心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1
2017年7月11日
この2部構成の研究では、非常に柔軟なポリジメチルシロキサン（PDMS）カンチレバーおよび生存筋細胞（心筋細胞）を用いて生物学的アクチュエータを開発し、特徴付けた。生物学的アクチュエータは、自己安定化したスイミングビオロボを構築するために、改変されたPDMS材料で作られた基材と組み合わされた。
このビデオの全体的な目標は、心筋細胞のフレキシブルPDMSカンチレバーを使用して生物学的アクチュエータを開発し、特性評価する方法を説明することです。これらのアクチュエーターは、自己安定化水泳バイオロボットを形成するために、変更されたベースに組み込まれます。ここで述べる検証方法は、機械的な基部構造を改変して自己安定化泳ぎバイオロボットを形成し、その位置を外部からも磁石で決定できるというユニークなものです。
この手法の主な利点は、デバイスの浮力を調整し、自己安定化するために、基本特性を簡単に変更できることです。この方法は、自己安定化と浮選を必要とする他の新しいデバイスの開発に適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、カンチレバーを機械的に変形させることが難しいため、苦労するでしょう。
サイズが薄いため、簡単に破れたり、奇妙な形に引っかかったりする可能性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、視覚的な支援なしにはステップと組み立てを学ぶのが難しいため、非常に重要です。まず、フォトレジストスピナーにシリコンウェーハを置きます。
ウェーハに薄いフォトレジストを添加し、2, 000 RPMで20秒間スピンコートして、目標厚さ1.2マイクロメートルを取得します。次に、ウェーハピンセットを使用して、コーティングされたウェーハを摂氏120度に予熱したホットプレートに移します。ウエハースを浅いペトリー皿で覆い、10分間焼きます。
6gのPDMSベースを計量し、0.6gのPDMS硬化剤と組み合わせます。PDMS成分を5分間完全に混合します。PDMS混合物を真空チャンバーに入れ、100ミリバールの真空を30分間引き抜きます。
終了したら、真空を壊し、容器を取り出します。PDMSが必要になるまで、コンテナを覆ったままにしておきます。ウェーハが冷えたら、フォトレジストスピナーに戻します。
脱気したPDMS混合物全体をウェーハにゆっくりと注ぎ、新しい気泡が混入しないようにします。次に、ウェーハを1, 200 RPMで5分間スピンコーティングします。ウェーハピンセットを使用して、スピンコーターからウェーハを取り出し、予熱したオーブンに入れます。
ウェーハを一晩焼き、次にウェーハを室温まで冷却します。次に、薄膜PDMS層をパターン化するためのレーザー彫刻機を準備します。レーザー彫刻機とその排気システムをオンにすることから始めます。
次に、レーザー彫刻機に接続されているコンピューターの電源を入れ、レーザー彫刻機ソフトウェアを開きます。ファイルの下で、生物学的アクチュエータの設計ファイルを開きます。[設定]ボタンを押して[青]をクリックし、電力設定を3%に、速度を4%に変更します[設定]をクリックし、[赤]をクリックして、モードをスキップに変更します。
次に、[設定] をクリックします。黒についても同じことを行います。[適用]ボタンを押して設定を終了します。
次に、[Engraverのアクティブ化]を選択します。次に、[再配置] を押して、デザインを画面の中央に移動します。次に、フォーカスビューボタンを押し、デザインの端をクリックして、ガイドレーザードットを対応するポイントに移動します。
手袋をはめた手を使用して、ウェーハをガイドレーザードットに慎重に位置合わせします。位置合わせが完了したら、[前のジョブの彫刻を開始]を選択して彫刻プロセスを開始します。バイオロジカルアクチュエーターベースを作製するためには、ベーキング用の容器が必要です。
まず、そのコンテナをはかりに置き、はかりをゼロにします。次に、予混合したPDMSを注ぎ、洗浄した直径3mmのガラスビーズをPDMS混合物に一定間隔で置きます。各ビーズの周囲には、生物学的アクチュエーターベース用に少なくとも5mmのスペースを残します。
容器を真空チャンバーに入れ、真空を100ミリバールに下げて、真空ポンプをオフにします。30分後、真空を破り、容器を取り出します。必要になるまでコンテナを覆ったままにしておきます。
次に、ホットプレートを摂氏40度に加熱し、ガラスビーズと一緒にPDMSの容器をホットプレートに慎重に置きます。容器に蓋をして一晩焼きます。冷却したら、かみそりの刃を使用してバルクPDMSから5ミリメートルの立方体を切り取り、各立方体の中心に1つのガラスビーズが含まれるようにします。
次に、針の先端を新たに調製した液体PDMSに浸し、ウェーハの刻印されたベース領域にPDMSを一滴垂らします。液滴を塗り、5mm×5mmのベースエリアを完全に覆うようにします。最後に、ピンセットを使用して、ガラスビーズが入った立方体を液体PDMSで覆われたベース領域に置きます。
デバイスごとにこのプロセスを繰り返します。終了したら、ウェーハを摂氏40度のホットプレートに移し、蓋をして一晩焼きます。鋭利なピンセットを使用して、カンチレバーをウェーハから剥がし、ベースの側壁に取り付けます。
次に、ベースを引っ張って、アセンブリ全体をウェーハから慎重に取り外します。まず、生物学的アクチュエーターに使用される製造プロセスをレーザー彫刻ステップを通じて繰り返します。ただし、バイオロボットの作製には、レーザー切断時にバイオロボットの設計を使用します。
次に、添付のテキストプロトコルに記載されているように、マイクロバルーンPDMS混合物とニッケル粉末PDMS混合物を調製します。スケールを使用して溶液を別々の容器に慎重に注ぎます。両方の容器を真空チャンバーに入れ、圧力を100ミリバールに30分間下げます。
脱気したら、容器を摂氏40度のホットプレートに一晩置きます。カミソリの刃を使用して、ここに示すように、各バイオロボットのサイズに応じた寸法で各ポリマーからバイオロボットベースを切り取ります。ニッケルPDMSベースを金属板の上に置き、その間にクリーンルームティッシュを挟みます。
次に、コロナディスチャージャーをオンにし、ディスチャージャーの先端をベースから1センチ上に持ってきます。先端をベースの周りで15秒間動かして、表面を処理します。このプロセスを繰り返して、レーザー彫刻されたベースの表面を同じ時間処理します。
次に、ピンセットを使用して、ニッケルPDMS処理面をフィルムの処理面に置きます。パーツが接着されるまで、デバイスを5分間放置します。次に、鋭利なピンセットを使用して、バイオロボットカンチレバーをウェーハから剥がし、ニッケルPDMSベースの底に置きます。
次に、アセンブリ全体をウェーハから取り外します。マイクロバルーンPDMSをアセンブリに取り付けるには、まず、未硬化のPDMSをその上に少量滴下します。次に、ピンセットを使用して、薄膜PDMSを含むニッケルPDMSの側面を未硬化のPDMSの滴上に置きます。
アセンブリ全体をプラスチック製のペトリー皿に入れ、これを摂氏40度のホットプレートに置いて一晩硬化させます。細胞播種用のデバイスを準備するには、まず、各デバイスの別々のT25培養フラスコの中心に100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を置きます。次に、バイオロボットまたは生物学的アクチュエーターを下に向けて、フィブロネクチン溶液の液滴の上に置きます。
カンチレバーが展開され、液滴に浸されていることを確認してから、フラスコを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を取り出し、デバイスをPBSで2回洗浄します。次に、PBSを取り外し、フラスコに10%FBSと1%ペニシリンを補充した10ミリリットルのDMEMを入れます。
デバイスを摂氏37度で1時間インキュベートして、PDMSを脱気します。次に、磁石を使用してバイオロボットをフラスコの底に保持し、サンプルと一緒にフラスコを超音波浴に5分間置き、気泡を取り除きます。各複合層の適切な厚さを決定するために、PDMS中のニッケルとマイクロバルーンの混合比を使用して、さまざまな混合比を試験しました。
ニッケルPDMS層により、ロボットの磁気制御と安定性が可能になります。さらに、マイクロバルーンPDMSレイヤーにより、バイオロボットは着実に浮かび、泳ぐことができます。2つの層の組み合わせにより、バイオロボットの自己安定化フレームワークが生まれます。
コンピュータスクリプトを使用して、安定性を数値的に分析し、この2層の方法を使用して強力な復元モーメントを持つことが証明されました。この手順全体を通してカンチレバーを清潔に保ち、PDMS混合物の正しい比率とカンチレバーの厚さを維持することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、エラストマー材料を薄いカンチレバーに形成して心筋細胞をサポートする方法と、弾性や磁気などの新しい特性を得るためにエラストマー材料を修飾して高度な機能を実現する方法を理解できるはずです。
この検証手順は、細胞の配向を促進し、第4世代を増やすために、パターニングアライメントキューブなどの他の手法を組み込むことで変更できます。レーザー彫刻機での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切な防護服や眼鏡を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本記事では、心筋細胞駆動のバイオアクチュエータを動力源とする、自己安定型の遊泳バイオロボットの開発と作製について詳述します。本プロトコルでは、柔軟なPDMSカンチレバーの構築、浮力と磁気特性を調整した複合PDMSベースの組み立て、およびその後の細胞播種と機能化に向けたデバイスの準備に焦点を当てています。この手法により、バイオロボットの安定性と浮力の精密な制御が可能となり、高度なバイオハイブリッド・ロボティックシステムの実現に道を開きます。
研究の主要構成要素
科学分野
- バイオエンジニアリング
- ロボティクス
- 材料科学
- 組織工学
背景
- バイオロボットは、動きを生み出すアクチュエータとして生細胞や組織を利用しています。
- 従来の人工ロボットは、生物学的システムのような適応性や効率性に欠けています。
- 近年の進歩により、バイオロボットの性能の定量的な特性評価と最適化が可能になりました。
- 機能的なバイオロボットにとって、自己安定化と制御可能な移動能力は極めて重要です。
研究目的
- ピッチ、深度、およびロールを自律的に維持できる自己安定型遊泳バイオロボットを開発すること。
- 浮力と磁気特性を調整可能なPDMSベースのスキャフォールドおよびベースの作製について述べること。
- 細胞播種中および播種後に、外部磁気制御と安定した浮遊を可能にすること。
使用した手法
- シリコンウェハー上にPDMSフィルムをスピンコートおよびベークし、柔軟なカンチレバーを作製する。
- アクチュエータおよびバイオロボット構成部品の精密なパターニングのためのレーザー彫刻。
- ニッケル粉末（磁性の付与）およびマイクロバルーン（浮力の付与）を用いた複合PDMSベースの調製。
- PDMS層の表面活性化および接合のためのコロナ放電処理。
- 細胞接着を促進するためのフィブロネクチンによる機能化。
- コンピュータースクリプトを用いた安定性と復元モーメントの数値解析。
主な結果
- 心筋細胞の播種に適した、薄く柔軟なPDMSカンチレバーの作製に成功した。
- 自己安定化のために重量分布を制御した複合PDMSベースを開発した。
- 作製および動作過程において、バイオロボットの磁気制御と安定した浮遊を実証した。
- 数値解析により、強力な復元モーメントと効果的な自己安定化が確認された。
結論
- 記述されたプロトコルにより、自己安定化して泳ぐバイオロボットの再現性のある作製が可能になります。
- 複合PDMS材料を用いることで、高度な制御のために浮力と磁気特性を精密に調整できます。
- この手法は、浮遊と自己安定化を必要とする他のバイオハイブリッドデバイスにも応用可能です。
よくある質問
業界における重要性
心筋細胞による収縮力を利用したバイオハイブリッドアクチュエータは、初期段階のバイオ医薬品研究開発における、精密制御および自己安定化可能なマイクロデバイスの新しいパラダイムを提供します。本稿で述べる、浮力と磁気特性を調整可能なPDMSベースのバイオロボットの作製法により、生体アクチュエータの性能を再現性高く定量的に評価することが可能になります。この機能は、バイオエンジニアリングとトランスレーショナルデバイス開発の接点において、メカニズムに基づくリスク低減と予測精度の向上を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲット検証
- 機能検証のため、生存アクチュエータの力学的特性の定量的解析を可能にする。
- アクチュエータ設計における材料および幾何学的変数を分離することで、メカニズム上のリスク低減を支援する。
- バイオハイブリッドデバイスの構造における、仮説駆動型の最適化を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 後続の細胞播種および機能化に向けた、標準化され再現性のあるPDMSスキャホールドを提供します。
- 比較性能スクリーニングのためのアクチュエータプラットフォームの一貫した作製を可能にします。
- アッセイ可能なバイオハイブリッドシステムの拡張可能な作製ワークフローをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 収縮組織とデバイスのインターフェースにおける疾患関連モデリングの基盤を構築します。
- 発見段階のアクチュエータ検証から、前臨床デバイスのプロトタイピングまでの連続性を可能にします。
- 定量的なパフォーマンス指標を用いて、リスク調整されたバイオハイブリッドデバイスコンセプトの推進を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この作製手法は、バイオハイブリッドアクチュエータを初期探索、スクリーニング、およびトランスレーショナルなデバイス開発の接点に位置づけるものであり、材料選択から機能検証に至るまでの反復的な最適化を可能にします。
- 発見生物学： アクチュエータの性能変数の仮説検証およびメカニズムの解明を支援します。
- スクリーニング： デバイス構成の定量的比較に適した、再現性のあるアッセイ準備済みプラットフォームを提供します。
- 分析学： データ駆動型の最適化に向けて、安定性、浮遊性、および収縮出力の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： バイオハイブリッドデバイスを前臨床検証へ進めるためのモジュール式フレームワークを提供します。
- エンタープライズ再利用： 多様なバイオハイブリッドアクチュエータへの応用に適した、標準化され適応性のあるプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： アクチュエータ駆動デバイスの開発において、予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値： 再現性と拡張性を確保するため、作製および機能化を標準化します。
- 戦略的価値： バイオハイブリッドデバイスのコンセプトに対し、情報に基づいた Go/No-go 判断および資本効率の高いポートフォリオの選別を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、革新的なアクチュエータ技術の推進をサポートします。
実施上の考慮事項
- ソフトリソグラフィー、PDMSの取り扱い、および微細加工技術に関する専門知識が必要です。
- 再現性のある結果を得るために、スピンコーター、レーザー刻印機、および真空チャンバーへのアクセスが不可欠です。
- 材料比および作製パラメータについて、チーム間での標準化が必要です。
- さまざまなアクチュエータ形状や複合材料の組成に適応可能です。
- 組み立て中の機械的破損を防ぐため、薄いカンチレバーの慎重な取り扱いが極めて重要です。
