Name: 四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学ぼう、4種類のバイオセンサープラットフォームを用いて高親和性抗体の抗原結合速度を測定する方法。Biacore T100、ProteOn XPR36、Octet RED384、IBIS-MX96の実験プロトコルとデータ品質の比較解析を動画で解説。

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著者は、IBIS MX96の技術支援のためにノア・ディットとアダム・マイルズ感謝します。

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</ol>

このビデオ記事の掲載料は、ベーリンガーインゲルハイム製薬によって支払われました。

私たちの頭に頭の比較研究では、各バイオセンサープラットフォームは、独自の長所と短所を持っていることを示しています。抗体の結合プロフィールは、視覚的な比較（ 図3から6）により類似しているにもかかわらず、取得した速度論的速度定数の順位（ 図7）機器を横切って非常に一貫している、我々の結果はとそのSPRベースの器具を示します連続流動流体工学）遅い解離速度を有する高親和性相互作用を解決するに優れています。解離相中上方ドリフトがデータセットで観察される（ 例えば 、モノクローナル抗体2、モノクローナル抗体5、およびmAb 9; 図5）BLIの流体フリー機器によって生成されました。この知見は、システムの主要な制限であるマイクロプレートに時間をかけて蒸発をサンプリングするために大部分起因すると考えることができます。この固有の制限で、実験時間はまた、12未満の時間に制限されます。実験は、そのためのshでプログラムされました他のプラットフォーム（10分間会合および45分間解離）のものと比較しorter時間（500秒会合および30分間解離）。 BLIベースの機器によって生成された速度定数は、オフレートのいくつかの変動の結果（ 図8Cのように少ない直線性を示ししかし、実験時間を短縮することは、データ品質/一貫性に蒸発の影響を緩和するようには見えませんでした）。サンプルの蒸発に加えて、使用される捕捉試薬の違いはまた、得られた結果の違いに寄与したかもしれません。プロテインA / Gは、全ての3つの流体ベースのSPRプラットフォームで使用されたが、AHCセンサは、非流体のBLIのプラットフォームで使用しました。プロテインA / GはAHC、抗体に基づくバイオセンサー表面、プロテインA / G表面からのmAb、抗原複合体のオフ速度が人工のものよりも速く表示されることよりも、モノクローナル抗体のために弱い親和性を有する可能性があるのでAHC表面から得られました。この可能性は、BがサポートされていますY BLIプラットフォームによって生成されたオフ速度値は、他の機器（ 図7、 赤線 ）から得られたものよりも一貫して低かったことを示す実験データ。それにも関わらず、BLIプラットフォームは、他のプラットフォームの上に別の利点があります。例えば、それが原因すぐに使用するための種々のプレコートセンサにセンサ選択およびアッセイ形態に関して非常に柔軟です。我々の実験では、AHCセンサの使用は、準備時間を短縮、リガンド固定化工程の必要性を排除しました。さらに、BLIプラットフォームは、複雑なチューブと値スイッチ構成を備え、他の流体工学SPRプラットフォームに比べてはるかに少ないメンテナンスを必要とします。この機能は、目詰まりや汚染の問題を引き起こす可能性があり、粗サンプルを伴う実験のために有利です。 治療の候補者が増加し、効率的、迅速、かつ正確な識別のための需要が、双方向の必要性として、osensorスループットも高まっています。 4つのバイオセンサプラットフォームのうち、96リガンドアレイ印刷が可能なバイオセンサーからのスループット、最終的に増加縦横に36リガンドフォーマットと16チャンネル同時読み出しとBLIベースのバイオセンサーに結合されたバイオセンサー、続いて、最高であります相互作用の数は、それぞれ96、36および16に単一の結合サイクルで測定します。これらスループット能力は、単一のシリアルフローによって接続のみ4つのフローセルを有することによって制限されている伝統的なSPRプラットフォームのそれよりも有意に高いです。我々の実験は、長い解離時間を持つ複数の面密度で評価した10のmAbの比較的小さなサンプルセットを関与するので、楽器のスループットは、実験の効率を決定する際に、適度な役割を果たしました。そこ3つの高スループットプラットフォームの実験回数に有意差はなかった、とすべてのケースでの実験は、一日で完成しました。一方、従来のシリアルフローSPR実験は、セットアップ後のデータ収集のウォークアウェイ自動化にもかかわらず、完了するまでに3日を要しました。オフ率ランキング/動態スクリーニングまたはエピトープビニングの目的のために、（数百または数千でIE）多数のサンプルを必要とする他の研究では、スループットが重要な要因となります。 IBIS MX96でのスループットは他のバイオセンサーに比べて桁違いに高くなっているため、これらの目的のために最適な選択ですが、それはいくつかの欠点があります。具体的には、CFMによってアレイ印刷は、大きな表面の不整合（ 図1）と低減されたデータの再現性（ 図8D及び8E）を示します。正確な速度論的測定のために、バイオセンサー表面上のリガンドの量は、結合応答が等の二次的要因によって妨害されないように制御される必要がある重要なパラメータであります物質移動や立体障害。ビアコアT100とのProteon XPR36ため、最適なRのLレベルは、研究第17条に記載されるように設定されたR max値の標準的な計算に基づいて決定しました。一方、オクテットRED384とIBIS MX96プラットフォームのため、モノクローナル抗体の捕捉レベルは一定の時間で2倍連続希釈した抗体の系列を用いて実験的に達成されました。捕捉工程の知識又は制御の欠如は、動力学的速度定数の精度を妥協している場合があり、高密度表面と高い結合応答信号（ 図2）が得られました。再生のに関与する複数の結合サイクル測定を行う場合、さらに、SPR検出器からプリンタの分離はまた、課題を提示します。固定化されたプロテインA / GでのmAbのFcを通じてキャプチャとは対照的に、マルチサイクル速度設定を実行する唯一の方法は、mAbの直接アミン結合を介しました他の三つのバイオセンサープラットフォームで表面。結果として、追加の再生スカウト実験は、最適な再生条件を決定するために必要でした。この設定の結果は、より長い実験時間に加えたFc捕捉方法（ 図9）と比較して〜90％低い観察表面活性に連結しました。 Fc捕捉方法を実行するために、別の単一サイクル運動アプローチを採用しました。このアプローチは、各注射（ 図2）との間で再生することなく、漸増濃度での分析物の連続注入を含みます。この利便性の高い、あまり一般的に適用されるアプローチでは、実験時間を短縮し、試薬の消費量を低減するだけでなく、他のバイオセンサー（ 図7）からのものと非常に類似した動力学的速度定数を生じました。したがって、このシングルサイクルの動力学アプローチを適用することは、器具の固有の構成の制限を克服し、提示しますハイスループットな方法で高解像度の反応速度定数を得るための機会。 スループットはビアコアT100の主要な制約にもかかわらず、我々の結果をまとめ、それが最高の品質で最も一貫性のあるデータを生成することを示しています。これは〜10倍高いスループットを持っているのProteon XPR36、続きました。器具検出限界に達したときに技術的に困難であることができる高親和性の抗体 - 抗原相互作用を特徴づける場合、高品質のデータを生成する能力が利点となります。オクテットRED384の計測における体系的な制限は、解離速度定数の正確な測定を妨げている間（ すなわち 、オフ速度が遅いために十分な信号減衰を解決するための感度の短い落下）、ビアコアT100とのProteon XPR36の両方を高感度かつ信頼性の高い提供することができます分化の検出。

抗体-抗原相互作用を特徴付けるための信頼性の高い速度論的パラメータの取得は、創薬および開発プロセスの重要な要素です1。これらの相互作用をリアルタイムで検出するための「ゴールドスタンダード」である光学表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサーは、約20年間、基準を満たす治療用抗体候補の早期選択を可能にするために使用されてきました2,3。粗上清の迅速な結合スクリーニングによる抗体候補の親和性ランキングの提供に加えて4、精製された製剤の厳密な動態定数測定5、バイオセンサーは、エピトープビニング研究を通じてリード候補の機能活性をさらに区別することができます6,7。
さまざまな治療適応><症に対する抗体ベースの製品の需要の高まりに対応するため、近年、候補の同定と特性評価の効率を向上させる革新的なバイオセンサー機器が数多く開発されています9,10.これらの機器は、マイクロ流体チャネル構成の設計や、生体分子相互作用の検出に関与する光学原理が異なります。具体的には、Octet RED38411、ProteOn XPR3612、IBIS MX967 では、1 回の結合サイクルで測定されるインタラクションの数がそれぞれ 16、36、96 に拡大され、従来の Biacore プラットフォームよりもスループットが大幅に向上しています。これらのさまざまなバイオセンサープラットフォームはすべて、抗体-抗原相互作用の特性評価に不可欠な速度論的データを提供しますが、機器構成が異なるため、実験のセットアップと操作手順が異なります。例えば、IBIS MX96のSPRイメージングアレイプラットフォームでは、マルチプレックスリガンド固定化ステップは、検出器とは別の外部印刷装置でオフラインモードで実行されます7,13;対照的に、他の3つのバイオセンサープラットフォームは、活性化試薬、リガンド、分析物のいずれであっても、センサー表面への成分の添加がリアルタイムで、事前にプログラムされたコマンドを通じて順番に記録される「オールインワン」セットアップを採用しています。Octet RED384では、このBioLayer Interferometry(BLI)ベースのプラットフォームのユニークな特徴は、即時の「ディップアンドリード」使用14のためのプレコート光ファイバーバイオセンサーの利用可能性であり、SPRベースのプラットフォームのセンサーチップにしばしば必要とされるリガンド表面調製および開始/コンディショニングステップの必要性を排除します。また、この装置の流体を使用しない設計により、メカニズムが簡素化され、粗サンプルを扱う際の目詰まりや汚染の懸念が回避されます。ProteOn XPR36 の斬新な 6 x 6 交差流体設計により、流路を水平方向と垂直方向の間で切り替えて 36 個のインタラクションスポットを作成することにより、「ワンショット」キネティクスアプローチを実装できます15。従来のシリアルフローBiacore T100プラットフォームのように、一度に1つのリガンドまたは分析物濃度の結合速度を評価する代わりに、このアプローチでは、1回の結合サイクルで最大36の異なる相互作用を同時にモニタリングすることができます。
違いにもかかわらず、これら4つのバイオセンサープラットフォームは、世界中の多くの研究所で広く使用されています。バイオセンサーの実地体験がほとんどない新規ユーザーにとって、装置設計の違いを考えると、どの装置を使用するかを決定するのは難しい作業になる可能性があります。彼らの研究目的に最も適した装置を決定するには、データ品質、性能の一貫性、スループット、操作の容易さ、材料消費などの要素をまとめて考慮する必要があります。いくつかのベンチマーク研究では、複数の研究所やバイオセンサーから得られた運動速度定数の変動性が調査されています5,16、最近発表された直接比較研究では、機器性能の観点からデータの信頼性に影響を与える系統的な要因にさらに対処しています17,18.このビデオで提供されているプロトコルは、実験のセットアップと手順に詳細に焦点を当てており、研究論文「高親和性抗体抗原結合速度の評価におけるバイオセンサープラットフォームの比較」17が付属しています。これらのプロトコルは、新しいバイオセンサーユーザーがこれらの機器を研究目的で実装するのを支援するだけでなく、現在のバイオセンサーユーザーに、高親和性抗体-抗原相互作用を評価するための実験デザインにおける技術的な課題と考慮事項に関する追加の洞察を提供することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 System</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>T100 システムが T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensor Chipにアップグレードされました&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIA評価&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td>バージョン4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100制御ソフトウェア</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td>T100制御ソフトウェアはT200</td></tr><tr><td>アミンカップリングキット</td>にアップグレードされました <td>GEヘルスケア</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>含まれるもの:750 mg 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、115 mg N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、10.5 mL 1.0 Mエタノールアミン-HCl pH 8.5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ バッファー 10回;</td><td>GEヘルスケア</td><td>BR100669</td><td>濃縮ストックソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>プラスチックバイアル、外径7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ラバーキャップ、タイプ3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックバイアルおよびキャップ、外径11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager ソフトウェア&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>バージョン 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM センサーチップ</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>アミンカップリングキット</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>EDAC (EDC)、スルホ NHS、エタノールアミン HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>グリシンバッファー (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0) 各 1 個、NaOH、SDS、HCl、リン酸、NaCl; 各溶液 50 mL が含まれています。</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA バッファー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1762730</td><td>ホスファート緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4、0.005% Tween 20、3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>オクテット RED384 システム</td><td>フォート&eacute;</td><td></td><td></td>バイオ</tr><tr><td>データ解析ソフトウェア</td><td>Fort&eacute;</td><td></td>バイオ<td>バージョン9.0.0.4</td></tr><tr><td>ディップアンドリード抗hIgGfcキャプチャ(AHC)バイオセンサーFort</td><td>&eacute;Bio</td><td>18-5060</td><td>96個のバイオセンサーの1つのトレイ&nbsp;</td></tr><tr><td>384ウェル傾斜底板&nbsp;</td><td>フォート&eacute;バイオ</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>バイオセンサーディスペンサー</td><td>フォート&eacute;Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>Fort&eacute;バイオ</td><td>18-1092</td><td>10倍濃度。ProClin 300が含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Continuous Flow Microspotter (CFM) プリンター</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G チップ</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint データ分析ソフトウェア</td><td>ワサッチマイクロフルイディクス</td><td></td><td>バージョン6.15.2.1</td></tr>スク<tr><td>ラバー2</td>バイオ<td>ロジックソフトウェア</td><td></td><td>バージョン2</td></tr>ピア<tr><td>ス組換えタンパク質A / G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

ラベルフリー光学バイオセンサは、生体分子の相互作用の特徴付けのため、創薬における強力なツールです。本研究では、人間のプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型（PCSK9）に対する10高親和性モノクローナル抗体（mAb）の結合親和性と動態を評価するために私たちの研究室で4つの日常的に使用バイオセンサープラットフォームの使用を記載しています。ビアコアT100とのProteon XPR36双方が十分に確立された表面プラズモン共鳴（SPR）技術から派生しているが、後者は即興6×6十字を介して並列に36個の反応スポットを呈するのに対し、前者は、直列流れ構成で接続された4つのフローセルを有しますマイクロ流体チャネル構成。 IBIS MX96は、空間方向で検出を提供する付加的な撮像機能と、SPRセンサ技術に基づいて動作します。連続流Microspotter（CFM）と結合され、この検出技術は、電子によって著しくスループットを拡張します同時に96反応スポーツの多重配列印刷および検出をnabling。対照的に、オクテットRED384は、光ファイバプローブは、先端面での結合相互作用に干渉パターンの変化を検出するバイオセンサーとして作用して、生物層干渉法（BLI）の光学原理に基づいています。 SPRベースのプラットフォームとは異なり、BLIシステムは、連続流動流体に依存していません。彼らは軌道攪拌中384ウェルマイクロプレートの検体溶液中に浸漬している間代わりに、センサチップは、測定値を収集します。 これらのバイオセンサープラットフォームは、それぞれ独自の長所と短所があります。 1分子間相互作用モデル：品質動態データを提供するために、これらの機器の能力の直接比較を提供するために、記載されているプロトコルは、単純な1に適合し、抗体 - 抗原動態を特徴づけるために、同じアッセイフォーマットを使用した実験と同じ高品質の試薬を示して。

図1は、2つの固定化方法によってCFMとスポットのmAbレベルから抗体配列画像を示し、 図2は、マルチサイクル運動からMX96で生成対応する結合センサーグラム及びこれらのmAbアレイ上の単一サイクル動態測定を示します。 6 - 4つのバイオセンサプラットフォームで生成された複数の抗体でコーティングされた表面からのリアルタイム結合および動力学的近似曲線は、 図3に示されています。 図7は、これらの結合曲線のグローバル分析から得られた最終的な反応速度および平衡結合定数の比較を示します。個々のアソシエーション（k）は 、解離（K d）は 、平衡（K D）の結合定数を表1に示します。同じ楽器内で生成されたデータセットの変動性を実証するために、 <st栄&gt;図8は、異なるmAbの表面密度でk個のA、K dおよびK Dのプロットを示し、 図9は、さらに、バイオセンサプラットフォーム間のmAb表面の計算結合活性を比較します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> IBIS MX96でCFM印刷から図1アミン結合（A）の多重リガンド配列およびFc捕捉（B）抗体表面。印刷されたアレイの画像は赤四角で囲まれた灰色領域は抗体の存在を示し、左のパネルに示されています。活性抗体スポットの間に位置する暗いinterspots基準減算のために使用されます。各列は、以下で特定滴定濃度で、画像の左側に印刷された抗体を含有します。ジを計算することによって定量印刷抗体の量アクティブと参照位置との間のバルクシフトのfferenceは右パネルに示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> IBIS MX96におけるマルチサイクル（A）とシングルサイクル（B）速度論的実験からのリアルタイム結合センサーグラムを図2の比較。 10×8抗体アレイを横切って濃度を増加でヒトPCSK9の連続注射は、それぞれ対応するセンサーグラムセグメント上述されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stビアコアT100 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：栄&gt;図3は、ヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合します。相互作用は、高（ 上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteonのXPR36 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図4のヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、MEDIにわたって評価されていますum-（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> オクテットRED384 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図5.ヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。重ね赤い線は1に異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。<html> 1つの相互作用モデル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図6.ヒトPCSK9と1との対話アミン結合（A）およびFc捕捉（B）抗体のセンサーグラムの結合。結合プロファイルは図1のアレイプレートマップに従って10×8パネルとして編成されます。黒線は、異なるヒトPCSK9濃度で記録された結合応答信号を表し、重ね赤線が近似曲線を表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> グレ7&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; アソシエーション・K（A）の図7の比較、解離の K d（B）、および4つのバイオセンサープラットフォームによって生成平衡K D（C）結合定数。 6 -速度論的パラメータは、 図3における結合曲線のグローバル分析に由来します。バイアコアT100（青）のProteon XPR36（緑）、オクテットRED384（赤）、IBIS MX96、アミン結合（紫）、およびIBIS MX96は、Fc捕捉（オレンジ）を次のように器具が示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> BIACの複数の抗体表面密度以上の反応速度定数の一貫性の図8の比較<html>鉱石T100（A）のProteon XPR36（B）、オクテットRED384（C）、IBIS MX96、アミン結合（D）、及び捕捉のFc IBIS MX96、（E）。速度論的パラメータ（ トップサブパネル）をK、 の K d（ 中間サブパネル）、及びK D（ 底サブパネル）は個々の抗体の面密度で基分析に由来します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> 図 四バイオセンサープラットフォームにおける抗体表面とその標準偏差（エラーバー）の 9 結合活性。値は、研究論文17で説明した式を用いて計算されます。large.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> kは </td><td> K D </td><td> K D </td></tr><tr><td> （M -1 S -1） </td><td> （S -1） </td><td> （NM） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体1 </td><td> 11.7（7.8）10 5 xは</td><td> 4.89（4.18）10 -5 xは</td><td> 0.052（0.05） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体2 </td><td> 1.53（0.28）10×5 </td><td> 1.30（1.54）10 -5 xは</td><td> 0.092（0.12） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体3 </td><td> 11.4（8.3）10 5 xは</td><td> 27.6（11.0）10 -5 xは</td><td> 0.333（0.20） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体4 </td><td> 3.61（1.6）10 5 xは</td><td> 20.1（12.3）10 -5 xは</td><td> 0.659（0.54） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体5 </td><td> 0.59（0.21）10×5 </td><td> 3.46（2.50）10 -5 xは</td><td> 0.663（0.46） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体6 </td><td> 1.19（0.78）10×5 </td><td> 7.21（3.83）10 -5 xは</td><td> 0.894（0.64） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体7 </td><td> 1.29（0.53）10×5 </td><td> 16.4（5.63）10 -5 xは</td><td> 1.57（1.02） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体8 </td><td> 4.02（2.23）10×5 </td><td> 22.8（10.7）10 -5 xは</td><td> 0.768（0.68） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体9 </td><td> 4.20（2.13）10×5 </td><td> 6.67（4.3）10 -5 xは</td><td> 0.197（0.16） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体10 </td><td> 1.20（0.49）×10 5 </td><td> 12.5（7.64）10 -5 xは</td><td> 1.27（0.80） </td></tr></tbody></table> 表1：1 相互作用モデル：反応速度と平衡は1〜フォーバイオセンサーインスツルメンツから結合曲線のグローバルフィッティングにより得られた10のmAbの結合定数。

私たちは4つの一般的に使用されるバイオセンサープラットフォームを使用して、抗体 - 抗原結合親和性および動態の測定のために、ここでのプロトコルを記述します。

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

このバイオセンサー研究の目的は、日常的に使用されている4つのバイオセンサープラットフォームにおいて、質の高いキネティックデータを提供する能力を比較し、高親和性の抗原抗体相互作用を評価するための実験計画における技術的な課題と検討事項に関する知見を提供することです。本研究は、治療用抗体候補を評価する際に最も信頼性の高い結果を得るためのバイオセンサープラットフォームおよびアッセイ形式の選択という、創薬分野における重要な疑問に答えるものです。本研究の主な利点は、データの整合性、品質、および運用効率の観点から、さまざまなバイオセンサープラットフォームの直接的かつ包括的な比較を提供することにあります。4つのプロトコルのビデオ実演は、実務経験が少ない新しいユーザーがこれらの装置での実験セットアップ方法を習得するのに役立つため、非常に重要です。Biacore T100でキネティック測定を行うには、[File]をクリックし、[Open New Method]を選択してメソッドファイルを開きます。メソッド内のパラメータを確認してください。「Cycle Types」で、フローパス2におけるキャプチャ1の接触時間を220秒に、フローパス3におけるキャプチャ2の接触時間を110秒に、フローパス4におけるキャプチャ3の接触時間を55秒に設定します。すべてのキャプチャサイクルの流量は10 microliters per minuteに設定します。「Sample 1」を選択し、「sample solution」を変数としてチェックします。次に、フローパス1、2、3、4における接触時間を600秒に、解離時間を2,700秒に設定します。流速は30 µL/minに設定します。続いて、Regeneration 1を選択し、溶液フィールドにglycine HCl pH 1.5を入力して、フローパス1、2、3、4における接触時間を20秒に設定します。「変数設定」にて、サイクル1～3には100 nanomolarから6.25 nanomolarまで、サイクル4～8には50 nanomolarから3.12 nanomolarまで、サイクル9～10には5 nanomolarから0.323 nanomolarまでの2倍段階希釈濃度を入力してください。「ラン設定」で、検出フローパス2-1、3-1、4-1を選択し、「次へ」をクリックします。「ラン前のプライミング」にチェックを入れ、再度「次へ」をクリックしてください。サンプルおよび試薬ラック1を選択し、試薬の配置を定義します。各サンプルバイアルに適切に試薬をピペットし、ラックを装置に挿入します。[Eject Rack]をクリックしてサンプル・トレイコンパートメントのドアを開き、サンプルラックを装置に挿入してください。次に、「Start」をクリックし、保存するための実験名を入力してランを開始します。ProteOn XPR36での速度論的測定では、「Protocols」を選択し、次に「Samples」を選択して固定化を開始します。ウェルH1-H6に活性化剤としてEDC/Sulfo-NHSを、G1-G6にリガンドとしてプロテインA/Gを、F1-F6に不活性化剤としてエタノールアミンを、E1-E6に再生液としてグリシンを、D1-D6にブランクとしてPBS-T-EDTAを、C1-C6にリガンドとしてモノクローナル抗体Xサンプルを、そしてウェルB1-B6に分析物としてヒトPCSK9を定義します。「Steps」を選択し、プロトコルエディターで「Immobilization」をダブルクリックします。ステップには、EDC/Sulfo-NHS、protein A/G、および1 molar ethanolamineの3回連続の水平注入が含まれます。各注入の流速は30 microliters per minute、接触時間は300 secondsに設定してください。次に、「Regenerate」をクリックします。グリシンを100 microliters per minuteで、水平方向および垂直方向の両方に18秒間のパルスで3回注入します。続いて、PBS-T-EDTAを25 microliters per minuteで、同様に両方向に60秒間のパルスで2回注入します。次に、Ligandをクリックし、流速25 microliters per minute、接触時間160 secondsで、モノクローナル抗体1およびモノクローナル抗体2を垂直方向に注入します。Analyteをクリックした後、ブランクバッファーで希釈した5つの濃度のヒトPCSK9を、6つの水平チャンネルに同時に注入します。結合時間は40 microliters per minuteで600 secondsとし、続いて2回、700 secondsの解離時間で実施します。次に、Regenerateをクリックし、水平方向と垂直方向の両方に、100 microliters per minuteの速度で18秒間のグリシンパルスを2回注入します。続いて、定義された試薬位置に従って、1枚の96ウェルプレートにサンプルと試薬を調製します。プレートを装置にセットし、Runタブをクリックしてプロトコルを選択し、Startをクリックします。ライブ実験データの記録における6針並行注入について実演します。Octet RED384での動力学測定については、データ収集ソフトウェアで [Experiment] をクリックし、次に [New Experiment Wizard]、[New Kinetics Experiment]、そして [Basic Kinetics] の順に選択して実験方法を設定します。その後、[Modify Plates] をクリックし、Plate 1 と Plate 2 の両方で 96 Wells を 384 Wells に変更します。テキストプロトコルに従い、プレート内のサンプルタイプとポジションを定義します。アッセイ定義（assay definition）に移動し、実験セットアップを定義します。実験セットアップは、ベースライン時間を30秒、再生時間を30秒、平衡化時間を18秒、ローディング時間を200秒、結合時間を500秒、解離時間を1,800秒として定義します。振盪速度を1,000 RPMに設定します。アッセイ工程リストにステップを追加するには、まずステップをクリックし、次にサンプルプレートまたは試薬プレートのいずれかにあるウェルをクリックします。まず、抗ヒトFcキャプチャーセンサーをプレコンディショニングするため、グリシンへの15秒間の浸漬と1XKBへの15秒間の浸漬を交互に3サイクル行う平衡再生成の手順を入力します。次に、モノクローナル抗体サンプルを抗ヒトFcキャプチャーセンサーに200秒間キャプチャーさせるためのローディング指示を入力します。続いて、結合ステップの前に、バイオレイヤー干渉法（BLI）信号を確立させるため、60秒間のベースライン指示を入力します。そして、異なる濃度のヒトPCSK9を含むウェルにセンサーを浸し、500秒間の結合期間を設ける結合ステップを入力します。解離ステップに入り、PCSK9結合センサーを1XKBの新しいウェルに浸し、1,800秒間の解離時間を設けます。最後に、再生ステップとして、モノクローナル抗体PCSK9結合センサーをグリシンのウェルに浸し、各結合サイクルの間に18秒間のパルスを2回行います。「Review Experiments」に移動し、各ステップを確認した後、緑色のオープンボタンをクリックしてサンプルコンパートメントを開きます。サンプルプレートを装置にセットします。「Run Experiments」に移動し、60秒のディレイ時間を入力して、待機中にサンプルプレートを振盪させます。プレート温度を25°Cに設定し、実験ラン名を入力して、「Go」を押します。ここでは、リアルタイムのデータ収集が表示されています。IBIS-MX96でマルチサイクル動力学測定を行うには、センサーチップを連続フローマイクロスポッターに装着します。CFM2.0ソフトウェアを開き、「Load Settings」をクリックして「96 Amine Couple」を選択します。その後、サンプルプレートと試薬プレートの2枚をCFMプリンターにセットします。抗体アレイを作成するには、Runボタンを押してプリンターを起動し、試薬プレートの上半分にあるEDC/Sulfo-NHSを48個のマイクロチャネルを用いてセンサーに送り、センサー表面上で5分間サイクルさせます。次に、ソースプレートの上半分にあるモノクローナル抗体サンプルをセンサーに送り、活性化された表面上で10分間サイクルさせます。その後、50 milliliterのコニカルチューブから固定化バッファーを抗体表面に5分間送ります。プリントしたセンサーチップを装置にセットします。制御ソフトウェアで [File]、[Open measurement]、[Existing measurement] の順にクリックし、メソッドファイルを選択します。プリントしたセンサーチップを装置内に導入します。一般メニューの「Full system script」にある「G-System Prime」を選択します。次に、「G-Quench」を選択し、1 M エタノールアミン 150 µL を注入してモノクローナル抗体表面を不活化させます。「Analysis Cycle」では、「IBIS Scripts」の下にある「A-AP Standard Run」を選択してください。ベースラインを1.0分、結合を10.0分に設定し、解離は8 µL/sの速度で90ステップに設定します。サイクル内で、5回のバッファー注入に続き、ヒトPCSK9を1つの濃度ずつ注入します。結合サイクルの合間に、グリシンを用いてモノクローナル抗体表面を再生します。4台の装置を用いてヒトPCSK9と相互作用させた抗体の、1対1キネティックモデルフィットを重ね書きした結合センサーグラムを示します。複数の密度における抗体の結合プロファイルは、装置間で同様の結果となりました。各抗体に関連する速度定数は装置によって異なりましたが、それらの順位はほぼ一定に保たれました。複数の抗体表面における速度論的定数（キネティックレート）の親和性の再現性と一貫性を調査しました。ここに示すように、Biacore T100およびProteOn XPR36を用いて得られたすべての速度定数において、強い線形性が観察されました。しかしながら、Octet RED384によって得られた速度定数は、一部の解離速度（off rate）に変動があったため、線形性が低くなりました。これは、マイクロプレート内での時間の経過に伴うサンプルの蒸発によって引き起こされた可能性があります。IBIS-MX96で得られた速度定数は、表面の不均一性の変動により、線形性が低くなっていました。ほとんどのシステムにおける抗体結合活性は一貫していましたが、IBIS-MX96のアミン結合法では、活性が約10倍低いことが観察されました。これは、抗体の不活性化、または抗原結合に適さない抗体の配向が形成されたためと考えられます。このビデオを視聴することで、4つのバイオセンサープラットフォームそれぞれにおける実験のセットアップ方法と、自身の研究目的に合わせて適切なバイオセンサー技術を選択する方法について、十分に理解できたはずです。我々の直接比較研究により、各バイオセンサープラットフォームにはそれぞれ独自の利点と欠点があることが示されています。装置固有の系統的な制限はあるものの、結合速度定数と解離速度定数の両方において、これらの装置間では直接的な順位が高度に相関していました。サンプル数や材料の量に制限がない場合、どの装置を用いても抗体を同等に差別化できるため、候補のランキング目的であれば、どの装置を使用しても差し支えありません。ただし、データの信頼性とサンプルスループットの間にはトレードオフが存在します。Biacore T100、次いでProteOn XPR36Rが、最高のデータ品質と一貫性を示しました。一方、Octet RED384およびIBIS-MX96は高い柔軟性とスループットを備えていますが、データの正確性と一貫性に妥協が見られます。感度が高く信頼性の高い検出が必要な研究には、Biacore T100またはProteOn XPR36が最適です。速度が極めて重要な因子であり、かつ大量のサンプルを扱う研究では、Octet Red384またはIBIS-MX96が推奨されます。連続フロー方式の装置は、解離速度が遅い相互作用を解析するための高品質なデータを提供します。BRI fluid ex-a-fray装置の主な制限は、マイクロプレート内での経時的なサンプル蒸発であり、これにより上方ドリフトが生じ、データの精度が損なわれる可能性があります。

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