Name: 漢方薬の準備：Er-Xian煎じ薬とEr-Xian含有血清インビボとインビトロ実験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶEr-Xian煎じ薬の標準化調製法。ラットへの経口投与と血清採取によるインビトロ実験用含有血清の調製手順を解説。骨形成促進効果の検証方法も含む。

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この研究は、中国国立自然科学財団（81573992）によって支持された。私たちはEmily K. LoとKathleen DiNapoliの言語編集支援に感謝します。

このプロトコルは上海漢方医学の動物飼育指針に従っており、動物実験上海動物倫理委員会の承認を受けています。 1.プロトコルI：EXDの調製<ol><li> 計算 <ol><li> 6ヵ月齢の女性刷本管理領域（ICR）マウス（0.02kg /マウス）10匹の治療群にEXDを投与し、1週間あたり5日間12週間投与する。 注：合計1.702 EXDが必要です。 EXDは離散的な増分で測定されるため、実際には2つのEXDを管理します。 </li><li>マウス1匹につき適用されるEXDの量を計算する（ すなわち、 V =（0.1418 EXD / kg・日）*（0.02kg /マウス）* 50mL / EXD = 0.14mL /マウス・日）。 </li></ol></li><li> 浸漬 <ol><li> 2つのEXDのすべての原材料（ すなわち、Curculigo orchioides Gaertn （18g）、 Herba Epimedii （18g）、 Radix Morindae Officinalis （18g）、 R（18g）、 Cortex Phellodendri （12g）、 Rhizoma Anemarrhenae （12g）、合計96g）を蓋付き容器に入れた。 注：セラミック容器を推奨します。 </li><li>生ハーブを500mLの蒸留水で1時間洗浄します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。 </li></ol></li><li> 最初の水の煎じ薬 <ol><li>水が沸騰するまで（約5〜10分;加熱時間、容器、およびハーブと水の量に依存します）、ガス炊飯器または誘導加熱調理器を使用してハーブを高熱で加熱します。低煮沸の電源を2時間倒します。 </li></ol></li><li> 最初のろ過 <ol><li>定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。 </li><li>残った薬草残渣を返す容器にろ紙を移す。 </li></ol></li><li> 2回目の水煎じ <ol><li>ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。 </li><li>手順1.3を繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次ろ過 <ol><li>ステップ1.4.1と1.4.2を繰り返します。 </li><li> 2回目の煎じ薬を同じビーカーに注ぎます。 1回目と2回目の煎じ薬を混ぜる。 </li></ol></li><li> 濃度 <ol><li>ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んでガス炊飯器の上に置き、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。 </li><li>煎剤が200 mLになったら、500 mLのビーカーに移す。 </li><li>煎じ薬が100mLになるまでステップ1.7.1を繰り返します。 </li></ol></li><li> 保管と管理 <ol><li>濃縮した煎じ薬を滅菌ガラス瓶に移す。それは室温に冷やしてみましょう再（RT）。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。 </li><li>強制栄養針を用いて、1日1回、1週間に5日、12週間、卵巣摘出（OVX）マウスに煎じ薬0.14mL /マウスを投与する。 </li></ol></li></ol> 2.プロトコルII：EXD含有血清の調製<ol><li> 計算 <ol><li>各ラット（1ヶ月齢）の体重として0.15kgを用いて、ラット相当用量（RED）を計算する：dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） 1/3 = 0.111 EXD / kg /日。 注：100mLの培地（10％EXD含有血清）を調製するためには、合計10mLのEXD含有血清が必要です。各ラットは2mLの血清を提供すると予想される。したがって、EXD投与には1日1回3日間、6匹のラット（20％の損失を考慮する）が必要である。 EXDの数は、（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（6匹のラット）*（3日）= 0.300 EXD。再び、EXDは離散的な増分で測定されるので、1 EXDを使用します。 </li><li>ラット（ すなわち、 V =（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（50mL / EXD）= 0.83mL /ラット・日）に適用されるEXDの容量を計算する。 </li></ol></li><li> 浸漬 <ol><li> 1 EXD用の原料を蓋付き容器に入れます。生ハーブを蒸留水に1時間浸します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。 </li></ol></li><li> 最初の水の煎じ薬 <ol><li>水が沸騰するまで（約5〜10分;時間は熱出力、容器、およびハーブと水の量に依存します）、誘導加熱器を高出力で使用してハーブを加熱します。電源を2時間低煮沸にします。 </li></ol></li><li> 最初のろ過 <ol><li>定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。 </li><li&gt;ろ紙上のハーブ残渣を容器に戻します。 </li></ol></li><li> 2回目の水煎じ <ol><li>ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。 </li><li>ステップ2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次ろ過 <ol><li>手順2.5.1と2.5.2を繰り返します。 </li><li>ステップ2.4.1と同じビーカーに2回目の煎じ薬を注ぎ、1回目と2回目の煎じ薬を混ぜます。 </li></ol></li><li> 濃度 <ol><li>ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んだガス炊飯器に入れ、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。 </li><li>煎じ薬が100mLになったら、100mLビーカーに移す。 </li><li>煎じ薬が50mLになるまで2.7.1の手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> 保管と管理 <ol><li>濃縮煎じ薬をステーに移すガラス瓶。それをRTに冷やす。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。 </li><li> 1日1回、0.83mL /ラットを3日間胃内投与する。 </li></ol></li><li> EXD含有血清調製物 <ol><li>最後のEXD投与の1時間後に300mg / 100gの80mg / kgケタミンおよび10mg / kgキシラジンを腹腔内注射することによりラットを麻酔する。つま先で適切な麻酔を確認してください。 </li><li>メスを使用して腹部から胸郭の底にラットの皮膚と腹膜を切開する（またはまっすぐに操作するはさみ）。それぞれ約5cmと0.5cmの長さと深さの切開を作成します。ティッシュペーパーを使用して腹部内臓を左に動かします。 </li><li>ティシュペーパーを使用して、腹部大動脈の結合組織を除去して、血管をはっきりと露出させる。 </li><li> 10mL、22ゲージのシリンジを使用して、腹部大動脈からゆっくりと血液を採取する。それを転送する針を除去した後の15mLの滅菌チューブ; 1匹のラットは8〜10mLの血液を産生することができる。 注：採血が始まるとラットは生きている（ すなわち、腹部大動脈が拍動する）。 </li><li>室温RTで30〜60分間、直立姿勢で血液を凝固させる。 500-600×gで20分間遠心分離する。すべての上清（血清）を注意深く1つの50mLの滅菌チューブに入れ、すべての血清（異なる動物由来）を一緒に混合する。 </li><li>血清を56℃の水浴中で30分間インキュベートすることにより熱不活性化を行う。 0.22μmの孔径の親水性ポリエーテルスルホン膜を有するシリンジフィルターを用いて血清を濾過する。新鮮な血清を使用するか、-20℃で保存してください。 </li></ol></li><li> 対照薬物含有血清調製物（対照群において使用される） <ol><li> 1日1回3日間同じ容量の生理食塩水（0.83mL）で各ラットを投与する。他のステップはステップ2.9と同じです。</li></ol></li><li> 応用 <ol><li> EXD含有血清または薬物含有血清10mLを各100mLの培地に加え、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PS） 23に加える。 </li></ol></li></ol>

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<li>Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263(1999).</li>
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<li>Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

近年、東アジアの臨床現場で何千年も使用されてきた代替薬の一種であるハーブ薬が注目されています。伝統的な漢方薬は、現代医学の「ベンチ・ベッド」のパターンとは異なり、まずそのメカニズムを説明するために「ベッド・ツー・ベンチ」のパターンが必要です。これに続いて、ベンチ段階で行われた検証と、新たに最適化された薬物の開発のための処理が続く。これまで、数式またはハーブ全体から有効成分を放出するいくつかの抽出方法が報告されています。その中でも、水抽出が最も広く用いられている。 漢方薬の水抽出には4つの基本的なステップがあります。最初のステップは浸ることです。複雑な漢方薬は、水中で一定時間、通常0.5〜1時間浸軟されます。浸漬時間は生ハーブの量と性質に依存します。に生ハーブが徹底的に浸されていることを確認し、すべてのピースまたはブロックの中心部を浸してください。水の量は、ハーブの総量に依存します。時折、ハーブの重量は、浸すために必要な水の量を決定するために使用されます。しかし、ハーブの密度は大きく異なります。浸漬の目的は、すべてのハーブを細かくすることであり、以下のステップで活性成分の放出を促進す...

伝統的な漢方薬の研究と応用に関心が高まっています。化学成分が明確な現代薬とは対照的に、ハーブ処方には未知の成分があり、活性成分の送達を可能にするために抽出プロセスが必要です。多くの研究は、ハーブまたはハーブの処方全体の代表として、よく知られている構造を持つ1つの小さな化合物を選択しようとしていますが、薬理学的有効性やメカニズムは同等ではありません1,2 。フィンガープリンティングは複雑な漢方式の構成成分の分析を可能にするが、一部の成分は依然として明確に分析されていないため、研究3のすべての抽出物を組み合わせる際に問題が生じる。多数の成分/抽出物の相互作用は、漢方薬の治療効果を媒介する。この利点を保持するために、伝統的な抽出物の形態イオンは、依然として診療所で広く使用されています。抽出手順は治療効果に大きな影響を与えるため、特にインビボ研究では、伝統的な水煎出の標準プロトコールが必要である4,5。 他方、薬理学的機構を調べる場合、 インビトロまたはエクスビボの研究中の薬草煎じ薬の投与も課題である。薬物含有血清の概念は、1988年にTashinoによって最初に提案された6 。それ以来、数多くの研究者が漢方薬に適用しています7,8,9。薬物含有血清の方法は、血清の特定の成分の影響などのいくつかの制限があるが、依然として生理学的条件を厳密に模倣する方法であると考えられている。 14 、閉経骨粗鬆症15,16,17、早期卵巣不全18 、乳癌19 、卵巣癌20 、思春期遅発21の治療にも適用されています。ここでは、エラシアン煎剤（EXD）とその薬物含有血清の両方の調製のための詳細なプロトコールを提示する。加えて、我々は、ネズミ更年期骨粗鬆症モデルに対するEXDおよびEXD含有血清の適用を記載する。 EXDは、 9gのCurculigo orchioides Gaertn 、 Herba Epimedii </em&gt;、 Radix Morindae Officinalis 、 Radix Angelicae Sinensis 、 Cortex PhellodendriおよびRhizoma Anemarrhenaeそれぞれ6gを 1日当たりに投与する。マウスの等価線量は、以下の式22に基づいて0.1418EXD / kg /日である。dB = dA * RB / RA *（WA / WB） 1/3 。 dAおよびdBは、それぞれ、ヒトおよびマウスの体重当たりの用量（mg / kg）を示す。用量は、mg / kgで、EXD / kgの数で置き換えられる。 RAおよびRBは、（体表面積（m 2 ）/体重（kg）） 2/3 （ 表1参照）に比例するヒト身体因子およびマウス体係数をそれぞれ表す。 WAおよびWBは、それぞれヒトおよびマウスの体重（kg）を示す。

<table><tbody><tr><td>Curculigo orchioides Gaertn(9&thinsp;g)、Herbaa Epimedii(9&thinsp;g)、Radix Morindae Officinalis(9&thinsp;g)、Radix Angelicae Sinensis (9&thinsp;g)、皮質フェロデンドリ(6&thinsp;g)、およびRhizoma Anemarrhenae(6&thinsp;g)</td><td>Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)</td><td>160922</td><td>EXD components</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>GElifesciences</td><td>99-103-952</td><td>Filter EXD decoction before concentration</td></tr><tr><td>Imprinting Control Region (ICR) mice</td><td>Shanghai Laboratory Animal Center</td><td>SCXK 2007-0005</td><td>In vivo study</td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Shanghai Laboratory Animal Center</td><td>SCXK 2007-0005</td><td>EXD含有血清製剤</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 &micro;m</td></tr><tr><td>強制針 (10 ml)</td><td>上海 BO Ge 貿易営業部</td><td>59104274</td><td>EXD</td></tr><tr><td>ケタミン (80 mg/kg) の投与&nbsp;</td><td>福建古田製薬株式会社</td><td>H35020148</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>キシラジン (10 mg/kg)</td><td>Sunway Pharma Co. Ltd</td><td>CB07591</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Dulbecco'イーグルの修正 's medium ダルベッコ (DMEM) 培養培地</td><td>Gibco</td><td>12800-116</td><td>DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>1277</td><td>100 &micro;g / ml</td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>シグマ</td><td>4687</td><td>100 &micro;g/ミリリットル</td></tr></tbody></table>

漢方薬の準備：er-xian煎じ薬とer-xian含有血清<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;実験

Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In Vivo and In Vitro Experiments

近年、臨床現場での代替薬である伝統的な漢方薬が注目されています。身体に送達する前に、生薬から活性成分を放出するためには、一般的に追加の抽出手順が必要である。水煎出は、臨床の場で広く使用されている古典的な抽出手順です。ここでは、薬草煎じ薬を実験研究に適用するために、エキソ煎じ薬（EXD）の詳細なプロトコルを提案する。 EXDの主要な4つのステップ（浸漬、水煎出、濾過、濃縮）と同様に、動物に適した投与量の計算が記載されています。さらに、血清含有EXDをインビトロでの検証の手段としてラットに導入する。ここでは、ラットにEXDを3日間経口投与した。次いで、血液サンプルを収集し、不活性化し、遠心分離し、濾過した。培養培地で希釈した血清を用いて、細胞または組織をvitro。例えば、EXDはインビボおよびインビトロ研究の両方に適用され、EXDが骨形成を増強することが実証された。このプロトコールは、漢方薬の調製および応用の参考として用いることができる。

OVXマウスの骨密度に対するEXDの効果腰椎切片のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、OVX群（ 図1A 、左パネル）と比較して、 インビボでの EXD処置後の骨梁の増加を示す（ 図1A 、右パネル）。 図1Bは、OVXマウス（ 図1B 、左パネル）および12週間のEXD処置を行ったOVXマウス（ 図1B 、右パネル）における4 番目の腰部の代表的なμCT画像を示す。 EXD処理マウスの腰椎内には、対照OVXマウスよりも多くの骨梁が見られる。 μCT画像からのデータは、第4腰椎の骨量/組織体積（BV / TV）の増加、小柱数（Tb.N）、および小柱の厚さ（Tb。Th）および小柱間隔（Tb。Sp）<html> EXDマウス（ ...

ここでは、浸漬、煎出、ろ過、および濃縮の4段階でerxian decoction（EXD）の準備を行い、準備したEXD含有血清のラットへの投与を実証する。これらの方法は、伝統的な漢方薬などの薬草煎じ薬のin vivoおよびin vitro研究に適用可能である。

漢方薬の準備：Er-Xian煎じ薬とEr-Xian含有血清<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;実験

Traditional herbal medicine, an alternative medicine in the clinical setting, has received increased attention in recent years. Before delivery to the ...

本手順の全体的な目的は、in vivoおよびin vitroでの応用のために、伝統的な中国漢方薬である二仙（er-xian）煎剤を調製することです。この方法は、伝統的な中国医学の調製と応用に関する、漢方薬分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、水抽出の工程が臨床現場で使用されるものと同様であることです。1回分の二仙 decoction 用の生薬を蓋付きの容器に入れ、生薬が約1インチ浸かるまで十分な量の蒸留水を加えます。容器に蓋をし、生薬を1時間浸漬させます。その後、ガスコンロを強火に設定し、水が沸騰するまで生薬を加熱します。火力を弱めて弱火で煮出し、薬草を2時間煎じます。1回目の煎じ出しが終わったら、500 mLのガラスビーカーをガーゼと綿で覆い、ろ過して煎じ液のみを慎重にビーカーに注ぎます。ろ紙上の薬草の残渣を容器に戻し、薬草が完全に浸かり、さらに1インチほど水面が上がるまで十分な蒸留水を加えます。先ほど示したように2回目の水煎剤を作成した後、煎剤を1,000 mLビーカーにろ過し、石綿除去済みワイヤーガウスを載せたガスコンロの上にビーカーを置きます。ガラス棒を用いて溶液をゆっくりと絶えず撹拌しながら、弱火で煎剤を加熱します。煎剤が200 mLまで濃縮されたら、溶液を500 mLビーカーに移し、先ほど示したように100 mLまで濃縮します。足指つまみ法により適切な鎮静レベルを確認した後、最後のエールシャン（er-xian）煎剤投与から1時間後に、煎剤投与群の動物の腹部から胸部底部にかけて、直線的な手術用鋏を用いて皮膚および腹膜に長さ5 cm、深さ0.5 cmの切開を加えます。ティッシュペーパーを用いて腹腔内臓器を移動させ、腹部大動脈の結合組織を除去して血管を露出させます。次に、22G針を装着した10 mLシリンジを用いて、腹部大動脈から8～10 mLの血液をゆっくりと採取し、15 mL滅菌チューブに移します。室温で30～60分間血液を凝固させた後、遠心分離により細胞を回収します。各動物から得られた血清を、単一の滅菌済み50-milliliterチューブに慎重にまとめ、56 degrees Celsiusのウォーターバスで30分間加熱して血清を不活化させます。最後に、孔径0.22-micrometerで親水性ポリエーテルスルホン膜を備えたシリンジフィルターを用い、血清を50-milliliterコニカルチューブにろ過して直ちに使用します。卵巣摘出（OVX）マウスの腰椎切片のヘマトキシリン・エオジン（H&amp;E）染色により、生体内で二仙湯（er-xian decoction）治療を行った後、骨梁が増加していることが分かります。対照群のOVX動物と比較してください。対照群のOVXマウスと、二仙湯を2週間投与したOVXマウスの第4腰椎の代表的

preparation-herbal-medicine-er-xian-decoction-er-xian-containing

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Medicine

医学

この記事では、動物実験用のグシュカン顆粒およびインビトロ実験用血清を含むGSK顆粒の作業溶液を調製するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコルは、生体内およびインビトロ実験の両方の処方箋と同様に、漢方薬の薬理学的調査に適用することができます。...

インビボおよびインビトロ実験用グシュカン(GSK)顆粒の調製

このプロトコルは、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供します。このプロトコルは、漢方薬(TCM)の最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。...

損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索

このプロトコルでは、Box-Behnken実験計画応答表面法を適用してEpimedii...

Epimediiフォリウムマトン油加工技術の最適化とゼブラフィッシュ胚発生への影響の検証

私たちは、ex vivoで標識された細胞とマウスモデルで、MRIを用いたin vivo細胞追跡のための一般的なプロトコルを記述します。細胞標識、画像取得処理および定量のための標準的なプロトコルが含まれる。...

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

この方法は、マウスモデルにおける新規薬物の薬物動態を評価するために、頸動脈を介して安定した薬液を送達することを目標に開発された。...

マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

ここでは、腫瘍細胞代謝のリアルタイムモニタリングと、転移のin vivoニワトリ胚絨毛膜-尿膜(CAM)モデルを組み合わせて、腫瘍細胞をDNA損傷化学療法に感作する能力について、新規の抗がん標的/薬剤を評価するために使用されます。...

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、蛍光色素標識ナノボディおよび従来の抗体を使用して、マウスにおけるin vivo近赤外蛍光異種移植イメージング実験のex...

ナノボディ及び抗体ベースの検証<em&gt;インビボ</em使用してマウスにおける&gt;腫瘍異種移植NIRFイメージング実験<em&gt;エクスビボ</em&gt;フローサイトメトリーおよび顕微鏡

ヒト腫瘍異種移植片は、血管新生およびインビボでの増殖期の間に、マウス起源の細胞によって浸潤されています。下流の分析の間に、これらの混入細胞によって引き起こされるバイアスを回避するために、我々は、磁気細胞選別により、すべてのマウス細胞の包括的枯渇を可能にする方法を開発しました。...

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

ここでは、脂肪肝のin vivoおよびin vitroモデルを生成し、脂肪性の表現型と関連する生理学的パラメータを分析するための最適化された方法が説明されています。...

の最適化分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;脂肪肝

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

学ぶEr-Xian煎じ薬の標準化調製法。ラットへの経口投与と血清採取によるインビトロ実験用含有血清の調製手順を解説。骨形成促進効果の検証方法も含む。

漢方薬の準備：Er-Xian煎じ薬とEr-Xian含有血清

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