Name: クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法によるTGF-β1誘導型転写因子SMAD2とSTAT3のc-KITプロモーター結合解析。ヒト肝がん細胞株HepG2およびHep3Bを用いたin vivoタンパク質-DNA相互作用の検出法です。

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この研究はテキサス州ヒューストンのテキサス大学MDアンダーソンがんセンター（スタートアップファンド、BB）の支援を受けていました。

1.ソリューションの準備<ol><li> 実験ごとに以下の解決策を用意してください。 <ol><li> 固定溶液は37％ホルムアルデヒドを調製し、室温で保存します。 1.42％の最終濃度になるように1倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。 注意：ホルムアルデヒドは刺激性、腐食性、突然変異誘発性、催奇性、発癌性に分類されます。摂取しないでください。ガス/フューム/蒸気/スプレーを吸入してはならない。換気が不十分な場合は、適切な呼吸器を着用する。皮膚や眼との接触を避ける。酸化剤、還元剤、酸、アルカリ、水分などの不適合物を避けてください。 </li><li>グリシン停止 - 固定溶液については、1×PBS溶液中に0.125Mグリシンを調製し、室温で保存する。 </li><li>細胞掻爬溶液のために、dH 2 O中の1 × PBS溶液を調製し、氷上に保存する。使用直前に、プロテイナーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）t0.5mMの最終濃度。 注意：PMSFは腐食性および有毒性に分類されています。保護服を着用し、換気の良い場所で使用すること。 </li><li>細胞溶解バッファー（20 mM Tris-HCl; pH 8.0,85 mM KClおよび0.5％NP40）を使用する直前に、1Xプロテアーゼインヒビターカクテル（PIC;ジメチルスルホキシド（DMSO）中100Xストック溶液：104 mM 4- （AEBSF）、80μMアプロチニン、4mMベスタチン、1.4mM E-64,2mMロイペプチン、および1.5mMペプスタチンA）および0.5mM PMSFを添加した。 </li><li>核溶解緩衝液（50mM Tris-Cl; pH8.0,10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および1％SDS）を使用する直前に、1X PICおよび0.5mM PMSFを加える。 </li></ol></li></ol> 2.細胞固定およびせん断<ol><li> 10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80％のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。 </li><li>組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。 </li><li>固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1x PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。 </li><li>グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。 </li><li> 600 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。あるいは、液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80℃で保存します。 </li><li>ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。 </li><li>細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、2,400 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37℃で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼ（1U /μL）を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37℃で5〜20分間インキュベートする。 2分ごとにサンプルを反転させる。 注：時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。 </li><li> あるいは、市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。 注：超音波条件は最適化が必要です。 300μLのサンプル容量と25％のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。 <ol><li>ステップ2.10の後、上清を捨て、nを再懸濁する1.0mLの商業的剪断緩衝液中に溶解した。 </li><li> 300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。 </li><li>最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25％出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する： それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。 </li><li>以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。 </li></ol></li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために7μLの氷冷0.5M EDTAを加える。 </li><li>剪断したDNAで16,200 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。 50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断（セクション3）。免疫沈降（セクション4）のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。 </li></ol> 3.せん断効率の確認<ol><li>ステップ2.16のせん断された染色質の50μLアリコートに150μLのヌクレアーゼフリーdH 2 Oおよび10μLの5M NaClを加える。 </li><li>サンプルを65℃で4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。 </li><li> 2μLのRNase A（10μg/μL）を添加し、サンプルを37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>プロテイナーゼK（0.5μg/μL）10μLを添加し、サンプルを42℃で90分間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う12 。 <ol><li>ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。 200μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。 </li><li>室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。 </li><li> 0.1M容の3M酢酸ナトリウム（NH 4 OAc）（pH4.2）を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。 2.5容量の氷冷した100％エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。サンプルO / Nを-20℃でインキュベートするか、-80℃で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃、16,000 xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。 </li><li>ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。 1mLのRT、70％エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。 </li><li> 4℃、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。 </li><li>ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。ペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 </li></ol></li><li> 1％TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。 注：成功したクロマチン剪断は、200-1,500 bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程（ステップ2.12）のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。 </li><li>残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する（ステップ2.16）。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる（セクション4）。 </li></ol>免疫沈降<ol><li> 25μLのChIPグレードプロテインG磁気ビーズ、10μLの免疫沈降希釈緩衝液（ストック溶液：0.01％SDS、1.1％Triton X-100,16.7mM）と10-25μgの剪断架橋クロマチン（ステップ2.16）トリス-HCl; pH8.0,1.2mM EDTA、および167mM NaCl）、および1μLのPICを含む。 </li><li> 4時間のインキュベーションの後、1〜10μgの抗体（抗体濃縮物抗体の親和性に基づいて変化する;製造業者の推奨に従って最初に使用し、必要に応じて実験的に最適化する）を1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、dH 2 Oを最終容量100μLに加える。 注：上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。 </li><li>サンプルを4〜12時間4℃でエンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li></ol>溶出<ol><li>磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。 </li><li>洗浄緩衝液1（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA pH8,20mM Tris-HCl; pH8,150mM NaCl）800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li> 800μLの洗浄緩衝液2（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA; pH8,20mM Tris-HCl pH8および500mM NaCl）でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li>ビーズを50μLの溶出バッファー（1％SDSおよび100mM NaHCO 3 ）に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。 </li><li> 6μLの5M NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK（0.5μg/μL）を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65℃で2時間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、phenol /クロロホルム抽出12 （ステップ3.5）、続いてペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 注：サンプルはタンパク質結合部位（セクション5）について直接解析することも、-20℃で保存することもできます。 </li></ol> 6.結合部位分析<ol><li> PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。目的のタンパク質結合部位を架橋する150〜400 bpのアンプリコンを合成するためのプライマーを設計します （ 図1 ）。 </li><li>目的の抗体で免疫沈降したChIP由来のDNA、非特異的なIgG抗体で免疫沈降させたChIP由来のDNA、iii）入力DNA、およびiv）H 2 Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。汚染を排除するためのPCRの陰性対照。経路刺激の場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。 注：c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）でPCRを行う。 </li></ol>

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</ol>

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

この報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。 クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合を誘導する刺激を特徴づけ、タンパク質が結合するDNA配列を特徴付ける強力なツールである。後者の情報は、目的の特定のタンパク質によって調節される遺伝子の同定を助けることができ、ChIP-on-chip、ChIP-seq、またはクローニング戦略7,8,9の使用によって達成される。 ChIPとDNA-タンパク質結合を実証する他の方法との大きな利点の1つ例えばEMSAまたはDNase Iのフットプリントは、ChIP技術において、結合がインビボで捕捉され 、他のものではインビトロで行われるということである 。したがって、ChIPは、細胞の状況...

真核生物の核において、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。生理学的、病態生理学的および細胞生物学的状況において、細胞機能は、クロマチン配位遺伝子発現によって空間的および一時的に制御される。 DNA-タンパク質相互作用は、DNA複製、組換え、および修復、ならびにタンパク質発現などの細胞プロセスの調節において必須の役割を果たす。したがって、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子発現および細胞機能の評価において不可欠なツールである。 電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリンティング1,2など、インビトロでのDNA-タンパク質相互作用を評価するいくつかの技術が存在する。しかしながら、これらの技術は、クロマチンおよび細胞の状況におけるタンパク質-DNA相互作用を分析しない。チップI特定のDNA結合部位に結合したタンパク質を捕捉し、それによってクロマチンの状況におけるDNA-タンパク質相互作用の同定を容易にする技術である。この技術は、もともとGimourとLisによって、 Escherichia coliおよびDrosophila melanogaster 3,4 における特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼII結合の評価のために開発されました。これは、DNA-タンパク質複合体の固定化、その後のクロマチン抽出および約200塩基対（bp）断片へのDNAの切断によって行われる。続いて、目的のDNA結合タンパク質を免疫沈降によって単離する。 DNA-タンパク質架橋の逆転後、DNAを精製し、分析する。タンパク質結合部位の分析にはいくつかの方法を用いることができ、標的遺伝子5内のタンパク質結合部位の核酸配列に依存する5 。 DNA配列が既知である場合、標準的なPol既知の結合部位に隣接する特定のプライマー対を用いて、イメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用することができる。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）も使用できます6 。配列が未知である場合、ChIPはDNAマイクロアレイ（ChIP-on-chip）、DNA配列決定（ChIP-seq）、またはクローニング技術7,8,9と組み合わせることができる。 TGF-β経路は強力な腫瘍抑制機能を有し、細胞分化の鍵となる経路である。それはTGF-β1リガンドの同族受容体複合体への結合によって活性化され、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらす。共通のメディエーターであるSMAD4との会合後、SMAD複合体は核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内のSBEに結合し、細胞周期、アポトーシスおよび細胞の区別を制御する遺伝子を制御するに。 TGF-β刺激に対する転写応答は、細胞型および状況特異的である10 。最近、我々は、TGF-βとc-KIT経路11との間の正のフィードバックループを記載した。このモデルでは、TGF-β1活性化SMAD2はc-KITリガンドプロモーターに結合し、その発現および分泌を誘導する。続いて、c-KITリガンドは、c-KIT受容体を自己および準クリニック様式で活性化する。 c-KIT受容体活性化は、JAK1 / 2を介したSTAT3 Tyr705リン酸化をもたらす。 STAT3活性化および核移行後、STAT3はTGF-β1リガンド遺伝子に結合し、その発現を調節する。 ここでは、我々は、c-KIT受容体リガンドプロモーターへのSMAD2結合の同定、およびシグナルトランスデューサー（および）転写3（TGF-β1-遺伝子）。

<table><tbody><tr><td>HepG2細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&β;1</td><td>R&D Systems</td><td>101-B1</td><td>10 ng/mL の濃度で使用</td></tr><tr><td>抗 SMAD2 抗体</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>5339</td><td>使用量/IP: 3 & micro;g</td></tr><tr><td>抗STAT3抗体</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4904</td><td>使用量/IP: 3 & micro;g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Forward Primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'</td></tr><tr><td>PCRリバースプライマー:PAI-1</td><td></td><td></td><td>配列:5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'</td></tr><tr><td>PCRフォワードプライマー:SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRリバースプライマー:SCF</td><td></td><td></td><td>配列:5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'</td></tr><tr><td>PCRフォワードプライマー:TGF-&β;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>配列: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRリバースプライマー:TGF-&β;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>配列: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCCCC-3'&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRフォワードプライマー:TGF-&β;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>配列: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRリバースプライマー:TGF-&β;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>配列: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGGGTGTGTC-3'&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

クロマチン免疫沈降法を用いたc-kitリガンドプロモーターの解析

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA複製および修復、DNA組換えおよび遺伝子発現を含む複数の細胞プロセスは、タンパク質とDNAとの相互作用を必要とする。したがって、DNA-タンパク質相互作用は、細胞分化、細胞増殖、細胞周期制御、染色体安定性、エピジェネティックな遺伝子調節、および細胞形質転換などの複数の生理学的、病態生理学的および生物学的機能を調節する。真核細胞では、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリントなど、いくつかの技術的ツールを用いてDNA-タンパク質相互作用を分析することができる。しかし、これらの技術は、細胞内ではなく、インビトロでタンパク質-DNA相互作用を分析する。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、特定のDNA結合部位でタンパク質を捕捉し、それによってDNA-タンパク質相互作用の同定を可能にする技術であるそれらのクロマチンの文脈内にある。これは、DNA-タンパク質相互作用の固定化、続いて目的のタンパク質の免疫沈降によって行われる。続いて、タンパク質が結合したゲノム部位が特徴付けられる。ここで、我々はChIPを記載し、議論し、チロシンキナーゼのプロモーター領域内のSMAD結合要素（SBE）への転写因子SMAD2の形質転換成長因子-β（TGF-β）誘導結合の同定のための分析値を示す。プロテインキナーゼキット（c-KIT）受容体リガンド幹細胞因子（SCF）。

TGF-β1リガンドのその同族受容体複合体への結合は、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。 SMAD複合体は核に移行する。 TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間接的に、遺伝子転写を調節することができる。 c-KITリガンドSCFがSMAD2のそのプロモーターへの直接的なTGF-β1誘発結合によって転写的に調節されるかどうかを試験するために、本発明者らは、SCF遺伝子のSCFプロモーターを含む2.4kb、5&#39;-フランキング領域をSMAD2結合モチーフ、5&#39;-AGAC-3 &#39;（SBE） 13,14 。我々は、7つの推定SBEsアップSCF開始コドンのトリム（ 図1A ）。 SCFプロモーターへのSMAD2のTGF-β1誘発結合...

DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

このクロマチン免疫沈降法の全体的な目的は、TGF beta 1によって誘導される、転写因子SMAD2のC kitプロモーター内SMAD結合エレメントへの結合を評価することです。この手法は、サイトカイン誘導性の遺伝子転写など、細胞生物学分野における重要な疑問への回答を得るために活用できます。本手法の主な利点は、転写因子やその他の転写調節タンパク質が、生体内でDNA結合部位に直接結合していることを実証できる可能性がある点にあります。細胞を10 cm組織培養プレートで70%から80%のコンフルエンスまで増殖させます。実験目的に応じて細胞を刺激します。組織培養培地を除去し、5 mLの固定液を加えます。次に、シェーキングプラットフォーム上で室温で10分間、細胞をインキュベートします。固定液を除去し、氷冷した1X PBS 10 mLで細胞を2回洗浄します。1X PBSを除去し、グリシン停止固定液5 mLを加えます。シェイキングプラットフォーム上で室温で5分間細胞をインキュベートした後、グリシンストップ固定液を除去し、10 mLの氷冷した1 X PBSで細胞を2回洗浄します。PBSを除去した後、2 mLの細胞回収溶液を加え、セルスクレイパーを用いて細胞を回収します。その後、回収した細胞を氷上のコニカルチューブに移します。サンプルを600 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを1 mLの1×細胞溶解バッファーで再懸濁させ、氷上で30分間インキュベートします。ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁させた後、細胞懸濁液を氷冷したダウンス型ホモジナイザーに移し、タイプBのペッスルを用いて10回ストロークし、細胞を破砕します。次に、細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、4°Cで2,400 ×gにて10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを350 µLの核消化バッファーで再懸濁します。サンプルを37°Cで5分間インキュベートした後、マイクロコッカスヌクレアーゼを加え、ボルテックスで混合します。サンプルを37 °Cで5〜20分間インキュベートし、2分ごとに転倒混和します。細胞株によって濃度が異なる場合、酵素による剪断が不十分なときは、時間の最適化が必要になることがあります。市販のSonicareを用いた代替の剪断手順については、テキストプロトコルを参照してください。マイクロコッカスヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために、氷冷した0.5 molar EDTAを7 µL加えます。断片化されたDNAを含むサンプルを、4 °C、16,200 ×gで10分間遠心分離します。断片化DNAを含む上清を、新しいマイクロ遠心チューブに移します。テキストプロトコルに記載されているDNAのせん断が成功したことを確認するため、50 µLを別のマイクロセントリフュージチューブに分注します。残りの量を用いてすぐに免疫沈降を行うか、-80 °Cで保存してください。せん断済みの架橋クロマチン10～25 µgを、クロマチン免疫沈降グレードのProtein G磁性ビーズ25 µLと混合します。次に、免疫沈降希釈バッファーを10 µL、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを1 µL加えます。4時間インキュベートした後、1.5 mLマイクロ遠心チューブに1〜10 µgの抗体を加えます。そして、蒸留水を加えて最終容量を100 µLにします。サンプルをエンドツーエンドローテーターを用い、4 °Cで4〜12時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをマグネットスタンドに置きます。磁気ビーズがチューブの側面に凝集したら、上清を注意深く取り除いて廃棄します。800 µLの洗浄バッファー1でビーズを3回洗浄します。洗浄ごとに、チューブを数回反転させてビーズを混ぜ合わせます。その後、チューブをマグネットスタンドに設置し、磁気ビーズがチューブの側面に凝集したら、洗浄バッファーを慎重に取り除きます。次に、同様の手順で、洗浄バッファー2を800 µL用いてビーズを1回洗浄します。洗浄後、ビーズを50 µLの溶出バッファーに再懸濁し、エンドツーエンドローテーターを用いて室温で15分間インキュベートします。その後、マグネットスタンドを用いて上清を新しいチューブに移します。架橋を解除するために5 Mの塩化ナトリウムを6 µL加え、続いてプロテイナーゼKを2 µL加えます。サンプルを混合した後、65 °Cで2時間インキュベートします。この時点で、テキストプロトコルに記載されている通り、タンパク質結合部位を直接解析するか、または-20 °Cで保存することができます。TGF beta 1によって誘導されるSMAD2のSCFプロモーターへの結合を確認するために、クロマチン免疫沈降アッセイを実施しました。TGF beta 1処理により、ヒト肝がん細胞株であるHepG2およびHep3Bにおいて、SMAD2がSCFプロモーターに結合しました。TGF beta 1刺激がない状態では、SMADの結合は認められませんでした。TGF beta 1誘導性のSMAD活性化のポジティブコントロールとして、PAI-1のクロマチン免疫沈降を行いました。PAI-1プロモーターは、TGF betaおよびSMADの標的であることが知られています。SMAD2免疫沈降の特異性は、非特異的なIgG抗体を用いて確認しました。IgGによる免疫沈降後、SBEへのSMAD2の結合は認められませんでした。TGF $\beta$ 1誘導によるSTAT3のTGF $\beta$ リガンド遺伝子への結合を確認するため、TGF $\beta$ 1処理したHepG2細胞およびHep3B細胞を用いてクロマチン免疫沈降アッセイを実施した。TGF $\beta$ 1処理の結果、STAT3はTGF $\beta$ 遺伝子の2番目の推定STAT3結合部位には結合したが、1番目の部位には結合しなかった。本例では、STB-2へのSTAT3の陽性結合を内部陽性コントロールとして用いている。他のクロマチン免疫沈降実験と同様に、IgGを用いた免疫沈降後ではST-2へのSTAT3の結合は見られませんでした。この手法に習熟し、適切に実施すれば、使用する抗体に応じて1日または2日で完了させることができます。この手順を行う際は、研究室の安全ガイドラインに従い、プロトコルのすべてのステップにおいて極めて正確に操作することが重要です。本手順を実施する際は、MSDSの確認や、手袋、白衣、保護メガネなどの保護具の着用といった予防措置を講じてください。このビデオを視聴することで、特定のDNA結合配列へのタンパク質の結合を分析する方法について十分に理解できるはずです。本プロトコルに従い、クロマチン免疫沈降法によって示されたタンパク質とDNAの結合の機能的な関連性を確認するために、プロモーターアッセイなどの他の手法を実施することができます。

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP -...

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

このビデオでは、タンパク質-DNA相互作用を実証する古典的な手法であるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのプロトコールについて説明しています。この技術は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞の標的遺伝子を同定するために使用されます。...

クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。...

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

DNA 規制要素、エンハンサーなどは、物理的にゲノム長距離にまたがる長距離染色体相互作用を介して多くの場合、ターゲット遺伝子のプロモーターに連絡して遺伝子発現を制御します。プロモーターが PCHi ハをやあ-C...

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ)...

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

学ぶクロマチン免疫沈降法によるTGF-β1誘導型転写因子SMAD2とSTAT3のc-KITプロモーター結合解析。ヒト肝がん細胞株HepG2およびHep3Bを用いたin vivoタンパク質-DNA相互作用の検出法です。

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

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