Name: 環境内の交信が交配行動に及ぼす影響を調べる方法ショウジョウバエmelanogaster (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ環境化学信号がショウジョウバエの求愛・交配行動に与える影響を定量化する行動アッセイ法。酵母臭や酢酸などの化学物質が生殖行動を調節するメカニズムを解明し、遺伝と環境の相互作用を研究する柔軟な手法です。

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フライングストックのブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝します。 C. Gahr、JT Alkema、およびS. van Hasseltによる加圧空気アッセイの開発に関する初期の試み。ジャスパー・ボスマン、酵母の栽培に関するアドバイス。もともとショウジョウバエの交尾行動の経過観察モニタリングを開発してくれたRezza AzanchiとJoel Levine。 JA Gorterは、Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Programグラントの支援を受けました。この研究は、JC Billeterの科学研究（NWO）（参考文献：821.02.020）のオランダ組織によって一部支持された。

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著者らは、開示する競合する持分はない。

このプロトコルは、交配する夫婦が交配頻度を決定するために使用することが仮定されている環境的合図を連続的に制御しながら、24時間にわたり交配行動を試験するためのアッセイを記載する。培地に酵母も含まれている場合（ 図2B ）、加圧空気システムを介して送達された酵母空気に応答して交配頻度を増加させることが可能である。さらに、寒天、ペプトン、および酢酸臭だけを培地中に直接含有する簡略化した食品培地では、交配頻度における同様の応答が観察され得る（ 図3B ） ここで実証された実験では、夫婦が同じ環境条件にさらされているので、カップルの一般的な交際行動についてのみ結論を導くことができます。しかし、以前の研究から、交配頻度の変動の47％が女性によって決定され、男性の寄与は変動の11％しか占めないことがわかっている20 。したがって、観察される交配頻度の変化の大部分は、女性の性的受容性の結果である可能性が高い。増加した男性は、成人D.はメスが正常に交尾の試み<sup...

生殖行動は、通常、特に女性の場合、男性よりも大きな生殖細胞を産生し、発生する子孫を育てる条件を慎重に選択する必要があるため、エネルギーコストが高い。エネルギーコストのために、再生が栄養状態に関連していることは驚くべきことではない。これは、すべてではないにしても哺乳動物を含むほとんどの動物で、栄養失調により思春期が遅れ、性的欲求が食物制限によって悪影響を受ける可能性がある1に当てはまります。 遺伝的モデル生物Drosophila melanogasterの繁殖はまた、栄養状態の影響を受ける。男性の食品揮発性物質2の存在下でより高いレベルで裁判所、と女性は、酵母の存在、卵の生産と子孫の生存3、4、5のための主要な栄養素で、より性的に受容されています。この進化的に保存された食品への生殖的応答は、遺伝的に扱いやすく時間効率の良い生物において、環境的食物の利用可能性を性的複製と結びつけるメカニズムを研究する機会を提供する。実際、 D. melanogasterの研究は、インスリン経路が食物と交配行動との関係の重要な調節因子であることを示唆している6 。それはまた、それ自体を相手の行為が女性の食品嗜好、ならびに関連する化学感覚ニューロン7、8、9を変えることが示されています。 D. melanogasterの食餌の合図は生殖行動に影響することは明らかである。これらの影響は主に女性、特に既に交配している女性に影響するようである5 。しかしながら、環境条件のこれらの急性効果を試験するために、雌交配行動に古典的に用いられるアッセイは、交配エピソードの間に長い間中断があるため、あまり適切ではない。古典的なrematingアッセイでは、処女の女性は最初に男性と仲良くなり、すぐに隔離され、24〜48時間後に新しい男性が呈示されます。この古典的なアッセイは、女性の行動と雌応答12、13、14、15、16、17、18を変更男性精液の成分を同定するために成功裏に使用されてきました。したがって、ここで示された連続交配アッセイは、生殖行動に対する環境条件の急性効果を研究するために使用され得る古典的な交配アッセイに加えられるものである。 ここで説明されている交尾行動についての連続アッセイを用いて、以前に酵母に曝露されたハエのペアが、24時間の観察期間5、19、20を超えるeveral回、21、ハエが食品に曝されていない間は一度だけ5 Remateのであろう。この知見は、女性が（参照10、11に概説されている）最初の交配後、数日間Remateのないことを示すキイロショウジョウバエの文学の大部分の光の中で不可解なことができます。しかし、この相違は、新しい交配機会が提供される前に、1〜数日間、女性が単離されるアッセイ条件によって容易に説明することができる。ペアがこの1時間の観察期間に交配しなければ、女性は受容性ではないと特徴付けられる。さらに、野生の捕獲されたハエからのデータが、女性が貯蔵器官に4〜6匹の男性の精子を含むことを示すとすれば、高い交配頻度は驚くべきではない。したがって、女性は自然に数回22、23を Remateのことdicating。 ここでは、この連続交配アッセイを使用して、ハエがどのように集まり、環境条件に関する情報を組み合わせて交配頻度を調節するかを実証する。このアッセイにより、遺伝学的研究のために比較的多数の交配対を試験し、揮発性及び非揮発性の環境手がかりの影響を試験することができる。アッセイは典型的には24時間実行されるが、48時間まで延長することができ、明暗（LD）サイクルなどの循環環境試験を行うことができる。我々は、食品基質中の不揮発性酵母栄養素の利用可能性と相まって、加圧空気システム内の酵母培養からの揮発性手がかりの影響を試験することにより、このアッセイを実証する。 加圧空気システムは、揮発性の手がかりを、食物基質および試験対（その交配挙動がモニターされる）。酵母が交配に影響を及ぼす特異性をさらに決定するために、本発明者らは、酵母の主要な揮発性化合物、すなわち酢酸24を、食品基質中の酵母のアミ​​ノ酸含量と組み合わせて、ペプトン（アミノ動物性タンパク質の酵素消化に由来する酸）。これらの実験は、 D. melanogasterの交配行動に対する環境上の合図の効果がこのアッセイでどのように試験され得るかを示す。

<table><tbody><tr><td>Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製キッチンキャビネット</td><td>Horecaworld</td><td>7412.0105</td><td></td></tr><tr><td>白色LED</td><td>ラッキーライト</td><td>ll-583wc2c-001</td><td>冷白色、20mAmp、2V</td></tr><tr><td>赤色LED</td><td>ラッキーリグ</td>ト<td>ll-583vc2c-v1-4da</td><td>625nm、20mAmp、6V</td></tr><tr><td>抵抗</td>の間の波長 <td>ロイヤルオーム</td><td>CFR0W4J0561A50</td><td>560オーム、0.25 W、250 V、5 % 公差</td></tr><tr><td>スマートフォン露出計アプリ</td><td>Patrick Giudicelli</td><td></td><td>Light/Lux Meter FREE、バージョン 1.1.1</td></tr><tr><td>パワータイマー</td><td>Alecto</td><td>TS-121</td><td></td></tr><tr><td>金属ブラケット</td><td></td><td></td><td>鋭角 5 x 5 mm、&nbsp; 2 x 5450 および 1 x 1100 mm 長さ</td></tr><tr><td>曇りガラス板</td><td></td><td></td><td>1190 x 545 x 5 mm</td></tr><tr><td>濾紙シート</td><td>LEEフィルター</td><td>220</td><td>ホワイトフロスト</td></tr><tr><td>スモールファン</td><td>ナノクシア ディープサイレン</td>ス <td>4260285292828</td><td>80 mm 超静音PCファン、1200 RPM</td></tr><tr><td>ビッグファン</td><td>ナノクシア ディープサイレン</td>ス <td>4260285292910</td><td>120 mm 超静音PCファン、650-1500 RPM</td></tr><tr><td>ウェブカメラ</td><td>Logitech</td><td>950270</td><td>B910 HD ウェブカメラ OEM、角度:78度、解像度:500万ピクセル&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>カメラソフト</td><td>DeskShare</td><td></td><td>セキュリティモニター pro</td></tr><tr><td>名前</td><td>strong会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Fly rearing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly rearing bottles</td><td>Flystuff</td><td>32-130</td><td>6oz ショウジョウバエ株ボトル</td></tr><tr><td>フライパッド</td><td>フライスタッフ</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>野生型ハエ</td><td></td><td></td><td>カントン-S</td></tr><tr><td>フライ飼育バイアル</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>789008</td><td>ショウジョウバエ チューブ 狭い 25x95 mm</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>三洋</td><td>MIR-154</td><td></td></tr><tr><td>磁気ホットプレート</td><td>ハイドルフ</td><td>505-20000-00</td><td>MR ヘイスタンダード</td></tr><tr><td>寒天</td><td>培地イングリディエンツ B.V.</td><td>010001.26.0</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Gezond&wel</td><td>1019155</td><td>デキストロース/Druivensuiker</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Van Gilse</td><td></td> グラ<td>ニュー糖</td></tr><tr><td>コーンミール</td><td>フライスタッフ</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽</td><td>Gezond&wel</td><td>1017683</td><td></td></tr><tr><td>大豆粉</td><td>フライスタッフ</td><td>62-115</td><td></td></tr><tr><td>糖蜜</td><td>フライスタッフ</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>活性ドライイースト</td><td>レッドスター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テゴセプト</td><td>フライスタッフ</td><td>20-258</td><td>100%</td></tr><tr><td>ペプトン (バクト)</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>メルク</td><td>1000631000</td><td>氷河、100%</td></tr><tr><td>小さなペトリディッシュ</td><td>グライナーバイオワン</td><td>627102</td><td>35 x 10 mm、通気口付きパラ</td></tr><tr><td>フィンフィルム</td>、<td>ベミスNA</td><td></td><td>パラフィルム</td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>酵母および加圧空気のセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビッグペトリディッシュ</td><td>ゴセリン</td><td>BP140-01</td><td>140 x 20.6 mm</td></tr><tr><td>超純水</td><td>ミリポア株式会社</td><td></td><td>MiliQ</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>寒天(純粋)</td><td>BD</td><td>214530</td><td>バクト</td></tr><tr><td>グルコース(0(+)-グルコース一水和物)&nbsp;</td><td>メルク</td><td>18270000004</td><td></td></tr><tr><td>オープンキャップ</td><td>ショット</td><td>29 240 28&nbsp;</td><td>GL45</td></tr>の<tr><td>シリコーンセプタム</td><td>VWR</td><td>548-0662</td><td></td></tr>有<tr><td>刺鉄線隔壁継手Nalgene</td><td></td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>大きなPVCチューブ</td><td></td><td></td><td>の直径:外側1.2 cmと内側0.9 cm</td></tr><tr><td>小さなPVCチューブ</td><td></td><td></td><td>の直径:外側0.8 cmと内側0.5 cm</td></tr><tr><td>15 mlチューブ</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水族館ポンプセラ</td><td>精度</td><td></td><td>セラエア 110 プラス、AC 220-240 V、50/60 Hz、3 W、圧力 >100 mbar</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>スーパーフィッシュ</td><td>A8040400</td><td>Norit 活性炭</td></tr><tr><td>使い捨てフィルターユニット</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット</td><td>VWR</td><td>612-1600</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>ホットグルー</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィルターWhatman</td><td></td><td>FP 30/細孔径0.45 mm CA-S</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>strong分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>統計ソフトウェア</td><td>R</td><td></td><td>lme4 パッケージ</td></tr></tbody></table>

環境内の交信が交配行動に及ぼす影響を調べる方法<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

個人の性的欲求は、遺伝子型、経験および環境条件の影響を受ける。性的行動を調節するためにこれらの因子がどのように相互作用するかは、依然として十分に理解されていない。 ショウジョウバエのメラノガスターでは 、食物の利用可能性などの環境上の手がかりが、性行動を調節するメカニズムを調べるための扱いやすいシステムを提供する交配活動に影響を与えます。 D. melanogasterでは、化学感覚性の味覚システムと嗅覚系を介して、環境の合図がしばしば感知されます。ここでは、交尾行動に対する環境化学的合図の効果を試験する方法を提示する。アッセイは、食物培地と交配するカップルを含む小さな交配アリーナからなる。各カップルの交配頻度を24時間連続してモニターする。ここでは、加圧空気システムを介した外部供給源からの環境化合物の試験、および対合アリーナ内の環境成分の直接操作に対するこのアッセイの適用性を示します。あなたは非常に揮発性の化合物の効果を試験するのに特に有用である一方、交配アリーナ内の成分を直接操作することは、化合物の存在を確かめるために有益であり得る。このアッセイは、交配行動および産卵ならびに他の男性および女性の生殖行動に及ぼす遺伝的および環境的合図の影響に関する質問に答えるために適合させることができる。

この連続アッセイを使用して、交配行動および特異的な交配頻度を、実験的環境条件下で決定することができる。環境条件をコントロールするために、ステンレス製のキッチンキャビネットを、独自の光源と拡散機能を備えたテストエリアに変えました。これにより、光が豊富になり、対合アリーナの上部からグレアが最小限に抑えられました（ 図1A ） 。内側の試験領域はステンレス鋼とガラスで完全に覆われており、ヘキサンやエタノールなどの有機溶媒で洗浄することができます。さらに、キャビネットには、配管用のインレットとして機能する穴があり、加圧空気システムから揮発性の手がかりをもたらします（ 図1Aおよび1Bを参照）。酵母の臭いに合わせて調整された加圧空気システムは、液体酵母培養液を通した空気流で構成され、試験場に入る前に、4つのピペットスプリッター10のアウトレット（ 図1C ）。システム全体は気密性があり、酵母培養に入る前と後の両方にいくつかの粒子フィルターを取り付け...

我々はショウジョウバエDrosophila melanogasterの交尾行動に影響を与える環境および遺伝的合図を分析するためのアッセイを実証する。

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

この行動アッセイの全体的な目的は、求愛や交配などの生殖行動に対する環境キューの影響を定量化することです。この手法は、生殖行動に影響を与える遺伝的・環境的因子の推論や、それらの行動を調節するメカニズムなど、行動生物学および神経遺伝学の分野における重要な問いへの回答に役立ちます。この手法は、繁殖に影響を与える広範な環境キューを試験する際の迅速性と柔軟性を提供します。さらに、十分な数の反復試行を行うことが可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるJenke Gorterが行います。1リットルの濃厚ショウジョウバエ培地を調製して、実験を開始します。2リットルのガラスビーカーにマグネチックスターラーバーを入れ、水道水1リットりを注ぎます。そして、ビーカーをマグネティックホットプレートの上に置きます。撹拌を停止したまま、沸点に達するまで温度を300 °Cまで上げます。撹拌を500 rpmで開始し、沸騰した水に成分を加えます。酵母が激しく泡立つまで待ちます。次に、ホットプレートの温度を120°Cに下げます。10分後、ホットプレートの温度を30°Cに下げます。そして、混合物が48°Cまで冷却されるまで撹拌し続けます。温度計を食品に直接挿入し、温度を監視します。2 gのTegoseptを10 mLの96%エタノールに溶解させます。この混合液と5 mLの1 Mプロピオン酸をビーカーに加えます。3分間攪拌します。ブンゼンバーナーで針を赤くなるまで加熱します。そして、3.5 centimeter by 1.0 centimeterのプラスチック製ペトリ皿の上部に、直径0.3 centimetersの穴を開けます。臭気化合物を含む培地を調製する際は、まず実験用ディッシュの半数に、目的の化合物を30 µLピペットで分注します。比較のため、残りの半数のディッシュは空のままにしておきます。5 mLのセロロジカルピペットを用いて、ディッシュの底が覆われるように培地を3 mL注ぎ入れます。コンタミネーションを防ぐためチーズクロスで覆い、室温で1時間置いて培地を固化させます。次に、ディッシュに蓋をし、蓋の両側をテープで固定します。パラフィンフィルムを厚さ0.2 cmのロール状に丸め、ディッシュの穴を塞ぐための小さなパラフィンフィルムプラグを用意します。その後、それらを0.5 cmのセグメントに切断します。セプタムに2つの小さな穴を開け、バーブ付きバルクヘッド継手をぴったりとはめ込みます。0.32 cm厚のシリコンセプタムを備えた、開口部のある4.5 cmのボトルキャップを取り付けます。ボトルから出ている両方の出口と、ボトルに入る入口のうちの1つのみに、小さなPVCチューブを取り付けます。次に、小さなチューブを使用して、各YPD培養ボトルの出口にガラス管を取り付けます。管の中にガラスファイバーを充填します。使用前にオートクレーブで滅菌します。装着したキャップとチューブをアルミホイルで包み、120 °C、1 barの圧力で25分間オートクレーブ処理します。滅菌済みの100 µL ピペットチップをYPD寒天培地プレート上の酵母コロニーのいずれかに浸し、オートクレーブ済みのYPD液体培地ボトルの中に投入します。この酵母を接種したYPD液体培地ボトルと、酵母を含まないYPD培地コントロールボトルの両方を、出口に取り付けられたオートクレーブ済みキャップで密閉します。YPD培地への微生物混入を防ぐため、プラスチック製のプッシュオンバルクヘッドチューブコネクターを使用して、小型チューブを0.45 µmの滅菌シリンジフィルターに接続し、フィルター方向へ向けます。フィルターからの出口にプラスチック製バルクヘッドコネクタをネジで固定します。次に、チューブをYPD培養ボトルの入口に取り付けます。ボトルをそれぞれ別のマグネティックプレート上に配置します。実験開始前の24時間、室温で100 rpmで溶液を撹拌します。両方のボトルの入口を加圧空気につながるチューブに接続します。実験への影響を防ぐため、実験用酵母ボトルの出口は、酵母の臭いを実験室外に排出するためのチューブに接続してください。PVCチューブをガラス管の出口側に取り付け、これを実験ボックスの下部の穴へと導きます。外径0.5cm以上のT字型スプリッターと短いPVCチューブを用いて、両側の2つの出口それぞれにセロファンピペットを取り付けます。ピペットを、スチールボックス内のカメラの下にある白い紙の上に、平らにテープで固定します。マウスピペットを使用して、ZT 6に実験用のメス1匹を小型シャーレに移します。そして、交尾アリーナに1時間順応させます。1時間後、ZT 7に野生型のオスをシャーレに移します。そして、「Start Monitoring」をクリックして24時間監視します。エアポンプの実験では、ピペットの出口が交配アリーナの入口穴に接続されるようにディッシュを配置してください。ペアの交配行動を分析するには、画像閲覧ソフトウェアで「すべての画像を開く」を選択します。そして、それらを時系列順にページ送りします。日付、実験番号、ディッシュ番号、および開始時間を、スプレッドシートの同一行に記入してください。各アリーナの開始時間は、ウェブカメラの下に配置した瞬間としてください。写真からタイムスタンプを記録します。各交尾の開始時間を、スプレッドシートの同じ行に記入してください。雄が雌に乗り上げ、ペアがほぼ静止した状態で同じ姿勢を少なくとも5フレーム連続で維持した場合に、1回の交尾としてカウントします。食品培地から分離した酵母を含む空気の分析により、食品培地に酵母が存在しない場合、交配ペアは酵母の臭いに反応しないことが示されました。しかし、食品培地に酵母を加えると、酵母を含む空気中での交配頻度が増加します。また、酢酸が存在することで雌の受容性が高まります。しかし、これは培地にPeptoneが存在する場合にのみ起こり、ショウジョウバエが交尾頻度を高めるためには、アミノ酸と酢酸を同時に感知する必要があることを示しています。この手法を習得すれば、6時間で準備が完了します。また、適切に行えば、行動解析は5時間で実施可能です。

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JoVE Journal

Behavior

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