環境内の交信が交配行動に及ぼす影響を調べる方法ショウジョウバエmelanogaster

この行動アッセイの全体的な目標は、求愛や交尾などの生殖行動に対する環境キューの影響を定量化することです。この方法は、行動生物学とユーロジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、生殖行動に関する遺伝的要因や環境要因の推論、およびそれらの行動を緩和するメカニズムなどです。

この手法により、再生に影響を与えるさまざまな環境キューを迅速かつ柔軟にテストできます。そして、それは非常に多くの反復で行われます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるJenke Gorterです。

実験は、1リットルの濃厚なフライメディウムを準備することから始めます。マグネティックスターバー付きの2リットルのガラスビーカーに1リットルの水道水を注ぎます。そして、ビーカーを磁気ホットプレートに置きます。

攪拌を止め、沸騰温度に達するまで300°Cまで火を回します。攪拌を500rpmに回し、沸騰したお湯に材料を加えます。酵母が勢いよく泡立つのを待ちます。

次に、ホットプレートの温度を摂氏120度に下げます。10分後、ホットプレートを摂氏30度に下げます。そして、混合物が摂氏48度に冷えるまで攪拌します。

温度計を食品に直接挿入して温度を監視します。2グラムのテゴセプトを10ミリリットルの96%エタノールに溶解します。混合物と5ミリリットルの1モルプロピオン酸をビーカーに混ぜ合わせます。

3分間かき混ぜます。ブンゼンバーナーで針を赤みを帯びるまで加熱します。そして、3.5cm×1.0cmのプラスチック製ペトリ皿の上側に直径0.3cmの穴を開けます。

臭気のある化合物を使用して食品培地を調製するときは、まず、実験皿の1/2について、目的の化合物30マイクロリットルを皿にピペットで入れます。比較のために、残りの1/2皿を空のままにしておきます。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、皿の底を覆う3ミリリットルの食品培地を注ぎます。

汚染を防ぐためにチーズクロスで覆い、培地を室温で1時間固化させます。次に、皿に蓋をして、蓋を2面にテープで閉じます。パラフィンフィルムの破片をゼロポイント2センチメートルの厚さのロールに丸めて、皿の穴を覆うための小さなパラフィンフィルムプラグを準備します。

そして、それらをゼロポイント5センチメートルのセグメントに切ります。セプタムに2つの小さな穴を開けて、とげのあるバルクヘッドフィッティングにぴったりとフィットさせます。ゼロポイント3 2センチメートルの厚さのシルコーンセプタムで4点5センチメートルのボトルキャップを開きます。

小さなPVCチューブを、ボトルから出る出口とボトルに入る入口の1つだけに取り付けます。次に、小さなチューブを使用して、各YPD培養ボトルの出口にガラス管を取り付けます。チューブにガラス繊維を充填します。

そして、使用前にオートクレーブしてください。取り付けたキャップとチューブをアルミホイルで包みます。そして、摂氏120度と1バールの圧力で25分間オートクレーブします。

滅菌済みの100マイクロリットルピペットチップをYPD寒天プレートの酵母コロニーの1つに浸し、オートクレーブ滅菌したYPD液体培地ボトルに滴下します。この酵母とオキュレーションされたYPD液体ミディアムボトル、および酵母を含まないYPDミディアムコントロールボトルをキャップし、オートクレーブキャップをアウトレット内に取り付けます。YPD培地が微生物で汚染されるのを防ぐために、小さなチューブをゼロポイント45マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターに取り付け、バルクヘッドチューブコネクタをプラスチックで押してフィルターに向かってください。

そして、フィルターを離れるプラスチック製のバルクヘッドコネクタのネジ。次に、チューブをYPD培養ボトルの入口に取り付けます。ボトルを別々の磁気プレートに置きます。

そして、実験開始前に溶液を室温で100rpmで24時間攪拌します。両方のボトルの入口を加圧空気に接続されたチューブに接続します。実験用酵母ボトルの出口は、実験室から酵母の臭いを排出するチューブに接続してください。

ガラス管の出口側にPVCチューブを取り付け、これを実験ボックスの下穴に向けて導きます。外径がゼロポイント5cm以上のTスプリッターと短いPVCチューブを使用して、両側の2つの出口のそれぞれに2つの血清ピペットを取り付けます。ピペットをカメラの下のスチールボックス内の白い紙のシートに平らにテープで留めます。

マウスピペットを使用して、実験用のメス1匹をZT6の小さなシャーレに入れます。そして、ハエが交配アリーナに1時間順応するのを待ちます。1時間後、ZT 7で、野生型のオスをペトリ皿に移します。

そして、「24 時間監視を開始」をクリックします。エアポンプ実験では、ピペット出口が嵌合アリーナの入口穴に接続されるように皿を置きます。カップルの交配行動を分析するには、画像表示ソフトウェアで、開いているすべての画像を選択します。

そして、それらを年代順にページングします。日付、テスト番号、料理番号、開始時間を同じ行内のスプレッドシートに書き留めます。各アリーナの開始時刻は、Webカメラカメラの下に配置された瞬間から

写真からタイムスタンプを記録します。各交尾の開始時間を同じ行のスプレッドシートにマークします。交配は、オスがメスにマウントし、カップルが少なくとも5フレーム連続して適度に静止し、同じ姿勢を保ったままである場合、インシデントとしてカウントします。

食品培地用に分離された酵母空気の分析は、食品培地に酵母が存在しない場合、交配するカップルは酵母臭に反応しないことを示しています。しかし、酵母が食品培地にも添加されると、酵母空気中での交配頻度が増加します。女性の受容性は、酢酸の存在により増加します。

しかし、ペプトンが培地中に存在する場合に限り、ハエがアミノ酸と酢酸を同時に感知して交配頻度を増やす必要があることを示しています。一度習得すれば、このテクニックは6時間でセットアップできます。また、行動分析は、適切に行えば5時間で実行できます。