四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

このバイオセンサー研究の目標は、日常的に使用されている4つのバイオセンサープラットフォームの能力を比較して、高品質の速度論データを提供し、高親和性抗体-抗原相互作用を評価するための実験デザインにおける技術的な課題と考慮事項に関する洞察を提供することです。この研究は、治療用抗体候補を評価する際に最も信頼性の高い結果が得られるバイオセンサープラットフォームとアッセイフォーマットの選択に関する創薬分野の重要な質問に答えます。この研究の主な利点は、データの一貫性、品質、および運用効率に関して、さまざまなバイオセンサープラットフォームを直接かつ包括的に比較できることです。

4つのプロトコルのビデオデモンストレーションは、実践的な経験がほとんどない新規ユーザーがこれらの機器で実験を設定する方法を学ぶのに役立つため、非常に重要です。Biacore T100で速度論測定を行うには、ファイル、新規メソッドを開くをクリックし、メソッドファイルを開きます。メソッドのパラメーターを確認します。

[サイクル タイプ] で、Capture 1 over Flow Path 2 の接触時間を 220 秒、Capture 2 over Flow Path 3 の接触時間を 110 秒、Capture 3 over Flow Path 4 の接触時間を 55 秒に設定します。流量は、すべてのキャプチャサイクルで毎分10マイクロリットルです。サンプル1を選択し、サンプル溶液を変数としてチェックします。

次に、接触時間を600秒に設定し、解離時間を流路1、2、3、4で700秒に設定します。流量は毎分30マイクロリットルに設定されています。次に、[Regeneration 1]を選択し、[溶液]フィールドに「glycine HCl pH 1.5」と入力し、流路1、2、3、4の接触時間を20秒に設定します。

[Variable Settings]で、サイクル 1-3 では 100 ナノモルから 6.25 ナノモル、サイクル 4-8 では 50 ナノモルから 3.12 ナノモル、サイクル 9-10 では 5 ナノモルから 0.323 ナノモルの 2 倍の滴定濃度を入力します。Setup Runで、検出流路2-1、3-1、4-1を選択し、Nextをクリックします。実行前にプライムを確認し、もう一度[次へ]をクリックします。

[Sample and Reagent Rack 1] を選択し、試薬の位置を定義します。それに応じて試薬を個々のサンプルバイアルにピペットで入れ、ラックを装置に挿入します。「イジェクトラック」をクリックしてサンプルトレイコンパートメントドアを開き、サンプルラックを装置に挿入します。

次に、[開始] をクリックし、保存する実験名を入力して実行を開始します。ProteOn XPR36 での速度論的測定を行うには、[Protocols] (プロトコル)、[Samples] の順に選択して固定化を開始します。EDC/Sulfo-NHSをウェルH1-H6の活性化剤として、プロテインA/GをG1-G6のリガンドとして、エタノールアミンをF1-F6の解活性化剤として、グリシンをE1-E6の再生剤として、PBS-T-EDTAをD1-D6のブランクとして、モノクローナル抗体XサンプルをC1-C6のリガンドとして、ヒトPCSK9をウェルB1-B6の分析物として定義します。

[Steps] を選択し、プロトコル エディターで [Immobilization] をダブルクリックします。ステップには、EDC/Sulfo-NHS、プロテイン A/G、および 1 モルのエタノールアミンの 3 回のその後の水平注入が含まれます。各注入は、毎分30マイクロリットルの流量と300秒の接触時間を持つ必要があります。

次に、[Regenerate] をクリックします。グリシンの18秒パルスを毎分100マイクロリットルで水平方向と垂直方向の両方に3回注入します。これに続いて、毎分25マイクロリットルのPBS-T-EDTAの60秒パルスを2回、両方向に

次に、Ligandをクリックし、モノクローナル抗体1、モノクローナル抗体2を、毎分25マイクロリットルの流量と160秒の接触時間を用いて垂直方向に注入する。[Analyte]をクリックした後、5 つの濃度のヒト PCSK9 をブランクバッファーに 6 つの水平チャネルで同時に注入します。毎分40マイクロリットルを600秒の関連付け時間で使用し、続いて2,700秒の解離時間を使用します。

次に、[Regenerate] をクリックし、18 秒のグリシン パルスを 2 回、毎分 100 マイクロリットルで水平方向と垂直方向の両方に注入します。次に、定義された試薬の位置に従って、サンプルと試薬を1つの96ウェルプレートに調製します。プレートを装置に移し、[Run]タブをクリックし、プロトコールを選択して[Start]をクリックします。

ライブ実験データの記録における6針の並行注入が実証されています。Octet RED384 での速度論測定では、最初に [Experiment] をクリックし、次に [New Experiment Wizard]、[New Kinetics Experiment]、[Data Acquisition Software] の順にクリックして実験方法を設定します。次に、[プレートの変更] をクリックし、[プレート 1] と [プレート 2] の両方で [96 ウェル] を [384 ウェル] に変更します。

テキストプロトコルで説明されているように、プレート内のサンプルタイプと位置を定義します。アッセイ定義に移動して、実験セットアップを定義します。実験装置は、30秒のベースライン時間、30秒の再生時間、18秒の平衡化時間、200秒の時間での負荷、500秒の関連付け時間、および1,800秒の解離時間として定義されます。

振れ速度は 1 、 000 RPM に設定されています。ステップをアッセイステップリストに追加するには、まずステップをクリックし、次にサンプルまたは試薬プレートのいずれかにあるウェルをクリックします。まず、グリシンの15秒のディップと1XKBの15秒ディップを交互に3サイクル繰り返すことで、反ヒトFc捕捉センサーをプレコンディショニングするための平衡再生指示を入力します。

次に、ローディング手順を入力して、モノクローナル抗体サンプルを抗ヒトFcキャプチャセンサーに200秒間捕捉します。次に、ベースラインの指示を入力して、アソシエーションステップの60秒間前にバイオレイヤー干渉法のシグナルを確立します。アソシエーションステップを入力して、さまざまな濃度のヒトPCSK9を含むウェルにセンサーを500秒間のアソシエーション期間浸します。

解離ステップに入り、PCSK9 結合センサーを 1XKB の新しいウェルに 1, 800 秒間の解離期間浸します。最後に、再生ステップでは、モノクローナル抗体PCSK9結合センサーをグリシンのウェルに浸し、各結合サイクルの間に2つの18秒パルスを挟みます。「Review Experiments」に進み、ステップをスライドして、緑色の「開く」ボタンをクリックしてサンプルコンパートメントを開きます。

サンプルプレートを装置に移します。Run Experimentsに移動し、60秒の遅延時間を入力して、待ちながらサンプルプレートを振とうします。プレートの温度を摂氏25度に設定し、実験実行名を入力してから、ここにデータ収集が表示される Go.Live を押します。

IBIS-MX96でのマルチサイクル動力学測定の場合は、センサーチップを連続フローマイクロスポッターに取り付けます。CFM2.0 ソフトウェアを開き、[Load Settings] をクリックし、[96 Amine Couple] をクリックします。2つのサンプルプレートと試薬プレートをCFMプリンターにセットします。

抗体アレイを作成するには、Run(実行)を押してプリンターを起動し、試薬プレートの上半分にあるEDC/Sulfo-NHSを48マイクロチャネルを使用してセンサーに送達し、センサー表面上で5分間サイクルします。ソースプレートの上半分にあるモノクローナル抗体サンプルをセンサーに送達し、活性化された表面を10分間サイクルします。次に、50ミリリットルのコニカルチューブから固定化バッファーを抗体表面上に5分間送達します。

印刷したセンサーチップを機器にドッキングします。制御ソフトウェアで、ファイル、測定を開く、既存の測定をクリックし、メソッドファイルを選択します。印刷したセンサーチップを機器に移します。

一般メニューで、[フルシステムスクリプト]の下の[G-System Prime]を選択します。次に、G-Quenchを選択し、1モルのエタノールアミンを150マイクロリットル注入することにより、モノクローナル抗体表面を不活性化します。「Analysis Cycle」で、「IBIS Scripts」の下の「A-AP Standard Run」を選択します。

ベースラインに 1.0 分、関連付けに 10.0 分、8 マイクロリットル/秒の速度で解離に 90 ステップを設定します。サイクル内で、5回のバッファー注入に続いて、一度に1つの濃度のヒトPCSK9を注入します。モノクローナル抗体表面をグリシンで再生します。

4つの装置でヒトPCSK9と相互作用する抗体について、1対1のキネティックモデルフィットオーバーレイで記録された結合センサーグラムが示されています。複数の密度での抗体の結合プロファイルは、装置間で類似しています。各抗体に関連する速度定数は装置間で異なりますが、ランク順はほとんど同じままでした。

複数の抗体表面における動態速度の親和性の再現性と一貫性を調査しました。ここに示すように、Biacore T100 および ProteOn XPR36 を使用して生成されたすべてのレート定数で強い直線性が観察されました。ただし、Octet RED384によって生成されたレート定数は、一部のオフレートの変動により、線形ではありませんでした。

これは、マイクロプレート内での経時的なサンプルの蒸発によって引き起こされた可能性があります。IBIS-MX96によって生成されたレート定数も、表面の不均一性の変動により線形性が低かった。ほとんどのシステムに関連する抗体結合活性は一貫していましたが、IBIS-MX96のアミン共役法では約10倍低い活性が観察されました。

これは、抗体の不活性化、または抗原結合に伝導性のない抗体配向の生成によるものと考えられます。このビデオを見れば、4つのバイオセンサープラットフォームのそれぞれで実験を設定する方法と、自分の研究目的に適したバイオセンサー技術を選択する方法について十分に理解できるはずです。当社の直接比較研究は、各バイオセンサープラットフォームに独自の長所と短所があることを示しています。

機器には特定の固有の系統的制限があるにもかかわらず、これらの機器間では、関連性と解離の両方の速度定数の直接的な順序に高い相関関係がありました。候補のランク付けの目的のために、サンプル数および材料の量が制限要因ではないと仮定して、これらの機器のいずれかを使用してもよい、なぜなら、それらは、輸入機器に関係なく、抗体を同等に区別することができるからである。データの信頼性とサンプルスループットの間にはトレードオフがあります。

Biacore T100 に続いて ProteOn XPR36R が、最高のデータ品質と一貫性を示しました。一方、Octet RED384 と IBIS-MX96 は、データの精度と一貫性を犠牲にしながら、高い柔軟性とスループットを示しています。高感度で信頼性の高い検出が必要な研究には、Biacore T100 または ProteOn XPR36 が最適です。

速度が重要な要素であり、多数のサンプルが関与する研究では、Octet Red384またはIBIS-MX96のいずれかが推奨されます。連続流動Xを搭載した装置は、解離速度が遅い相互作用を解決するための高品質なデータを提供します。BRI fluid ex-a-fray 装置の主な制限は、マイクロプレート内でサンプルが時間の経過とともに蒸発するため、上向きにドリフトし、データの精度が低下する可能性があることです。