クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

このクロマチン免疫沈降手順の全体的な目標は、転写因子SMAD2のCキットプロモーターのSMAD結合要素へのTGFベータ1誘導結合を評価することです。この方法は、サイトカイン誘導遺伝子転写などの細胞生物学の分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、転写因子やその他の転写調節タンパク質がin vivoでDNA結合部位に直接結合することを実証できる可能性があることです。

細胞を10cmの組織培養プレート上で70〜80%のコンフルエンスまで増殖させます。実験の目的に従って細胞を刺激します。組織培養液を取り出し、5ミリリットルの固定液を加えます。

次に、振とうプラットフォーム上で細胞を室温で10分間インキュベートします。固定液を取り出し、10ミリリットルの氷冷した1X PBSで細胞を2回洗浄します。X PBSを1つ取り出し、5ミリリットルのグリシンストップフィックス溶液を追加します。

細胞を室温で5分間インキュベートした後、振とう台でグリシンストップ固定溶液を除去し、10ミリリットルの氷冷1X PBSで細胞を2回洗浄します。PBSを取り除いた後、2ミリリットルの細胞掻き取り液を加え、細胞掻き器を使用して細胞を回収します。次に、採取した細胞を氷上の円錐形のチューブに移します。

サンプルをGの600倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのX細胞溶解バッファーに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷のDounceホモジナイザーに移し、B型乳棒を使用して細胞破壊のために10ストロークします。

次に、細胞懸濁液を微量遠心チューブに移し、サンプルを2、400倍G、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを350マイクロリットルの核消化緩衝液に再懸濁します。試料を37°Cで5分間インキュベートした後、ミクロコッカスヌクレアーゼを添加し、ボルテックスにより混合します。

サンプルを摂氏37度で5〜20分間インキュベートし、2分ごとにサンプルを反転して混合します。ある濃度での時間は、細胞株間にある場合、酵素のせん断が最適でない場合、最適化が必要になるかもしれません。市販のソニッケアーを使用した代替のせん断手順は、テキストプロトコルにあります。

ミクロコッカスヌクレアーゼとのインキュベーション後、7マイクロリットルの氷冷0.5モルEDTAを加えて反応を停止します。剪断したDNAでサンプルを16、200倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を含む剪断されたDNAを新しい微量遠心チューブに移します。

50マイクロリットルを別の微量遠心チューブに分注し、テキストプロトコルに記載されているDNAのせん断が成功したことを確認します。残りの容量はすぐに免疫沈降に使用するか、摂氏マイナス80度で保存します。10〜25マイクログラムのせん断架橋クロマチンと25マイクロリットルのクロマチン免疫沈降グレードのプロテインG磁気ビーズを組み合わせます。

次に、10マイクロリットルの免疫沈降希釈バッファーと1マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。4時間のインキュベーション後、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに1〜10マイクログラムの抗体を加えます。そして、蒸留水を最終容量の100マイクロリットルに加えます。

サンプルをエンドツーエンドのローテーターで摂氏4度で4〜12時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを磁気スタンドに置きます。磁気ビーズがチューブの側面に凝集したら、上清を慎重に取り除いて廃棄します。

ビーズを800マイクロリットルの洗浄バッファー1で3回洗浄します。洗浄するたびに、チューブを数回反転させてビーズを混合します。次に、チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に凝集したら、洗浄バッファーを慎重に取り外します。

次に、ビーズを800マイクロリットルの洗浄バッファー2で1回、同じ手順で洗浄します。洗浄後、ビーズを50マイクロリットルの溶出バッファーに再懸濁し、サンプルをエンドツーエンドローテーターで室温で15分間インキュベートします。次に、磁気スタンドを使用して上清を新しいチューブに移します。

5モル塩化ナトリウムの6マイクロリットルを逆転させ、続いて2マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えます。サンプルを混合した後、摂氏65度で2時間インキュベートします。この時点で、サンプルは、テキストプロトコルに記載されているようにタンパク質結合部位について直接分析するか、または摂氏マイナス20度で保存することができます。SMAD2のTGFベータ1誘導性SCFプロモーターへの結合を確認するために、クロマチン免疫沈降アッセイを行った。

TGFベータ1治療により、SMAD2はヒト肝臓がん株、HepG2およびHep3BのSCFプロモーターに結合しました。TGFベータ1刺激がない場合、SMAD結合は認められませんでした。ポジティブコントロールとして、TGFベータ1誘導性SMAD活性化のために、PAI-1のクロマチン免疫沈降を行った。

PAI-1プロモーターは、TGFベータおよびSMADの既知の標的です。SMAD2免疫沈降の特異性は、非特異的IgG抗体の使用によって確認されました。IgGによる免疫沈降後、SBEへのSMAD2結合は認められませんでした。

STAT3のTGFベータ1誘導性TGFベータリガンド遺伝子への結合を確認するために、TGFベータ1処理HepG2およびHep3B細胞を用いてクロマチン免疫沈降アッセイを行った。TGFベータ1処理により、STAT3はTGFベータ遺伝子の2番目の推定STAT3結合部位に結合したが、最初のものには結合しなかった。この例では、STB-2 への正の STAT3 結合が内部の正の制御として機能します。

他のクロマチン免疫沈降実験と同様に、IgGを用いた免疫沈降後、ST-2へのSTAT3の結合は見られませんでした。この手法を習得すると、適切に実施されれば、抗体にもよりますが、1日または2日で完了することができます。この手順を試みる際には、実験室の安全ガイドラインに従い、プロトコルのすべてのステップで高い精度を保つことが重要です。

この手順を実行する際には、MSDSの確認や、手袋、白衣、安全メガネなどの保護具の着用などの予防措置を講じる必要があります。このビデオを見れば、特定のDNA結合配列へのタンパク質結合の解析方法について十分に理解できるはずです。このプロトコールに従って、クロマチン免疫沈降によって示されるタンパク質DNA結合の機能的関連性を確認するために、プロモーターアッセイのような他の方法を実施することができます。