSが硬化する容器の面積、「ρ」は混合物の密度、「V」は体積である。 注：高さ計算の密度は、PDMS = 0.965g / mL、Ni-PDMS = 1.639g / mL、MB-PDMS = 0.648g / mLである。 </li><li>式（1）を用いて、生物学的アクチュエータの基部の特定の高さ（5mm）を得るために所与の容器に対して必要とされるPDMSの質量を推定する。得られるPDMSの密度は0.965g / mLである。 注記：比率は硬化剤対重量比で10：1です。 M base =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq1.jpg" /> ）（2） M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq2.jpg" /> ） </li><li>式（1）を用いて、所定の容器について、ビオロボの底部の特定の高さ（1.5mm）を得るのに必要なNi-PDMSの質量を求める。 注：比は1：1.88（ニッケル粉末対PDMS重量）および1：1.71：0.171（PDMSベースからPDMS硬化剤へのニッケル粉末の質量）。得られるNi-PDMSの密度は1.639g / mLとなる。 M ニッケル =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq3.jpg" /> ）（3） M base =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq4.jpg" /> ） M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq5.jpg" /> ） </li><li>同様に、式（1）~f<html>特定の容器について、ビオロボの上部基部の特定の高さ（3.5mm）を得るのに必要なMB-PDMSの質量を表示する。 注：比は1：5（マイクロバルーンからPDMS重量）および1：4.54：0.454（PDMSベースからPDMS硬化剤へのマイクロバルーンから重量）です。得られるMB-PDMSの密度は0.648g / mLとなる。 M Microballoon =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq6.jpg" /> ）（4） M base =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq7.jpg" /> ） M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq8.jpg" /> ） </li><li> biorobotの動的安定性を、分析スクリプトを使用して所望の寸法とジオメトリでチェックします。補足情報、「Biorobot_dynamic_stability.m」および「CG_CB_calculation.m」を参照してください。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。静止した基盤上の生物学的アクチュエータの製作注記：図1aを参照してください。 <ol><li> PDMSの薄膜をスピンコートします（図1a-1およびa2参照）。得られるPDMSフィルムの厚さは25μmである。 <ol><li>フォトレジストスピナーにシリコンウェーハを置き、ポンプスイッチをオンにして吸引します。 注：シリコンウェーハは、直径4インチ、厚さ500μmです。 </li><li>ウェハが完全に覆われるまで、ポジ型フォトレジスト（ 例えば、 S1808）をシリコンウェハ上に注ぐ。 20秒間2,000rpmで回転するようにスピナーをプログラムする。次に、フットペダルを踏んでスピナーを係止します。回転後吸引を止める。 </li><li>ホットプレートを120℃まで加熱します。ウェーハピンセットを使用してスピンナーからシリコンウェーハをピックアップし、シリコンウェーハをホットプレート上に直接配置します。ウェーハを浅いペトリ皿で覆い、10分間ベークする。 注：オーブンを使用してbaにすることができます同じ温度および時間を使用してウェハを洗浄する。 図1a-1にこのプロセスを示します。 </li><li>プラスチック容器を計量台に置き、ゼロにします。容器にPDMSベース6gを注ぎ、PDMS硬化剤0.6gを加える。 PDMSを5分間完全に混合する。 注：混合後、混合物は気泡とコンフルエントになるはずです。 </li><li>混合したPDMSの容器を真空チャンバーに入れる。真空チャンバの圧力を100ミリバールに下げ、容器をチャンバ内に30分間放置する。真空を壊し、容器を取り除く。使用するまで容器を覆ったままにしておきます。 </li><li>ベーキングされたフォトレジスト層を有するシリコンウェハをスピナー上に置く。ゆっくりとウェーハ上に脱気したPDMS混合物を注ぎます。 注：新しい泡が混合物に導入されないようにゆっくりと注ぎます。 </li><li>スピナーを1,200rpmに5分間セットする。スピナーの吸引をオンにし、スピナーを使用します。回転後吸引を止める。 注：T厚さの設定は、PDMSの厚さ25μmの層をもたらす。 </li><li>オーブンを40℃に加熱する。ウェハーピンセットを使用してスピナーからシリコンウェーハを取り出し、オーブンに入れます。ウェハを一晩焼き、次に室温でウェハを冷却する。 注： 図1a-2にこのプロセスを示します。 </li></ol></li><li> 薄膜PDMS層のレーザー彫刻。 <ol><li>レーザー彫刻機の電源スイッチとその排気口を入れます。レーザー彫刻機に接続されたコンピュータの電源を入れます。レーザー彫刻ソフトを開きます。 </li><li> 「ファイル」オプションの下で、図2eに示す生物学的アクチュエータ設計ファイルを開きます。 <ol><li> 「設定」ボタンを押します。 「青」をクリックし、電源設定を3％に変更し、速度を4％に変更します。 「設定」をクリックします。 「黒」をクリックし、「モード」をスキップするように変更します。次に、「設定」をクリックします。 「赤」についても同じことをします。 「適用」ボタンを押して終了する設定。 &quot; </li><li>右上にある「彫刻機の起動」ボタンを押します。 </li></ol></li><li> 「再配置」ボタンを押すと、デザインがソフトウェアの画面の中央に移動します。 </li><li>プログラムの &quot;Focus View&quot;ボタンを押し、画面上のbiorobotの端をクリックします。これにより、レーザー刻印機のガイディングレーザードットが対応するポイントに移動します。 </li><li> 2.2.4でクリックしたポイントに対応するウェーハ上のポイントがガイドレーザードットの直下に来るように、ピンセットで手動でウェーハを移動します。 </li><li> &quot;彫刻を開始する&quot;ボタンを押して、彫刻プロセスを開始します。彫刻が完了したら、ウェーハを取り出します。すべての機器の電源を切ります。 注：「前のジョブの彫刻を開始する」ボタンは、大きな緑の三角です。レーザーが目を損傷する可能性があるため、彫刻プロセスを直接見てはいけません。 図1a-3にこのプロセスを示します。 </li&gt; </ol></li><li> 生物学的アクチュエータベースの調製および製造。 <ol><li>ガラスビーズ（直径3 mm）を15 mLチューブに注ぎます。ビーズを脱イオン水に70％エタノールで24時間浸します。エタノールを除去し、DI水で24時間チューブを満たしてください。 DI水を注ぎ、チューブを50℃のホットプレート上に置き、ガラスビーズの乾燥を促進します。 </li><li>注入中に容器の側面に粘着するPDMSを説明するために、式（1）に見られるPDMSの量に3gを加える。式（2）を使用して、PDMSベースおよび硬化剤の量を求める。 </li><li>プラスチック容器を計量台に置き、ゼロにします。ステップ2.3.2で見つかったPDMSベースの量を容器に注ぎ、ゼロにします。次に、ステップ2.3.2で見つかった量のPDMS硬化剤を容器に注ぎます。 </li><li> PDMSを5分間完全に混合する。 注記：PDMSは硬化剤に対して10：1の割合で使用されます。混合物は多くの気泡を有するべきである。 </li><li>場所スケールで焼くために使用される容器で、ゼロを出します。慎重に、ステップ2.3.2で見つけられた（そしてステップ2.3.4で混合された）PDMSの正しい量を容器に注ぎます。洗浄したガラスビーズを定期的にPDMS混合物全体に滴下する。生物学的アクチュエータベースのための各ビーズを囲むスペースは、少なくとも5mm以上離してください。 </li><li>容器を真空チャンバー内に置く。真空圧力を100 mbarに減圧し、真空ポンプを停止します。 30分後、真空を破って容器を取り出します。使用までカバーしてください。 注：チャンバー内の圧力は、混合物が脱気され、真空チャンバーがリークすると、時間の経過と共にゆっくりと上昇することがあります。圧力が100ミリバールを大幅に上回る場合は、真空ポンプをオンにして圧力を100 mbarに戻します。 </li><li>ホットプレートを40℃に加熱する。慎重にPDMSの容器とガラスビーズをホットプレート上に置きます。容器を覆い、一晩焼く。 </li></ol></li><li> 生物学的アクチュエータアセンブリ。 </stロング&gt; 注：次の手順は肉眼で行うことができます。 <ol><li>剃刀を使用して、パート2.3で作成したバルクPDMSから立方体（5 mm x 5 mm x 5 mm）を切り取ってください。 注：1つのビーズが各キューブの中央にある必要があります。 </li><li>ベースをテープに押し込んで取り除くことによって、ベースプレート表面の汚染物質を除去するために、各生物学的アクチュエータベースのすべての側面を清掃してください。それぞれの面を繰り返します。 </li><li>少量の液体PDMSを作るために2.3.2から2.3.6までの手順をやり直してください。針の先端を液体PDMSに浸す。ステップ2.2でパターン化されたウエハの彫刻されたベース領域上に液体PDMSを滴下する。 5mm×5mmのベース領域を完全に覆うように、PDMSの液滴を汚す。 注：基本領域は、 図2aの中央の正方形のセクションです。 </li><li>ピンセットを使用して、液体PDMSで覆われたベースエリアにステップ2.4.2の清掃された立方体を置きます。 </li><li> 「液体PDMSの滴を1つ置きにする」の手順2.4.3をend、および2.4.4項を参照してください。 </li><li>ホットプレートを40℃に加熱する。シリコンウェーハを注意深くホットプレート上に配置します。ウェーハを覆い、一晩焼きます。 注：使用するまでアセンブリを取り付けたままにしておきます。 図1a-4に最終デバイスを示します。 </li></ol></li></ol> 3.ビオロボットの作製（図1b） <ol><li> 薄いPDMSフィルムのスピンコーティングとレーザー彫刻 <ol><li>新しいシリコンウェーハを使用して、2.1および2.2のすべての手順を繰り返します。これにより、PDMSの薄膜とフォトリソグラフィーの薄膜が形成されたシリコンウェーハが得られ、ビオロボ設計で彫刻される。 注記：ステップ2.2を繰り返しながら、以前に使用した生物学的アクチュエータ設計ではなく、レーザー彫刻用のビオロボーデザインを使用します。 図1b-1およびb-3は、これらのプロセスを示す。 </li></ol></li><li> PDMSコンポの準備と製造サイト。 注：次の手順は肉眼で行うことができます。 <ol><li>フェノールマイクロバルーンを50 mLチューブにフルになるまで注ぎます。 DI水中の70％エタノールで管を満たし、24時間放置する。エタノールを注ぎ、脱イオン水を加え、24時間放置する。 DI水を注ぎ、チューブを50℃のホットプレート上に置き、使用前にマイクロバルーンの乾燥を容易にします。 </li><li>必要なPDMSの量を見出すために、MB-PDMS密度と3.5mmの高さとの式（1）を使用する。注入後に容器に残る材料を考慮して、総量に3gを加えます。式（3）を使用して、PDMSベースおよび硬化剤の量を見つける。スケールを使用してPDMSベース、硬化剤、およびマイクロバルーンの適切な量を測定する。 </li><li> Ni-PDMS密度と1.5mmの高さの式（1）を使用して、必要なPDMSの量を求めます。ステップ3.2.2のように全量に3gを加える。式（2）を使用してPDMSベースを見つけ、金額。スケールを使用してPDMSベース、硬化剤、およびニッケルパウダーの適切な量を測定する。 </li><li> MB-PDMSおよびNi-PDMSの各混合物を5分間混合する。 3.2.2と3.2.3で計算された正しい量のMB-PDMSとNi-PDMSを秤を使って別々の容器に慎重に注ぎます。 注：混合物は、混合容器の底面を傷つけることなく、金属またはガラスロッドによって完全に混合されるべきである。混合物は気泡と合流する。 </li><li>両方の容器を真空チャンバーに入れます。圧力を100 mbarに30分間低下させます。真空を解除して容器を取り除く。使用までカバーしてください。 </li><li>ホットプレートを40℃に加熱する。 MB-PDMSとNi-PDMSを入れた容器をホットプレートに置きます。各容器を覆い、一晩焼く。 注：使用するまで蓋を付けて保管してください。 </li></ol></li><li> バイオロボットアセンブリ。 <ol><li> Ni-Pから各ビオロボサイズに対応する寸法のビオロボベースを切断するDMSおよびMB-PDMSを使用しています。ベースデザインについては、 図2b-2dを参照してください。 注：Ni-PDMSの厚さは1.5 mmで、MB-PDMSの厚さは3.5 mmです。 </li><li>ビオロボットベースのすべての側面を清掃して、ベースにテープを押し付けて取り除くことで、表面の汚れを取り除きます。それぞれの面を繰り返します。 </li><li>コロナ放電器をオンにします。コロナ放電器の先端をクリーンルームティッシュを挟んで金属板の上に置かれたNi-PDMSベースの上に1cmほど持ちます。先端をベースの周りに動かし、表面を処理するために15秒間続ける。 注：コロナ放電器とウェハの間で放電が発生するはずです。そうでない場合は、放電が発生するまでチップを近づけてください。 </li><li>ステップ3.3.3を繰り返して、ステップ3.1で彫刻したビオロボの底面を同じ時間処理する。ピンセットを使用してNi-PDMS処理面をフィルムの処理面に置く。装置を5分間放置させる。 注：これはストロン2つの部分を結合する。 図1b4を参照してください。 </li><li>シャープなピンセットを使用して、biorobotカンチレバーをウェーハから剥がし、Ni-PDMSベースの底に置きます。ピンセットを使用して、アセンブリ全体をウェーハから取り外します。 注記：カンチレバーはNi-PDMSベースに取り付けられます。 図1b-5および図 b-6はこれを示しています。 </li><li> MB-PDMSベースの上部に、硬化していないPDMS（硬化剤に10：1の塩基）を少し滴下します。ピンセットを使用して、未硬化PDMSを有するMB-PDMS上の薄膜PDMSを有するNi-PDMSの側面を配置する。アセンブリをプラスチックのペトリ皿に置き、40℃のホットプレート上に置き、一晩硬化させます。 注： 図1b-7に最終デバイスを示します。 </li></ol></li></ol> 4.デバイスの機能化注：以下では、細胞播種のための装置を調製するプロセスを説明する。 <ol><li>準備フィブロネクチン溶液（50μg/ mL）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％ペニシリン抗生物質（DMEM完全）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）が必要である。 </li><li>フィブロネクチン溶液100μLをT-25培養フラスコ（フラスコが直立しているときの底面）の中央に置く。各装置のために別々のフラスコを維持する。 </li><li>バイオロボットまたは生物学的アクチュエータをフィブロネクチン溶液の液滴の上に下に置く。カンチレバーが展開され、液滴に浸されていることを確認します。 37℃で30分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を除去し、PBSで2回洗浄する。 </li><li> PBSを除去し、10mLのDMEMをフラスコに充填する。 37℃で1時間インキュベートし、PDMSの脱気を促進する。ビオロボットを10 mLの培地に浸すには、磁石を使用して装置をフラスコの底に保持します。フラスコをサムに置きます超音波処理浴に5分間吹き込み、気泡を除去する。 注：インキュベーション期間中、気泡がPDMS表面に形成されます。これはここでは脱気と呼ばれます。ビオロボアセンブリに使用されるNi-PDMSは磁性である。生物学的アクチュエータは、ガラスビーズの重量のためにフラスコの底に残るため、磁石を必要としない。バイオロボットまたは生物学的アクチュエータアセンブリは、ここでパート2で詳細に説明するシーディングの準備が整いました。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示していない

水泳選手の間では様々な移動機構が見られます16 。この研究でのビオロボの運動機構は、フィンベースの運動、具体的には並置運動を使用する。騎乗的な水泳者は、尾を振って（片持ち）、剛体（層状の基部） 16を持って自らを推進します。ボクフやカウフィッシュなどの魚は、このタイプの移動を使用します。扇動的なスイマーは、典型的には遅く、非効率な体格を有する。奇妙な泳ぎには速度がありませんが、このような泳ぎはエンジニアがさまざまな機能（動的安定性など）をベースまたはボディに実装できるようにします。この研究で開発されたビオロボット設計は、推進機構として自己作動カンチレバーを用いて、浮揚と安定性のための頑強な基盤に基づいている。この研究でのビオロボットの製造における最も重要なステップの1つは、薄膜PDMSおよびレーザー彫刻プロセスであって、レバー。クリーンなカンチレバーがなければ、PDMS（弾性）、正確な厚さ（バネ定数）、および寸法（動きを生じさせるための心筋細胞のコンフルエントな接着のための十分な面積を有する）の適切な混合物では、ビオロボットは作動しない。さら...

生物学的アクチュエータおよびバイオロボットは、従来のロボットに代わるものを多くの用途に提供するために積極的に研究されている。歩く5,6,7,8、スイム1,2,3,4 、ポンプ9,10 、またはグリップ11,12,13を歩くボルボボット すでに開発されている。同様に、筋肉細胞は3D圧延PDMS構造14に組み込むことができる。しばしば、ビオロボ骨格は、ヒドロゲルおよびPDMS（ポリジメチルシロキサン）などの材料を用いたソフトリソグラフィ技術を用いて製造される。これらは、その柔軟性のために魅力的な選択肢です、biocompatib柔軟性、および容易に調整可能な剛性。生活筋肉細胞は、収縮による力発生を提供するために、通常、これらの材料と組み合わされる。哺乳動物の心筋細胞（心筋細胞）および骨格筋細胞が、主に作動のために使用されている。これらの2つの他に、昆虫の筋肉組織は、室温でビオロボットを操作するために使用されている3 。この2回の研究では、自発収縮のために心筋細胞を選択した6 。 ビオロボに関する初期の研究の多くは、生物学的アクチュエータの開発に焦点を当てていたが、ビオロボー構造の最適化とビオロボットの本質的機能の開発は、ほとんど無視されていた。最近、いくつかの報告は、自然界に見られる推進モードに触発された様々な水泳モードの実施を実証した。これらの方法は、様々な天然推進方法を模倣するためにPDMSフィルムおよび筋肉細胞を組み込む。例えば、鞭毛ベースの推進1 、生体模倣のクラゲ推進2 、バイオハイブリッド光4 、および薄膜PDMS水泳装置13が報告されている。 本論文では、浸水深さとピッチとロールを維持できる自己安定水泳用ビオロボの製造プロセスを紹介する。ビオロボットは、その表面に付着した心筋細胞を有する単一のカンチレバーによって推進される固体の基体または本体を有する。心筋細胞は、収縮するとカンチレバーを縦方向に曲げる。この水泳の形態は、奇妙な水泳に分類されます。ベースに追加の機能を追加する機能は、奇妙な水泳のユニークな利点です。例えば、基部は、心筋細胞の収縮のために追加の貨物または制御回路を運ぶために余分な浮力を提供するために利用され得る。 安定以前に行われたビオロボの研究では、しばしば見落とされていました。この研究では、異なる質量密度の複合PDMS材料を用いてベースを設計することによって自己安定化を実現しました。このように、ビオロボットは外乱に対する耐性を示し、浸水深さ、ピッチおよびロールを助けずに維持する。第1の層はマイクロバルーンPDMS（MB-PDMS）、 すなわちマイクロバルーンと混合されたPDMSであり、これはビオロボットの密度を低下させ、媒体中に浮遊することを可能にする。第2の層は、PDMSカンチレバーであり、その厚さは、心筋細胞によって生成される力がカンチレバーを45°から90°まで劇的に曲げることができるように調整される。最下層はニッケル-PDMS（Ni-PDMS）、 すなわち PDMSとニッケル粉末を混合したものである。このレイヤーは複数の機能を実行します。それは磁気であり、従って、バイオロボットは、細胞の播種中に、磁石を用いて培地の底に固定することができる。ニッケル混合物はMB-PDMSよりも高密度であり、浮遊している間にビオロボの直立姿勢を確保します。この層の重量は、任意のピッチおよびロールでバイオロボットに復元トルクを生成する。また、Ni-PDMSとMB-PDMSとの体積比は浸漬深さを維持する。提示されたプロトコールは、筋細胞および組織の鼓動力ならびに水泳用ビオロボットを構築することを望む人々の鼓動力を特徴付けることに関心を持つ研究者にとって非常に有用であろう。 機能化された生物学的アクチュエータおよびバイオロボットデバイスのシーディング、細胞の機械的および生化学的特徴付け、およびデバイス機能の定量的分析は、この2部構成の論文のパート2および最近の研究15に詳細に記載されている。

<table><tbody><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>ダウコーニング</td><td>184 sil elastキット&nbsp; 0.5kg</td><td>シルガード184</td></tr><tr><td>ニッケル粉末</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>266981-100G</td><td></td></tr><tr><td>フェノールマイクロバルーン米国</td><td>複合材料</td><td>BJO-0930</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ4</td><td></td><td></td><td>インチ直径</td></tr><tr><td>PWM101軽量スピナー</td><td></td><td></td><td>スピンコーター</td></tr><tr><td>ポジフォトレジスト(S1808)</td><td>ダウコーニング</td><td>DEM-10018197</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空</td>チャンバーM206<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メカニカル対流オーブン</td><td></td><td></td><td>対流オーブン</td></tr><tr><td>レーザー彫刻機</td><td>ユニバーサルレーザーシステム</td><td>VLS2.30</td><td>は10 W、10.6 & microを利用。m波長、CO2レーザー</td></tr><tr><td>ユニバーサルレーザーシステム</td><td>VLS 2.30を実行するための</td><td>ユニバーサルレーザーシステム</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>数値解析プログラム</td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td>スコッチブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソリッドガラスビーズ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z265926-1EA</td><td>ソーダライムガラス、直径3 mm</td></tr><tr><td>スケール</td><td>メトラー・トレド</td><td>EL303</td><td></td></tr><tr><td>BD-20AC 実験室 コロナ処理機</td><td>電気技術製品</td><td>12051A</td><td>コロナ放電器</td></tr><tr><td>超音波浴 1.9 L</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>15-337-402</td><td>40 kHz 工業用トランスデューサ</td></tr><tr><td>ウシ血漿からのフィブロネクチン</td> シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ 'リン酸緩衝液(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'</td><td>4500 mg/Lのブドウ糖、4.0 mM L-グルタミン、および110 mg/Lのピルビン酸ナトリウムと</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>16750-074</td>の修正されたEagleの媒体(DMEM)Hycloneの実験室。</tr><tr><td>フェタルクロンIII血清</td><td>Hyclone Industries, GE</td><td>16777-240</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>ペニシリン-Gナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr></tbody></table>

心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

ビオロボットと呼ばれることが多い生物機械は、生きている成分の収縮活性のみによって駆動される、生きている細胞または組織ベースのデバイスである。その固有の利点のために、ビオロボは伝統的な完全人工ロボットの代替として関心を集めています。様々な研究が生物学的アクチュエータの力を利用することに焦点を当ててきたが、近年の研究では、ビオロボットの性能を定量的に特徴づけ、機能性と効率を高めるためにジオメトリを研究した。ここでは、外部からの介入なしにピッチ、深さ、ロールを維持できる自立型スイミングバイオロボットの開発を紹介します。生物学的アクチュエータおよびバイオロボットのためのPDMS足場の設計および製作に続いて、フィブロネクチンによる機能化がこの第1部に記載されている。この2部構成の記事の第2部では、心筋細胞の取り込みを詳述し、生物学的作用を特徴付けるatorとbiorobotの機能。両方とも、フィンベースの推進力を生成するベースとテール（カンチレバー）を組み込んでいます。テールは、PDMSとレーザー彫刻を使用してソフトリソグラフィ技術で構築されています。尾部をデバイス基部に組み込んだ後、それを細胞接着タンパク質で機能化し、心筋細胞とコンフルエントに播種する。生物学的アクチュエータの基部は、中央ガラスビーズ（重量として作用する）を有する固体PDMSブロックからなる。ビオロボットの基部は、2つの複合PDMS材料、Ni-PDMSおよびマイクロバルーン-PDMS（MB-PDMS）からなる。ニッケル粉末（Ni-PDMS中）は、細胞の播種中および移動中の安定性の間、バイオロボットの磁気制御を可能にする。 Microballoons（MB-PDMS）は、MB-PDMSの密度を低下させ、ビオロボットを浮動させて着実に泳ぐことを可能にする。異なる質量密度を有するこれらの2つの材料の使用は、重量分布に対する正確な制御を可能にして、ビオロボの任意の角度で確実な復元力を確保した。この技術磁気的に制御された自己安定型スイミングビオロボを生成する。

生物学的アクチュエータおよびバイオロボットは、バイオロボットが生物学的アクチュエータの自然な延長部であるので、非常に類似した製造プロセスを有する（ 図1 ）。生物学的アクチュエータは、最初に、バイオロボットに必要な技術を確立し、細胞によって生成された力を分析し、細胞熟成を機械的および生化学的に特徴づけるために開発された。私たちの最近の出版物15でもそうです。 アクチュエータのばね定数を評価し、心筋細胞シートが完全に収縮している間のカンチレバーの曲率半径の大きな変化について調整した。次に、ビオロボットを設計し、その安定性、細胞播種中の制御、および移動の容易性に特に配慮した。当初、いくつかのデザインが選択されました図2b-2dでは、どの属性が設計要件に最も寄与しているかを評価するために、異なる特性を用いている。ビオロボットは、短い、長い、およ...

この2部構成の研究では、非常に柔軟なポリジメチルシロキサン（PDMS）カンチレバーおよび生存筋細胞（心筋細胞）を用いて生物学的アクチュエータを開発し、特徴付けた。生物学的アクチュエータは、自己安定化したスイミングビオロボを構築するために、改変されたPDMS材料で作られた基材と組み合わされた。

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

このビデオの全体的な目標は、心筋細胞のフレキシブルPDMSカンチレバーを使用して生物学的アクチュエータを開発し、特性評価する方法を説明することです。これらのアクチュエーターは、自己安定化水泳バイオロボットを形成するために、変更されたベースに組み込まれます。ここで述べる検証方法は、機械的な基部構造を改変して自己安定化泳ぎバイオロボットを形成し、その位置を外部からも磁石で決定できるというユニークなものです。この手法の主な利点は、デバイスの浮力を調整し、自己安定化するために、基本特性を簡単に変更できることです。この方法は、自己安定化と浮選を必要とする他の新しいデバイスの開発に適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、カンチレバーを機械的に変形させることが難しいため、苦労するでしょう。サイズが薄いため、簡単に破れたり、奇妙な形に引っかかったりする可能性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、視覚的な支援なしにはステップと組み立てを学ぶのが難しいため、非常に重要です。まず、フォトレジストスピナーにシリコンウェーハを置きます。ウェーハに薄いフォトレジストを添加し、2, 000 RPMで20秒間スピンコートして、目標厚さ1.2マイクロメートルを取得します。次に、ウェーハピンセットを使用して、コーティングされたウェーハを摂氏120度に予熱したホットプレートに移します。ウエハースを浅いペトリー皿で覆い、10分間焼きます。6gのPDMSベースを計量し、0.6gのPDMS硬化剤と組み合わせます。PDMS成分を5分間完全に混合します。PDMS混合物を真空チャンバーに入れ、100ミリバールの真空を30分間引き抜きます。終了したら、真空を壊し、容器を取り出します。PDMSが必要になるまで、コンテナを覆ったままにしておきます。ウェーハが冷えたら、フォトレジストスピナーに戻します。脱気したPDMS混合物全体をウェーハにゆっくりと注ぎ、新しい気泡が混入しないようにします。次に、ウェーハを1, 200 RPMで5分間スピンコーティングします。ウェーハピンセットを使用して、スピンコーターからウェーハを取り出し、予熱したオーブンに入れます。ウェーハを一晩焼き、次にウェーハを室温まで冷却します。次に、薄膜PDMS層をパターン化するためのレーザー彫刻機を準備します。レーザー彫刻機とその排気システムをオンにすることから始めます。次に、レーザー彫刻機に接続されているコンピューターの電源を入れ、レーザー彫刻機ソフトウェアを開きます。ファイルの下で、生物学的アクチュエータの設計ファイルを開きます。[設定]ボタンを押して[青]をクリックし、電力設定を3%に、速度を4%に変更します[設定]をクリックし、[赤]をクリックして、モードをスキップに変更します。次に、[設定] をクリックします。黒についても同じことを行います。[適用]ボタンを押して設定を終了します。次に、[Engraverのアクティブ化]を選択します。次に、[再配置] を押して、デザインを画面の中央に移動します。次に、フォーカスビューボタンを押し、デザインの端をクリックして、ガイドレーザードットを対応するポイントに移動します。手袋をはめた手を使用して、ウェーハをガイドレーザードットに慎重に位置合わせします。位置合わせが完了したら、[前のジョブの彫刻を開始]を選択して彫刻プロセスを開始します。バイオロジカルアクチュエーターベースを作製するためには、ベーキング用の容器が必要です。まず、そのコンテナをはかりに置き、はかりをゼロにします。次に、予混合したPDMSを注ぎ、洗浄した直径3mmのガラスビーズをPDMS混合物に一定間隔で置きます。各ビーズの周囲には、生物学的アクチュエーターベース用に少なくとも5mmのスペースを残します。容器を真空チャンバーに入れ、真空を100ミリバールに下げて、真空ポンプをオフにします。30分後、真空を破り、容器を取り出します。必要になるまでコンテナを覆ったままにしておきます。次に、ホットプレートを摂氏40度に加熱し、ガラスビーズと一緒にPDMSの容器をホットプレートに慎重に置きます。容器に蓋をして一晩焼きます。冷却したら、かみそりの刃を使用してバルクPDMSから5ミリメートルの立方体を切り取り、各立方体の中心に1つのガラスビーズが含まれるようにします。次に、針の先端を新たに調製した液体PDMSに浸し、ウェーハの刻印されたベース領域にPDMSを一滴垂らします。液滴を塗り、5mm×5mmのベースエリアを完全に覆うようにします。最後に、ピンセットを使用して、ガラスビーズが入った立方体を液体PDMSで覆われたベース領域に置きます。デバイスごとにこのプロセスを繰り返します。終了したら、ウェーハを摂氏40度のホットプレートに移し、蓋をして一晩焼きます。鋭利なピンセットを使用して、カンチレバーをウェーハから剥がし、ベースの側壁に取り付けます。次に、ベースを引っ張って、アセンブリ全体をウェーハから慎重に取り外します。まず、生物学的アクチュエーターに使用される製造プロセスをレーザー彫刻ステップを通じて繰り返します。ただし、バイオロボットの作製には、レーザー切断時にバイオロボットの設計を使用します。次に、添付のテキストプロトコルに記載されているように、マイクロバルーンPDMS混合物とニッケル粉末PDMS混合物を調製します。スケールを使用して溶液を別々の容器に慎重に注ぎます。両方の容器を真空チャンバーに入れ、圧力を100ミリバールに30分間下げます。脱気したら、容器を摂氏40度のホットプレートに一晩置きます。カミソリの刃を使用して、ここに示すように、各バイオロボットのサイズに応じた寸法で各ポリマーからバイオロボットベースを切り取ります。ニッケルPDMSベースを金属板の上に置き、その間にクリーンルームティッシュを挟みます。次に、コロナディスチャージャーをオンにし、ディスチャージャーの先端をベースから1センチ上に持ってきます。先端をベースの周りで15秒間動かして、表面を処理します。このプロセスを繰り返して、レーザー彫刻されたベースの表面を同じ時間処理します。次に、ピンセットを使用して、ニッケルPDMS処理面をフィルムの処理面に置きます。パーツが接着されるまで、デバイスを5分間放置します。次に、鋭利なピンセットを使用して、バイオロボットカンチレバーをウェーハから剥がし、ニッケルPDMSベースの底に置きます。次に、アセンブリ全体をウェーハから取り外します。マイクロバルーンPDMSをアセンブリに取り付けるには、まず、未硬化のPDMSをその上に少量滴下します。次に、ピンセットを使用して、薄膜PDMSを含むニッケルPDMSの側面を未硬化のPDMSの滴上に置きます。アセンブリ全体をプラスチック製のペトリー皿に入れ、これを摂氏40度のホットプレートに置いて一晩硬化させます。細胞播種用のデバイスを準備するには、まず、各デバイスの別々のT25培養フラスコの中心に100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を置きます。次に、バイオロボットまたは生物学的アクチュエーターを下に向けて、フィブロネクチン溶液の液滴の上に置きます。カンチレバーが展開され、液滴に浸されていることを確認してから、フラスコを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を取り出し、デバイスをPBSで2回洗浄します。次に、PBSを取り外し、フラスコに10%FBSと1%ペニシリンを補充した10ミリリットルのDMEMを入れます。デバイスを摂氏37度で1時間インキュベートして、PDMSを脱気します。次に、磁石を使用してバイオロボットをフラスコの底に保持し、サンプルと一緒にフラスコを超音波浴に5分間置き、気泡を取り除きます。各複合層の適切な厚さを決定するために、PDMS中のニッケルとマイクロバルーンの混合比を使用して、さまざまな混合比を試験しました。ニッケルPDMS層により、ロボットの磁気制御と安定性が可能になります。さらに、マイクロバルーンPDMSレイヤーにより、バイオロボットは着実に浮かび、泳ぐことができます。2つの層の組み合わせにより、バイオロボットの自己安定化フレームワークが生まれます。コンピュータスクリプトを使用して、安定性を数値的に分析し、この2層の方法を使用して強力な復元モーメントを持つことが証明されました。この手順全体を通してカンチレバーを清潔に保ち、PDMS混合物の正しい比率とカンチレバーの厚さを維持することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、エラストマー材料を薄いカンチレバーに形成して心筋細胞をサポートする方法と、弾性や磁気などの新しい特性を得るためにエラストマー材料を修飾して高度な機能を実現する方法を理解できるはずです。この検証手順は、細胞の配向を促進し、第4世代を増やすために、パターニングアライメントキューブなどの他の手法を組み込むことで変更できます。レーザー彫刻機での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切な防護服や眼鏡を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ心筋細胞を用いた自己安定化バイオロボットの作製法。PDMSカンチレーバーと複合材料ベースの構築により、浮力と磁気特性を制御し、生体ハイブリッドロボットの開発に応用可能です。

心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1

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