げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

げっ歯類マラリア原虫、ヒトマラリア原虫、げっ歯類マラリアモデルのライフサイクルと生物学の顕著な類似点により、マラリア研究には必須となっています。これらの標準的な方法は、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析を行う方法に関するマラリア研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。手順を実証することは、私の研究室の大学院生ゴズデ・デヴェチとイルクヌール・イルマズです。

凍結保存された凍結寄生虫ストックを迅速に解凍し、すぐに26ゲージ針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、約200マイクロリットルの在庫を有する腹腔内に少なくとも2匹のドナーマウスを腹腔内に注入する。注射の24時間後、24または26ゲージ針を使用して、最初のマウスの尾部を刺し、顕微鏡スライド上の血滴を採取する。別のスライドの短い端を使用して、最初のスライドに素早く血液を塗りつぶします。

血液が完全に乾燥したら、100%メタノールで少なくとも1分間スライドを固定する。10〜15分間ギムサで固定サンプルを染色し、その後、単一または二重蒸留水洗浄を行います。スライドが乾燥したら、1グリッドあたりの感染赤血球の総数を数える光顕微鏡上で100X目的と油浸漬下のサンプルを見る。

感染の2~3日後、寄生虫症がsupine位置で0.1〜1%に達した麻酔マウスを固定し、皮膚切開の作成を容易にするために胸骨の基部付近の皮膚を持ち上げるために鉗子を使用する。切開部位で皮膚を引き離して腹腔の上部と横隔膜を露出させ、胸部の底部を切断しながら胸部の底部を保持するために鉗子を使用して胸腔に入ります。胸部をピンバックして心臓を露出させ、少なくとも20マイクロリットルのヘパリンを含む1ミリリットルの注射器を使用し、26ゲージ針を装備して心臓組織を穏やかに穿刺する。

約1ミリリットルの血液を採取し、血液をマイクロ遠心分離チューブに分配するために、プランジャーをゆっくりと引き込む。すべての血液が採取されたら、赤いヒートランプの下でレシピエントマウスを温め、適切な用量の寄生虫を受け取る1人あたり27ゲージ針を装備した1つのインスリン注射器をロードする。その後、最初のレシピエントを抑制剤に入れ、感染した赤血球の1回の完全用量を拡張した尾静脈に注入する。

蚊の餌付けのために、成人4〜7日齢の女性アノフェレス・ステナシまたはA.ガンビア蚊が8〜12時間飢えさせ、麻酔を受けた感染したマウスに少なくとも15分以上餌を与えることを許可する。蚊1匹当たりの黄卵胞子の数を決定するには、冷凍庫内の20〜30匹の蚊を10分以上安楽死させ、双眼解剖スコープと2つの26または27ゲージ針を使用して、適切な解剖液を含むガラススライド上の蚊の中腸を解剖する。中腸を解剖するには、まず1本の針で腹部の下部を所定の位置に保持し、胸郭を分離し、白い色のミッドガットが胸郭からぶら下がって露出するまで、腹部と胸郭の間の接合部で胸郭を慎重に軽く押します。

今度は、胸郭を上方に押し上げるために使用したのと同じ針を使用して食道端から中腸を切り取り、ミッドガットを分離して広げます。解剖したミドグを針を使って解剖媒体から上げ、200マイクロリットルのRPMIで満たされたチューブに移します。すべての中腸が解剖され、収穫されたら、700倍gで1分間遠心分離機に中腸を含むチューブを置きます。

その後、収穫した組織を害虫で2回粉砕します。希釈した組織溶液の12マイクロリットルをマシトメーターに移し、室温で5分間マカチメーターをインキュベートして内容物を落ち着かせる。次に、位相コントラストと40倍倍率の光顕微鏡上のオージスト胞子類の平均数を決定します。

蚊当たりの唾液腺スポロゾアイトの数を決定するために、適切な時点でのポスト給餌で、示されているように50〜100匹の雌の蚊を凍結し、解剖顕微鏡と26または27ゲージ針の側面を使用して唾液腺を単離する。唾液腺を解剖するには、まず、1本の針のベベ面側で上部腹部または胸郭を所定の位置に保持し、頭と胸部の接合部で頭を非常に軽く、非常に短く押し上げます。頭がガラス張りの唾液腺を引き裂くことなく胸郭から慎重に分離されるまで押します。

短いガラスパスツールピペットを使用して、解剖培地から解剖唾液腺を上げ、1.5ミリリットルのチューブに入れます。すべての唾液腺を解剖して収穫したら、700倍のgで1分間遠心分離機に腺を含むチューブを置きます。収穫した組織を害虫で2回粉砕する。

次に、唾液腺スポロゾイトの平均数を以前に行ったように決定する。強力で構成的なプロモーターの制御下でEGFPを発現するように設計されたトランスジェニックレポーターマラリア原虫は、血液段階で蛍光シグナルを発現するように設計され、ookinetes、アノフェレス・ステファシ・ミダッツの若い卵巣嚢胞、およびアノフェレス・ステファニ女性の唾液腺から分離されたスポロゾイトで。フローサイトメトリー寄生虫血症パーセンテージ値は、後者の定量法の妥当性を確認する実証したように、ギームサ染色薄血汚れをモニタリングして得られた推定寄生虫血症率に直接対応する。

さらに、異なる無性および性的段階の各々の割合の推定は、フローサイトメトリーでは評価できない赤血球の形態学的評価に依存する。感染の腹腔内経路と静脈内経路の比較は、感染の最初の4日間のIV感染群寄生虫症率と比較して、感染したIP感染群寄生虫血症率の統計的有意な減少を明らかにし、感染のIV経路がマラリア寄生虫血液段階のアッセイのためのより定量的に正確な経路であることを示している。注意すべきは、フェニルヒドラジン治療は、男性のホテ生成速度を増加させる食塩細胞の数を大幅に増加させ、その結果、受精率および後続のすべての蚊段階の数を増加させる。

げっ歯類マラリア血液段階寄生虫の現象性分析と蚊ベクターへの伝染のための標準化された方法の不足があります。これらの方法は、これらの病原体とそのライフサイクル段階を研究するための標準化された単純化されたプロトコルを提供するのに役立ちます。