Name: 流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶ 流れ下での血小板の脱顆粒と分泌を生きた細胞イメージングで追跡する方法。蛍光顕微鏡を用いて亜細胞レベルの動態をリアルタイムに観察し、血栓症と止血のメカニズム研究に有用なプラットフォームを提供します。

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CMは、C1-インヒビター欠損症（HAEi）、Viralen van Het UMC Utrecht、およびLandsteiner for Blood Transfusion Research（LSBR）の国際患者医療機関からの資金援助を認めています。

この研究のものを含む、 生体外での研究目的のために、血液の採取を承認した大学医療センターユトレヒトの地方医療倫理委員会。 1.ソリューションの準備<ol><li> 10mMのHEPES、0.5mMのNa 2 HPO 4、145mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgSO 4 、および5.55mMのD-グルクロン酸を溶解することによって4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）タイロード緩衝液を調製する。蒸留水中のグルコース。 <ol><li>緩衝液の2つの変異体を作製する：pHレベルをそれぞれ6.5および7.4に設定する。実験の毎日のために新鮮な緩衝液を作る。 10 ng / mLのプロスタサイクリンを補充する。 </li></ol></li><li> 50mM Trisと150mM NaClを蒸留水に溶解し、pHを9.0に調整してTRIS緩衝食塩水（TBS）を調製します。 </li><li> 85 mMクエン酸三ナトリウム、71 mMクエン酸、111 mM D-グルコースを溶解して酸クエン酸デキストロース（ACD）を調製する。澄んだ水。 </li><li> HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）に2％（v / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を加えて固定液を調製する。溶解させるために加熱し（50〜70℃）、pHを7.4に設定する。等分し、-20℃で保存する。使用前に37℃で解凍する。 </li><li> 1％（m / v）のヒト血清アルブミン（HSA）をHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）に溶解してブロッキングバッファーを調製する</li><li> グリセロール12gにポリビニルアルコール4.8gを加えてポリビニルアルコール溶液を調製し、よく混合する。 12mLの蒸留水を加え、室温で一晩回転器に放置する。 <ol><li> 0.2M Tris-HCl（pH8.5）24mLを添加する。 30分間混合しながら50℃に加熱する。 1.25gの1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）を添加し、よく混合する。 1,500 xgで5分間遠心分離する。等分した上清（15-20のスライドには1mLで十分です）を-20℃で保存します。アリコートは一度使用してください。 </li></ol></li></ol>カバーガラスの準備<ol><li> Degreaseカバー原液（25×50mm 2 ）中に希釈していないクロム硫酸で一晩インキュベートする。カバーグラスを蒸留水ですすぎ、オーブンで60℃で一晩乾燥させます。 </li><li>パラフィン膜（10×15cm 2 ）のストリップを実験室のベンチの上に水滴で付着させ、パラフィン膜を平滑にして空気を除去する。パラフィン膜上に10μg/ mLのVWFまたは100μg/ mLのフィブリノーゲンの80μLのピペットを滴下する。眼鏡を滴の上に置きます。タンパク質溶液は2つの表面の間に広がり、ガラスの裏面全体を覆う。室温（RT）で1.5時間インキュベートする。 </li><li>パラフィン膜を除去し、コーティングされた面をブロッキング緩衝液を含む4ウェルプレートに入れて、カバーガラスを置いてブロックする。 37℃で1時間または4℃で一晩インキュベートする。対照として、VWFまたはフィブリノゲンでコーティングされていないカバーガラスをブロックする。 </li></ol>血小板富化血漿（PRP）の調製</p&gt; <ol><li>静脈穿刺によりクエン酸塩全血（最終濃度：0.32％クエン酸ナトリウム（M / V））を採取する。 </li><li>ブレーキなしで160 xgおよびRTで15分間血液を遠心分離する。プラスチックのパスツールピペットで上清（ すなわち、 PRP）を集める。 注：遠心分離後、3つの層が上から下に観察される：PRP、白血球、および赤血球。白と赤のセルは含めないでください。典型的には、9mLの血液チューブを遠心分離した後、3mLのPRPを収集することができる。 </li><li>実験が洗浄された血小板を用いて行われる場合は、セクション4に進む。 PRPが必要な場合は、次の手順に進みます。 </li><li> PRPを採取した後、残りの血液（赤血球を含む）を再び2,000 xgで10分間、ブレーキをかけずに遠心します。血小板欠乏血漿（PPP）を含む上清を集める。 注：通常、この2回目の遠心分離ステップ後に2 mLを集めることができます。 </li><li> pの数を数えるラットレットをPRPに添加し、150,000血小板/μLの濃度までPPPで希釈する（ステップ3.4）。 注：希釈PRPの総量は、ドナーの血小板数に依存する。血小板数はドナー間で大きく異なり、PRP希釈は個々の基準で評価する必要があります。血小板数は、150,000〜450,000血小板/μLの範囲内で正常とみなされます。 </li><li>セクション5に進みます。 </li></ol> 4.洗浄された血小板の調製<ol><li>細胞分析装置を用いてPRP中の平均血小板容積（MPV）を決定する。 注：これは血小板プレ活性化の指標です11 。血小板を静止させるための正常なMPVは、7.5〜11.5fLである11 。 MPVは、血小板洗浄処置中に1.5fL以上増加してはならない。 </li><li>血小板の前活性化を防ぐためにPRPに1/10容量のACDを加え、ブレーキなしで400 xgおよびRTで15分間遠心する。 suを削除するHEPESタイロードバッファー（pH 6.5）中でペレットを注意深くPRPの元の容量に再懸濁する。 </li><li> 10μg/ mLの濃度にTBSを添加することによってプロスタサイクリンのアリコートを解凍する;それを氷上に保つ。 </li><li>血小板の活性化を防ぐために、再懸濁した血小板にプロスタサイクリンを10ng / mLの最終濃度で添加し、すぐにブレーキなしで400xgおよび室温で15分間遠心する。上清を除去し、HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）中で注意深くペレットを再懸濁する。 </li><li>血小板の数をカウントし（ステップ3.5）、MPVの変化を決定する（ステップ4.1）（MPVは1.5fLを超えて変化してはならない）。 </li><li> HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を用いて150,000血小板/μLの濃度に血小板数を調整する。実験に先立ち、血小板をRTで30分間回復させる。隔離後4時間以内に洗浄した血小板を実験に使用する。 </li></ol> 5.フローチェンバーアセンブリ12を使用しています。さらなる分析のために優先的に除去可能なカバーガラスを保持することができる限り、様々な商業的に製造されたフローチャンバを使用することができる。記載された実験に使用されるフローチャンバーは、ポリ（メチルメタクリレート）から作られ、顕微鏡インサートステージに正確に適合する。それは、入口と出口（ 図1A〜C ; 1,2）、および真空接続（ 図1AおよびC ; 3）を含む。カスタマイズされたシリコンシート（ 図1AおよびD ; 4）が上に配置される。カバーガラス（ 図1A ; 6）をチャンバーにしっかりと取り付けるために、2つの切り欠きが真空チャンネルを形成します（ 図1AおよびD ; 5）。中央の切り欠きが流路を形成する（ 図1A </strong&gt;とD ; 7;幅2.0mm、高さ0.125mm）。入口および出口は流路に接続され、真空は真空チャネルに接続される。 <ol><li>フローチャンバーの上部を蒸留水で覆い、カスタマイズされたシリコンシートを滑らかな面を下にして水の上に置きます。シートを所定の位置に保持したまま余分な水分を除去してシートを定位置に浮かせます。 注：このシリコーンシートは再使用可能です（シリコーンはその不活性特性で知られています）。一般に、血小板はそれに付着することが観察されていない。シートは洗剤で拭き取ることができ、材料が損傷するまで（ すなわち 、特にチャネル間の領域で裂ける）、再使用することができる。一般に、シートは1日に複数の実験を行って20日間使用することができる。 </li><li> 60℃で1時間フローチャンバーをインキュベートして残留水を蒸発させて、シリコーンシートをフローチャンバーにしっかりと接着させます。 </li><li>プラスチックのパスツールピペットで、HEPES Tyrode緩衝液（pH7.4）を流路に流した。コーティングされた面を下にして、カバーガラス（セクション2を参照）をフローチャネル上に置きます。真空ポンプを真空接続部に接続します（ 図1Aおよび図 C ; 3）。 10kPaの圧力をかけてください。 </li></ol> 6.血小板の前染色および抗体の調製<ol><li> 血小板染色 <ol><li>洗浄した血小板を10μg/ mLのDAPIと共に30分間37℃で暗所でインキュベートする。結合していないDAPIを洗い流し、血小板活性化を防ぐために、プロスタサイクリンを最終濃度10ng / mLで添加し、即座にブレーキなしで400xgおよびRTで15分間遠心分離する。 </li><li>血小板ペレットをHEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）で再構成して、150,000血小板/μLの血小板濃度にする。 </li></ol></li><li> 抗体の調製 <ol><li>ビオチン標識抗体とAlexa標識strepを混合するタビジンを1：1のモル比で含む。使用前に室温で最低10分間インキュベートする（ステップ7.6）。 注：ビオチン標識効率は、バッチごとに異なる場合があります。標的分子の視覚化に問題がある場合、成功したビオチン化および特異的ビオチン化抗体の標的結合特性を確認するための対照実験を実施すべきである。 </li></ol></li></ol> 7.灌流<ol><li>蛍光顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを起動します。 表1に示す顕微鏡設定を使用します。 注：顕微鏡ソフトウエアに適切な実験をロードすることにより、血小板および選択された蛍光標識抗体および/または色素の生細胞視覚化および記録のための顕微鏡および記録設定を開始する。室温でフロー実験を行う。 </li><li>チューブに10 mLシリンジを接続し、1％HSA bloを吸引して吸入チューブをブロックする入口チューブに緩衝液を入れる。 RTで15分間インキュベートする。 HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を吸入管に吸引することによって吸入管をすすぐ。 </li><li>ブロックされたインレットチューブと未処理のアウトレットチューブを直径1.02 mm、長さ約20-30 cmでチャンバーの入口と出口に接続します。出口チューブに10 mLのシリンジを接続します（より正確には、容量を小さくしてください）。シリンジポンプの電源を入れます。 注記：シリンジの直径は、ポンプに設定された流量と組み合わせて、容積流量を決定します。流路の表面積と共に、せん断速度は、式13に従って計算することができる 以下。したがって、シリンジポンプの流量を変更することによって、または流路の寸法を変更することによってせん断速度を操作することが可能である。せん断速度800〜1,600s -1は、典型的には動脈血流をモデルとし、25〜100s -1モデルは静脈血フロー。この設定では、7.5μL/分の流速は25s -1のせん断速度をもたらす。 せん断速度= 6Q / h 2 w -1 s -1 ここで、Q =容積流量（mL / s）、h =高さチャンネル（cm）（0.0125cm、これはシリコーンシートの厚さ）、w =幅チャンネル（cm）（このチャンバーでは0.2cm）。 </li><li> 100倍の対物レンズ（1000倍の全増幅）に1滴の浸漬オイルを置き、ガラス面を下にして顕微鏡にチャンバーを取り付けます。 </li><li>インレットチューブをHEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）を入れたチューブに入れます。出口チューブに接続されたシリンジのプランジャーを手動で引っ張り、溶液をチャンバーに通してシステムから空気を除去します。シリンジポンプ（ 図1B およびC ; 8）にシリンジを置き、ポンプを短時間作動させてプランジャーを締め、安定した流れを確保します。 </li><li>血小板懸濁液またはPRPに抗体および/または色素を慎重に添加する。プラスチックピペットで混合し、混合物を1.5mLチューブに移す。 注：せん断速度25s -1 （7.5μL/分）での典型的な30分間の灌流のために、最低225μLの血小板懸濁液が必要である。代表的な結果に用いた抗体を表2に示す。 </li><li> HEPES Tyrodeの緩衝液（pH 7.4）から、PRPまたは洗浄した血小板、抗体および/または色素（ 図1B およびC ; 9）の入った1.5mLチューブに注入チューブを押し込みながら移動させます。 注記：チューブを移動するとき、チューブに空気が入るのを防ぐために、チューブを絞る（空気を押し出す）ことが重要です。同様の方法で入口チューブを別のチューブに移動させることにより、後続のステップで様々な試薬で接着血小板を治療することが可能である。潜在的に有用な試薬のリストを表3に示す 。 </li><li> 「ライブ映像を選択するn &quot;オプションを使用して、カバーガラスの表面に顕微鏡を向け、血小板がフローチャンバーに達するまで1,600 s-1 （484μL/分） の剪断速度でポンプを始動させます。シリンジポンプの設定を7.5μL/分の流量に変更することにより、せん断速度を25 s-1に戻します。 </li><li>カバーグラスのコーティングされた面の表面をモニターし、最初の血小板が付着し始めるのを待って顕微鏡をこの血小板に合焦させ、ソフトウェアで実験を開始して記録を開始する。ここで使用される録画設定については、 表1を参照してください。 </li><li>ライブ録画を視覚的に追跡します。 30分後、シリンジポンプを停止する。 注：実験中に血小板にフォーカスが当たっていることを確認してください。典型的には、20〜30枚の血小板が視野内に1,000倍の倍率で付着する。これは流路全体で約2,000〜3,000の血小板である。 </li><li> 使用して固定フローチャンバー（オプション）。 <ol><li>シリンジポンプが停止した後にフローが停止したら、注入チューブ（空気なし）を固定溶液に移します。ポンプを再起動し、手順7.8で述べたのと同じ流量で最低10分間、チャンネルを通して固定バッファーを流します。 </li></ol></li><li>顕微鏡からチャンバーを取り出し、ガラスから浸漬油をきれいにし、真空を外し、18Gの針でカバーガラスをチャンバーから慎重に取り出します。 注記：カバーガラスが破損してシリコンシートが損傷するのを防止します。 </li><li>蒸留水で予め濡らした組織の上にある4ウェルプレートにカバースライド（細胞を上向きにして）を置く。 注：これにより、カバーガラスがウェルの表面に付着するのを防ぎ、乾燥を防ぎます。 </li><li>カバーグラスの上に750μLの固定液をピペットで入れ、室温で1時間インキュベートする。試料を直接分析することができない場合、安定した固定を確実にするために、4℃で0.5％PFA（HEPES Tyrode緩衝液、pH 7.4で希釈）に保存してください。イメージングのためにカバーガラスを処理するには、セクション8に進んでください。 </li><li>使用後、チャンバー、配管、およびシートを蒸留水ですすぎ、洗剤溶液で一晩インキュベートする。チャンバーやその他の部品を再使用する前に、蒸留水ですすいでください。 </li><li>すべてのメタデータを含む顕微鏡生データファイルを保存します。必要に応じて、ムービーを.MOV、h.264圧縮、または.AVIを非圧縮にエクスポートします。別々のフレームをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。 </li></ol>共焦点蛍光顕微鏡の試料調製<ol><li>カバーグラスを新しい4ウェルプレートに移し、3 mLのHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）で5回リンスします。 3mL /ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>ブロッキングバッファを削除します。 HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）中に0.15％グリシン（M / V）3mL /ウェルを添加する。 Rで15分間インキュベートするT. </li><li>グリシン溶液を除去し、3mL /ウェルのブロッキング緩衝液で5回洗浄する。必要に応じて、追加の染色のためにブロッキング緩衝液で希釈したフルオロフォア結合抗体を添加する。暗所でRTで1時間インキュベートする。 </li><li>ブロッキングバッファーで5回、蒸留水で2回洗浄する。細胞に触れることなく、余分な液体をティッシュで（縁の内側から）取り除いてガラスを乾燥させます。 </li><li>顕微鏡スライド上に60μLのポリビニルアルコール溶液をピペットで加える。細胞を落とした上にカバーガラスを置き、ポリビニルアルコールを2つの表面の間に広げます。暗所でRTで一晩インキュベートする。 </li><li>共焦点顕微鏡法で細胞を分析する14 。 </li><li>すべてのメタデータを含む記録されたスタックデータの生データファイルを保存します。必要に応じて、RAWデータファイルをMOV、h.264圧縮ファイル、または.AVI非圧縮ファイルに処理します。別々のスタックをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

世界中で、血栓症は死亡および罹患率の主要な原因であり、血小板はその発症の中心的役割を果たす。この研究は、血小板脱顆粒の生細胞イメージングのための方法を記載している。一般に、血小板が活性化されると、全ての顆粒状の内容物が直接溶液中に放出されると想定される。付随する結果は、これが必ずしも当てはまらないことを示唆している。接着および脱顆粒の間、血小板はかなりの量のポリリン酸を保持する（ 図4 ）。さらに、多量体タンパク質VWFは、脱顆粒後の血小板表面と関連している（ 図5 ）。これは、血小板顆粒脱顆粒を制御する分子機構が、一般的に想定されているよりも微妙であることを示している。 流れの下での血小板脱顆粒の生細胞イメージングを可能にするために、実験条件を選択して血小板凝集を最小限に抑えた。血小板カウンター150,000血小板/μLのtsが使用された。これは正常範囲の下限にある（150,000〜450,000血小板/μL）。さらに、固定化されたVWFまたはフィブリノーゲンについて、血小板接着および広がりを調べたところ、軽度の...

血小板は、血流中を循環する無核細胞である。彼らの主な機能は、損傷の部位での血管侵害を封鎖し、失血を防ぐことである。損傷のこれらの部位では、内皮下コラーゲン繊維が露出され、続いて多量体タンパク質、フォンビルブラント因子（VWF）によって覆われる。 VWFは、細胞表面1上の糖タンパク質Ibα-IX-V複合体に依存し、血小板の速度を減速させる機構において血小板と循環して相互作用する。これは、高剪断速度において特に重要である。その後、血小板は、コラーゲンから活性化インパルスを受けながら形態学的変化を受ける。これは不可逆的な広がりをもたらし、最終的には血小板の凝集をもたらす。両方のプロセスは、血小板 - 血小板のクロストークを促進するために顆粒内容物の分泌に依存する。とりわけ、血小板α顆粒は、血小板接着を助け、橋渡しするためにフィブリノゲンおよびVWFを含むインテグリン依存的に血小板を結合する。血小板高密度顆粒は、カルシウムおよびアデノシン二リン酸（ADP）を含む無機化合物2を含み、血小板活性化を強化するのに役立つ。さらに、血小板は、（アレルギー性）炎症3 、補体制御タンパク質4および血管新生因子5,6のメディエーターを含有し、これらの内容物が様々な条件下でどのように差異的に放出されるかおよびどのように放出されるかについての疑問を生じさせる。 1980年代以来、血流モデルにおける血小板機能の研究は、血栓性メカニズムの研究にとって重要である7 。それ以来、多くの技術的進歩がなされており、フィブリン形成を含むフローモデルは、現在、治療用血小板濃縮物の生体外での潜在能力をアッセイするために開発されている血栓形態に及ぼす剪断速度の乱れの影響を調べる9 。安定した接着および生理学的血栓形成（止血）対病理学的な血栓形成（血栓症）を促進する分子および細胞 - 生物学的機構の相違は非常に微妙であり、これらの亜細胞のリアルタイム視覚化を可能にする流れモデルの開発を促すプロセス。 そのような設定が価値があるプロセスの例は、細胞内ポリリン酸の（再）分布と、これがフィブリン超微細構造10に与える時間依存性の影響を明らかにするための凝固因子の動員である。研究はしばしばエンドポイント分析に限定されます。記載された方法の主な目的は、血小板活性化の間に起こる動的細胞内プロセスのリアルタイムの視覚的調査を可能にすることである。

<table><tbody><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>プロスタサイクリン&nbsp;</td><td>ケイマンケミカル</td><td>18220</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム</td><td>メルクKGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸&nbsp;</td><td>メルクKGaA</td><td>1.00244カバー</td><td></td></tr><tr><td>メガネ</td><td>Menzel-GL&auml;ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm、No.1 = 0.13 - 0.16 mmの厚さ。</td></tr><tr><td>クロム硫酸(2%CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0]。</td></tr><tr><td>Von Willebrand factor (VWF)</td><td>in-house purified</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4 well dish, non-treated</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>採血管、9 mL、9NC 凝固クエン酸ナトリウム 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Cell Analyser&nbsp;</td><td>アボット・ダイアグノスティック</td>ス <td>CELL-DYN 血液分析装置</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン</td><td>ハーバード装置22</td><td></td></tr><tr><td>10 mLシリンジ、直径14.5 mmの</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lokシリンジ</td></tr><tr><td>抗CD63-ビオチン&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>抗CD62P-ビオチン&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油</td><td>ツァイス</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>洗剤溶液</td><td>ユニリーバ、バイオテックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>シグマ</td><td>9002-89-5</td>モ<td>ビオール40-88。</td></tr><tr><td>トリス塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価 (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn フィルム</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 インチ x 125 フィート ロール。</td></tr><tr><td>シリコンシート、非強化</td><td>、Nagor</td><td>NA 500-1</td>、<td>200 mm x 150 mm x 0.125 mm。</td></tr><tr><td>灌流と真空チャンネルを備えたカスタマイズされたカットシリコーンシート</td> 自社<td>製</td><td></td><td>シリコーンシート製 非強化 (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイスオブザーバー Z1&nbsp;</td><td></td><td>LED励磁灯を装備。</td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipet</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp;7 mL 非滅菌、最大 3 mL まで目盛り付き。</td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>内径 x 外径 x 肉厚 = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm。</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm、接地端 45 °deg;、つや消し端。</td></tr></tbody></table>

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

血小板は、止血における重要な役割を果たし、血管侵害を封鎖するための血栓の形成である。それらは血栓症、脈管構造を閉塞させ、器官を傷つける血栓の形成にも関わり、生命を脅かす結果となる。これは、血小板機能に関する科学的研究と、フロー条件下で起こる細胞生物学的プロセスを追跡する方法の開発を促す。 血小板の生物学における2つの重要な現象である血小板の接着と凝集の研究には、さまざまなフローモデルが利用できます。この研究は、活性化の間の流れの下でのリアルタイム血小板脱顆粒を研究する方法を記載している。この方法は、広視野の逆LEDベースの蛍光顕微鏡の下に置かれたシリンジポンプ装置に連結されたフローチャンバを利用する。ここで説明する設定は、蛍光標識された抗体またはフルオレセインによって送達される複数のフルオロフォアの同時励起を可能にする染料。生細胞イメージング実験後、カバーガラスは、静的顕微鏡法（ すなわち、共焦点顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、さらに処理および分析することができる。

図1は、フローチャンバおよび実験装置の画像を示す。シリコンシートの位置および寸法;チュービング接続。 図2は、フローチャンバーの寸法の詳細を示しています。 図3およびムービー1は、固定化されたVWF上の血小板接着および広がりの画像の時系列を示す。 CD63は、休止血小板15の細胞内高密度顆粒膜に挿入される膜貫通タンパク質である。血小板表面へのその時間依存的動員は緑色で示されている。同様に、P-セレクチン（Psel）は、休止血小板の細胞内α-顆粒の膜に挿入された膜貫通タンパク質である。血小板表面へのその時間依存的動員はオレンジ色で示されている。 図3Bは、45°の角度での代表的な画像を示すフロー実験後に共焦点蛍光顕微鏡によって取得した。 映...

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

本実験の全体的な目的は、ライブセルイメージングを用いて、血流下における血小板の脱顆粒および分泌を追跡することです。この手法は、血小板生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、生存細胞内のサブセルラーレベルで、血小板の内容物を多角的に調査できることです。この手法は血小板機能に関する知見を提供しますが、マスト細胞などの他の細胞型にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、血小板の分離過程における事前活性化の問題に直面し、苦労することがあります。私たちは、血小板の分泌がエンドポイント段階でしか評価できないことに気づいたとき、初めてこの手法を考案しました。リアルタイム画像により、血小板顆粒放出の放出速度論に関する情報を得ることができます。まず、当研究所の学生であるSilvia Pignatelliが血小板分離の手順を実演します。次に、Arjan Barendrechtがリアルタイムイメージング実験を実演します。まず、カバーガラスを未希釈のクロモスルホン酸に一晩浸漬して脱脂します。翌日、蒸留水で洗浄します。その後、乾燥させるために60 °Cのオーブンに一晩入れます。次に、実験台の上に水滴を1滴落とし、台とフィルムの間の空気を抜きながら、10 cm × 15 cm のパラフィンフィルムを水滴の上に密着させます。続いて、10 µg/mL の von Willebrand factor または 100 µg/mL の fibrinogen を 80 µL ずつパラフィンフィルム上にピペットで滴下します。滴の上に乾燥したカバーガラスを載せ、室温で1時間30分間インキュベートします。次に、4ウェルプレートの各ウェルに3 mLのブロッキングバッファーを加えます。コーティング面を上にして、カバーガラスをプレートの各ウェルに転送します。4 °Cで一晩インキュベートします。クエン酸処理した全血9 mLを、ブレーキなしで160 ×gにて15分間遠心分離します。次に、プラスチック製パステールピペットを用いて、血小板豊富血漿（PRP）を含む上清を回収します。血小板の事前活性化を防ぐため、血小板の容量に対して1部の酸性クエン酸デキストロースを9部の割合で加えます。次に、血小板を400 ×gで15分間、ブレーキをかけずに遠心分離します。続いて、上清を除去し、血小板のペレットを残します。その後、ペレットをpH 6.5のHEPES Tyrode緩衝液で、血小板サンプルの元の容量に戻るまで慎重に再懸濁します。次に、再懸濁した血小板にプロスタサイクリンを添加します。直ちにサンプルを遠心分離し、上清を除去します。ペレットをpH 7.4のHEPESタイロード緩衝液で慎重に再懸濁します。次に、洗浄した血小板を細胞分析計にかけ、血小板数をカウントします。pH 7.4のHEPES Tyrode緩衝液を用いて、サンプル中の血小板数を150,000 platelets/µLの濃度に調整します。再懸濁後、実験を開始する前に、室温で30分間静置して血小板を回復させます。フローチャンバーの上部を蒸留水で覆い、カスタムメイドのシリコンシートの平滑面を下にして水の上に置きます。シートの位置を保持したまま余分な水を取り除き、シートを適切な位置に浮かせて配置します。フローチャンバーを60 °Cで1時間インキュベートし、残留水を蒸発させてシリコンシートをフローチャンバーにしっかりと密着させます。プラスチック製パストールピペットを用いて、pH 7.4のHEPES Tyrode緩衝液を1滴、フローチャネルに滴下します。次に、準備したカバーガラスのコーティング面を下にして、フローチャネル上に配置します。真空ポンプを約10 kilopascalsの圧力で起動し、フローチャンバーの真空接続部に真空ポンプを接続します。洗浄した血小板に10 µg/mLのDAPI染料を加え、血小板の入ったチューブをアルミホイルで包みます。その後、37 °Cで30分間インキュベートします。血小板の活性化を防ぐため、最終濃度10 ng/mLになるようにプロスタサイクリンを添加し、直ちにブレーキを使用せずに400 ×gで15分間遠心分離して、未結合のDAPIを除去します。血小板ペレットをpH 7.4のHEPES Tyrode緩衝液で再構成し、濃度が150,000 platelets/µLとなるよう元の容量に戻します。次に、蛍光顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアを起動します。付属のテキストプロトコルの表1に記載されている通りにイメージングパラメータを設定してください。10 mLのシリンジを接続し、ブロッキングバッファーをインレットチューブに吸引して、チューブをブロックします。室温で15分間ブロックした後、HEPES Tyrode buffer 7.4をインレットチューブに吸引して、チューブ内を洗浄します。ブロック済みのインレットチューブと未処理のアウトレットチューブを、チャンバーのインレットおよびアウトレットにそれぞれ接続します。次に、10 mLシリンジを流出口チューブに接続します。100倍対物レンズに浸油を1滴垂らし、ガラス面を下に向けてチャンバーを顕微鏡に装着します。続いて、流入口チューブをpH 7.4のHEPES Tyrode緩衝液が入ったチューブに入れます。出口チューブに接続したシリンジのプランジャーを手動で引き、溶液をチャンバーに通過させてシステム内から空気を除去します。次に、シリンジをシリンジポンプにセットし、プランジャーを固定して流量を安定させるため、ポンプを短時間運転させます。フローシステムが準備できたら、抗体および／または色素を血小板懸濁液に添加し、注意深く混ぜ合わせます。次に、入口チューブを絞り、バッファーから標識された血小板を含むチューブへと移動させます。ソフトウェアでライブビジュアライゼーションを選択してください。顕微鏡の焦点をカバーガラス表面に合わせ、ポンプを484 microliters per minuteで始動させます。血小板がフローチャンバーに到達するまでポンプを作動させます。次に、流速を7.5 µL/minまで下げます。カバーガラスの表面を観察してください。最初の血小板が付着し始めたら、顕微鏡の焦点をその血小板に合わせ、ソフトウェアで実験を開始して記録を開始します。30分間記録した後、シリンジポンプを停止させます。すべてのメタデータを含む顕微鏡の生データファイルを保存します。必要に応じて、動画をMOV H 264圧縮またはAVI非圧縮形式でエクスポートします。個別のフレームはJPEGまたはTIFファイルとして保存します。イメージングが終了したら、チャンバーを顕微鏡から取り出し、ガラス面から浸漬油を拭き取り、真空を解除して、18ゲージの針を用いてチャンバーからカバーガラスを慎重に取り除きます。細胞面を上に向けたカバーガラスを、蒸留水で事前に濡らしたティッシュの上に置き、新しい4ウェルプレートに入れます。次に、カバーガラスの上に固定液を750 microlitersピペットで添加し、室温・暗所で1時間インキュベートします。サンプルをすぐに解析できない場合は、安定した固定を維持するため、0.5%paraformaldehyde中で4 degrees Celsiusで保存してください。これは、固定化されたvon Willebrand factorでコーティングされたガラススライド上における、血小板の接着と展展のタイムコースを示しています。緑色で示されているのはCD63であり、これは時間依存的に血小板表面へ移行する膜貫通タンパク質です。同様に、オレンジ色で示されているP-selectinも、血小板を停止させる細胞内α顆粒の膜に挿入されている膜貫通タンパク質です。フロー実験の後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて血小板接着のティルトシリーズを作成できます。ここで示されているように、CD63は主に中心部の顆粒細胞（granulomere）に位置し、P-selectinは細胞体全体に分布し、エッジ部分に濃縮して現れています。これらの実験では、核DNAを持たない血小板を、青色に発色するDAPIでプレインキュベートしました。この例では、DAPIがポリリン酸および高密度顆粒を染色しています。その後、緑色の染色として現れるのは、時間依存的なCD63の血小板表面への移動です。高密度顆粒の放出を示す明確な兆候があるにもかかわらず、単一細胞分析の結果、ポリリン酸はこれらの血小板内または表面に保持されていることがわかります。この手法に習熟すれば、4つの独立したフロー実験を6時間で完了させることができます。この手順を行う際は、血小板の事前活性化を防ぐことが重要です。これは、細胞懸濁液を慎重に操作することで達成できます。この手順に続き、共焦点顕微鏡などの他の手法を用いて、標的分子の三次元的な分布に関するさらなる知見を得ることができます。このビデオを視聴することで、単一細胞レベルでの血流下における血小板機能の研究方法について、十分な理解が得られたはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

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生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

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マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

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コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

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流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

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