2017年5月9日
この研究では、機能化されたエラストマーカンチレバーアームを有する生物学的アクチュエータおよび自己安定性水泳用ビオロボットに、心筋細胞を播種し、培養し、それらの生化学的および生体力学的特性を経時的に特徴付けた。
この研究の全体的な目標は、微細加工されたデバイスに心筋細胞を移植し、これらのデバイス上の細胞の生化学的および生体力学的特性と、経時的なパフォーマンスを特徴付けることです。ここで説明する事項は、微細加工されたデバイス上で高密度の細胞添加を必要とする他の実験のために容易に変更することができます。このビデオで開発されたバイオアクチュエータの主な利点は、他の細胞タイプの細胞収縮力を定量化するために簡単に採用できることです。
また、幹細胞が分化するにつれて、幹細胞の生体力学的特性の変化を研究するためにも使用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストからの説明で細胞の播種手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。これらは、適切な生物学的機能に不可欠なカンチレバーアームへのコンフルエントな細胞付着を確保するために、適切に実施する必要があります。
その手順を実演するのは、私の研究室のNeerajha Nagarajanです。バイオロボットを使用して、T25フラスコから開始します。マグネットを使用して、フラスコの底に固定します。
バイオロジカルアクチュエータは、ベース内のガラスビーズの重量により動かないため、磁石は必要ありません。小さな正方形のプラスチックシートを丸めて漏斗として使用し、滅菌漏斗をバイオロボットのアクチュエーターの上に置きます。幅の広い方の端の直径はデバイスに合うように調整し、フラスコの上部を締めたときにぴったりと収まるように高さを調整します。
別のフラスコを使用して、漏斗のフィット感をテストおよび調整します。漏斗がぴったりとフィットすることで、前述のように細胞が他の培地に漏れることがなくなります。これは、カンチレバーアームのコンフルエントカバレッジを提供するために不可欠です。
漏斗を所定の位置に設置した状態で、心筋細胞を1ミリリットルあたり1,600万細胞の密度で完全なDMEMに再懸濁し、各漏斗を通じて400マイクロリットルの懸濁液をデバイスにゆっくりと滴下します。次に、フラスコをゆっくりとインキュベーターに戻しますが、デバイスや内部の漏斗を乱すことはありません。セルを摂氏37度で24時間接着させます。
潜伏期間の後、漏斗をゆっくりと取り外します。サンプルをPBSで優しく洗浄し、各フラスコに10ミリリットルの新鮮なDMEMを補充します。次に、バイオロボットから磁石を取り外して浮かび、フラスコをインキュベーターに戻します。
インキュベーター内にズームレンズを搭載したカメラを装着し、培養中のデバイスを可視化します。次に、光源として使用するLEDライトストリップを追加します。次に、カメラをコンピューターに接続し、イメージングプログラムを開きます。
プログラムに入ったら、[ファイル]タブでカメラ画像をクリックしてすべてのカメラオプションを開き、接続されているカメラを選択します。タブのリストから[ライブ]を選択し、レンズダイヤルを調整して手動で画像にピントを合わせます。次に、トップパネルから関心領域の切り抜きを選択します。
次に、バイオロジカルアクチュエータデバイスとカンチレバーアームを囲むビデオフレームに長方形を手動で描画して、関心領域をマークします。バイオロボットの場合は、デバイスの遊泳動作を記録するために、画面全体をキャプチャします。次に、[カメラ設定]を選択し、ライブ画像の露出とピクセル比を調整してフレームレートを設定します。
フレームレートを約 30 フレーム/秒に設定します。最後に、録画ボタンをクリックしてビデオの録画を開始します。アイコンをクリックして、プログラミングソフトウェアを開きます。
ロードしたら、[ファイル]、[開く]の順にクリックし、画像解析を実行するための m スクリプト ファイルを選択します。記録された TIF イメージとその AVI バージョンが m ファイルと同じフォルダにあることを確認し、[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。[再生]を押して、実際のプログラムを開始します。
実行したら、[開く]ボタンをクリックして、分析するTIFまたはAVIファイルを見つけます。次に、ベースボタンをクリックします。カンチレバーが上部のベースに取り付けられている点を選択し、Enterキーを押します。
これにより、各フレームの画像上に四角いマーカーが配置され、カンチレバーベースの位置を示します。次に、スケールボタンをクリックしてから、ガラスビーズの一方の端を手動でクリックします。マウスポインタをガラスビーズの反対側に持ってきて、Enterキーを押します。
これにより、ガラスビーズの直径を測定する線が描画され、直径が表示されているピクセルに関連付けられます。「分析」ボタンをクリックします。次に、カンチレバーの底面を表す最初の正方形のマーカーから少し離れたところで、カンチレバーに沿ってクリックします。
先端を含むカンチレバーに沿ってクリックを続け、完了したらEnterキーを押します。これにより、カンチレバーでクリックされた各ポイントにXが配置されます。最後に、重ね合わせた円がカンチレバープロファイルを正しくトレースしているかどうかを確認します。
正しければ、次のフレームボタンをクリックします。これにより、TIFファイルの次のフレームに切り替わります。すべてのフレームに対してこのプロセスを繰り返します。
すべてのフレームが処理されたら、[エクスポート]ボタンをクリックします。まず、画像解析ソフトウェアを開き、スイミングバイオロボットのビデオファイルをロードします。次に、スプレッドシートソフトウェアを開きます。
ロードされたバイオロボットのビデオで、ガラスビーズなどのサイズ参照を見つけます。直線ツールを使用して、ガラスビーズを横切る線を引きます。次に、「分析」をクリックし、「スケールの設定」を選択します。
[既知の距離] フィールドを 3, 000 マイクロメートルに設定し、[OK] をクリックします。フレーム間でぐらつかないデバイス上のポイントを選択してマーカーとして機能し、このポイントの X 座標と Y 座標をスプレッドシートに記録します。画像解析ソフトウェアのウィンドウに戻り、右矢印キーを押して次のフレームに変更します。マーカーをもう一度ポイントし、新しい X 座標と Y 座標をスプレッドシートに記録します。
すべてのフレームに対してこのプロセスを繰り返し、データを使用して、付属のテキストプロトコルで説明されているバイオロボットの動きを分析します。アクチュエータの静的応力と動的応力は、毎日表面応力から抽出されました。静的応力は、静止状態で細胞が表面に示す収縮応力であり、動的応力は、最大収縮時に細胞によって生成される応力です。
細胞が培養中で成熟するにつれて、静的および動的ストレスが経時的に徐々に増加することが観察されました。彼らは、6日目に1メートルあたり50ミリニュートンの最大細胞牽引力と1メートルあたり約165ミリニュートンの最大収縮力を示しました。静的ストレスと動的ストレスと並行して、心筋細胞の成熟、成長と拡散、および細胞の相互接続性のマーカーも6日目まで増加します。
ビデオ分析に基づいて、遊泳プロファイルが異なる3つのバイオロボットの平均遊泳速度、鼓動頻度、ストロークあたりの移動距離の比較を以下に示します。垂直バイオロボットは、鼓動頻度が最も小さいにもかかわらず、最高の泳流速度と移動距離を示しました。このビデオを見れば、生物学的アクチュエーターやバイオロボットとして機能する可能性のある微細加工されたデバイスに心筋細胞を播種する方法を十分に理解できるはずです。
このビデオで説明する画像取得とその後のデータ分析のプロセスは、細胞の挙動とデバイスの性能を特徴付ける便利な方法を示しています。この手順を試みる際には、心筋細胞の寿命が限られており、細胞の活動が6日目にピークに達することを覚えておくことが重要です。その後、時間の経過とともに減少します。
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本研究では、微細加工デバイスに心筋細胞を播種し、その生化学的および生物力学的特性の時間的変化を評価することに焦点を当てています。開発されたバイオアクチュエータを用いることで、細胞の収縮力を定量化し、幹細胞の分化を研究することが可能です。
本研究は、心筋細胞の収縮力を定量化するためのスケーラブルなプラットフォームを構築し、心疾患標的のバリデーションおよび表現型スクリーニングにおけるメカニズム的なリスク低減を可能にします。定量的なバイオメカニクス的リードアウトを提供することで、心血管治療薬のリード化合物同定および前臨床モデル選択における予測的な信頼性をサポートします。本システムは他の細胞型への適応性もあり、機能的な組織評価を必要とするさまざまな創薬ワークフローにおける有用性を高めています。
この手法は、初期のターゲット検証からリード化合物の同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、各段階での意思決定(go/no-go判断)の根拠となる機能的データを提供します。