心筋細胞ベースのアクチュエータと自己安定化ビオロボ - 第2部

本研究の全体的な目的は、微細加工デバイスに心筋細胞を播種し、これらのデバイス上における細胞の生化学的および生物力学的特性、ならびに時間経過に伴う性能を評価することである。ここで述べる手法は、微細加工デバイスへの高密度な細胞添加を必要とする他の実験にも容易に転用できる。本ビデオで開発したバイオアクチュエータの主な利点は、他のあらゆる細胞型の細胞収縮力を定量化するために容易に導入できる点にある。

また、幹細胞が分化する際のバイオメカニクス的特性の変化を研究するためにも利用できます。細胞播種の手順は文章による説明だけでは習得することが困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。適切な生物学的機能を確保するために不可欠な、カンチレバーアーム上への細胞の confluent な付着を実現するには、これらの手順を適切に実行する必要があります。

本手順の実演は、私の研究室のNeerajha Nagarajanが行います。バイオロボットを用い、T25フラスコ内で開始します。磁石を使用して、フラスコの底で固定してください。

バイオアクチュエータは、ベースにあるガラスビーズの重量により移動しないため、マグネットは不要です。小さな正方形のプラスチックシートを丸めて漏斗として使用し、その滅菌済みの漏斗をバイオロボット内のアクチュエータの上に配置します。デバイスに適合するように広い方の端の直径を調整し、フラスコの蓋を締めたときにぴったりと収まるように高さを調整してください。

別のフラスコを使用して、漏斗のフィット感を確認し、調整します。漏斗がぴったりとフィットしていれば、前述の通り、細胞が残りの培地へ漏れ出すのを防ぐことができます。これは、カンチレバーアームをコンフルエントに被覆させるために不可欠です。

漏斗をセットした状態で、心筋細胞を完全DMEMを用いて16 million cells/mLの密度で再懸濁させ、懸濁液400 µLを各漏斗からデバイス上にゆっくりと滴下します。その後、デバイスや内部の漏斗を動かさないように注意しながら、フラスコをゆっくりとインキュベーターに戻します。37 °Cで24時間、細胞を接着させます。

インキュベーション期間後、ゆっくりとファンネルを取り除きます。サンプルをPBSで穏やかに洗浄し、各フラスコに新鮮なDMEM complete 10 millilitersを補充します。次に、細胞が浮遊状態になるようにバイオロボットからマグネットを取り除き、フラスコをインキュベーターに戻します。

培養中のデバイスを可視化するため、ズームレンズを備えたカメラをインキュベーター内に設置します。次に、光源として使用するLEDライトストリップを追加します。その後、カメラをコンピューターに接続し、イメージングプログラムを開きます。

プログラムを起動後、「File」タブにあるカメラの画像をクリックしてすべてのカメラオプションを開き、接続されているカメラを選択します。タブの一覧から「Live」を選択し、レンズダイヤルを調整して手動でピントを合わせます。次に、上部パネルから関心領域（ROI）のクロップを選択します。

次に、ビデオフレーム内で生物学的アクチュエータデバイスとカンチレバーアームを囲むように矩形を手動で描き、関心領域を指定します。バイオロボットの場合は、デバイスの遊泳動作を記録するために画面全体をキャプチャしてください。続いて、「Camera Settings」を選択し、ライブ画像の露出とピクセル比を調整してフレームレートを設定します。

フレームレートを約30 fpsに設定します。最後に、録画ボタンをクリックしてビデオの録画を開始します。アイコンをクリックしてプログラミングソフトウェアを開きます。

ロードが完了したら、[File]から[Open]をクリックし、画像解析用のmスクリプトファイルを選択します。録画されたTIF画像およびそのAVIバージョンがmファイルと同じフォルダに保存されていることを確認し、[Run]をクリックしてスクリプトを実行してください。[Play]を押すと、実際のプログラムが開始されます。

起動後、「Open」ボタンをクリックし、解析対象のTIFまたはAVIファイルを指定してください。次に、「base」ボタンをクリックします。カンチレバーがベースに固定されている上部の点を選択し、Enterキーを押してください。

これにより、各フレームの画像上に、カンチレバー基部の位置を示す正方形のマーカーが配置されます。次に、スケールボタンをクリックし、ガラスビーズの端の一点を手動でクリックします。マウスポインタをガラスビーズの反対側に移動させ、Enterキーを押してください。

これにより、ガラスビーズの直径を測定する線が描かれ、直径と表示されたピクセルの関係が設定されます。Analyzeボタンをクリックしてください。次に、カンチレバーのベースを示す最初の正方形マーカーから短い距離を離れたカンチレバー上に沿ってクリックします。

チップを含むカンチレバーに沿ってクリックを続け、完了したらEnterキーを押してください。これにより、カンチレバー上でクリックした各点にX印が表示されます。最後に、重ね合わせられた円がカンチレバーのプロファイルを正確にトレースしているかを確認してください。

正しければ、「次のフレーム」ボタンをクリックしてください。これにより、TIFファイルの次のフレームに切り替わります。すべてのフレームについてこの操作を繰り返してください。

すべてのフレームの処理が完了したら、Export（エクスポート）ボタンをクリックしてください。まず、画像解析ソフトウェアを開き、遊泳バイオロボットのビデオファイルを読み込みます。次に、表計算ソフトを開いてください。

読み込んだバイオロボットのビデオ内で、ガラスビーズなどのサイズ基準となるものを特定します。直線ツールを使用して、ガラスビーズを横切るように線を引きます。次に、[Analyze]をクリックし、[Set Scale]を選択します。

Known distance（既知距離）フィールドを3,000 micrometersに設定し、OKをクリックします。フレーム間で変動しないデバイス上の点をマーカーとして選び、この点のX座標およびY座標をスプレッドシートに記録します。画像解析ソフトウェアのウィンドウに戻り、右矢印キーを押して次のフレームに切り替えます。再度マーカーを指し示し、新しいX座標とY座標をスプレッドシートに記録します。

すべてのフレームでこのプロセスを繰り返し、得られたデータを用いて、付属のテキストプロトコルに記載されている手順でバイオロボットの運動を解析します。アクチュエータの静的ストレスおよび動的ストレスは、日ごとの表面ストレスから抽出しました。静的ストレスとは、細胞が静止状態で表面に及ぼす収縮ストレスであり、動的ストレスとは、細胞が最大収縮時に発生させるストレスのことです。

培養中の細胞が成熟するにつれて、静的および動的なストレスが時間とともに徐々に増加することが観察されました。6日目には、最大の細胞牽引力は50 millinewtons per meter、最大収縮力は約165 millinewtons per meterを示しました。静的および動的なストレスに並行して、心筋細胞の成熟、成長と伸展、および細胞間相互接続のマーカーも6日目まで増加しました。

ビデオ解析に基づき、異なる遊泳プロファイルを持つ3種類のバイオロボットについて、平均遊泳速度、拍動周波数、および1ストロークあたりの移動距離の比較をここに示します。垂直型のバイオロボットは拍動周波数が最も低かったものの、遊泳速度と移動距離は最大となりました。このビデオを視聴することで、生物学的アクチュエータやバイオロボットとして機能し得る微細加工デバイスへの心筋細胞の播種方法について、十分に理解できたはずです。

このビデオで説明している画像取得およびその後のデータ解析のプロセスは、デバイスの性能だけでなく、細胞の挙動を特性評価するための便利な方法を示しています。この手順を行う際は、心筋細胞の寿命が限られていること、および細胞の活性は6日目にピークに達し、その後は時間とともに低下することを覚えておくことが重要です。