Name: Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶGolgi-Cox染色法による老齢マウス海馬の樹状突起複雑性評価。神経細胞構造の可視化と形態解析を可能にし、神経科学研究における樹状突起の定量的解析に有用な手法です。

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この研究は、NIH P20 GM109005（ARA）およびTranslational Neuroscience IDeAプログラム賞P30 GM110702のセンターのパイロット助成金によって支えられました。

実験は、UAMSの機関動物管理および使用委員会によって承認された倫理基準に従って行われた。 1.動物および5-Fu注射パラダイム<ol><li> 6ヵ月齢のオスのC57Bl6 / J野生型マウスを購入し、それらが1歳に達するまで一定の12時間の明/暗サイクル下にそれらを収容する。 </li><li> 5％Fuを0.9％滅菌生理食塩水で希釈する。マウス1匹あたり必要な用量として60 mg / kgを使用する。 </li><li> 5-Fuの腹腔内注射を行う（週に3回、3週間）。 <ol><li>毎日同じ時間に腹腔内注射を行う。例えば、0900-1200時間の間。 </li></ol></li><li>動物を安楽死させ、最終注射の30日後に脳を抽出する。 </li></ol> 2.安楽死処置および脳抽出<ol><li>齧歯類を拘束し、尾の基部をつかむ。一方、親指または第1の指をthげっ歯類の首の根元。齧歯類の首にすばやく圧力を加え、尾をつかんでいるもう一方の手が後ろに引っ張っている間、前に押します。 </li><li>一方の手でげっ歯類を、他方の手で大きな手術用はさみを持ちます。齧歯類の首を2枚の刃の間に置き、頭をすばやく断頭します。 </li><li>切断されたマウスの頭部を取って、細かいはさみを使って、目の上まで頭骨の上の毛皮を整える。次に、はさみの先端を各アイソケットに置き、わずかな力でハサミを閉じます。 </li><li>春のはさみを使用して、頭蓋骨を小脳の左右に切断します。 </li><li>小脳の周りの頭蓋骨の部分を直接持ち上げて持ち上げるために鉗子を使用してください。 </li><li>春のハサミを使用して、頭蓋骨の中心窩に沿って切断します。 </li><li>鉗子を使用して頭蓋骨の残りの部分を脳から持ち上げます。 </li><li>スパチュラとプローブを使用して、脳を目的の容器にすくい取ってください。ステンレスを使用してティエルブレードは、各脳を正中面に沿って切断します。右半球について以下のゴルジ - コックス法を実行する。 </li></ol> Golgi染色および組織の調製<ol><li>新しく採取した半分の脳を、10mLコニカルチューブ内の5mLの塩化水銀ベースの溶液（キットの溶液A）に浸します。塩化第二水銀溶液は感光性である。ホイルでチューブを覆う。サンプルを室温で暗所に保管してください。 注：キットには、材料表に記載されているソリューションAが提供されています。あぶない！溶液A（塩化水銀溶液とも呼ばれる）には、重クロム酸カリウム、塩化水銀、クロム酸カリウムなどの有毒な試薬が含まれています。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li><li> 1日後、溶液をゆっくりと一時的な容器（大型の計量ボートなど）に落として、バイオハザードの廃棄容器に処分する。脳（元の10 mLコニカルチューブに依然として）を5 mLの塩化水銀溶液を添加し、サンプルを暗室に室温でさらに13日間戻す。 </li><li> 90gの蒸留水または脱イオン水（dH 2 O）に30gの含浸後緩衝液を加える。 6ウェルプレートの各ウェルに、6.5mLの含浸後緩衝液（1頭あたり1ウェル）を充填する 注記：ポスト含浸緩衝液は、材料表に記載されているキットに含まれています。 <ol><li>塩化水銀溶液中で（合計で）14日後、組織をdH 2 Oですすぎ、その後、含浸緩衝液を入れた6ウェルプレートに移す。箔でプレートを覆い、暗所で室温で保管します。 </li></ol></li><li>浸漬1日後に含浸後緩衝液をピペットで取り出し、新鮮な含浸後含浸緩衝液で更新する;室温で暗所に1日間保存する。必要に応じて、4℃で1ヶ月まで保存してください。22 。 </li></ol> 4.セクショニング<ol><li>蓋の12ウェルプレートに左から右、上から下へ昇順に番号を付けます。 </li><li> 脳全体を切断する場合は、1つの脳につき2つまたは3つの12ウェルプレートを準備する。 <ol><li>各12ウェルプレートの蓋の上部に、切断された脳の識別番号をラベルする。 </li><li>各プレートの各ウェルに1×PBS 2mLをピペットで入れる。 </li></ol></li><li> ステージを設定し、ビブラトームをオンにします。組織を覆う十分な1x PBSが容器に入っていることを確認してください。 <ol><li>プラスチックパラフィンフィルムを2枚切り、2回折り重ねます。 1x PBSがカウンターに漏れるのを防ぐために、検体ホルダーノブの穴の上にそれらを置きます。 </li><li>試験片ホルダーのティッシュブロックにテープを貼り、シアノアクリレート粘着剤（材料表参照）を貼ります。 </li></ol></li><li> 6ウェルプレートから脳を取り出し、それをプラスチックまたはガラス皿に置きます。ステンレスを使用小脳の約半分を切断するためにスチールの両刃ブレード。 <ol><li>小脳を尾を切る。残っている小脳の部分が均一であることを確認してください。 </li></ol></li><li> 直ちに残りの小脳の平らな表面を接着剤の上に置きます。 注：組織の背部（大脳皮質）は、ブレードに対して左右に向いている必要があります。以前に嗅球が付着していた吻側は、上向きになるはずです。 <ol><li>接着剤が完全に乾燥していることを確認するために、少なくとも数分間待ちます。 </li></ol></li><li> 脳を所定の位置に保持している接着剤が乾燥している間に、1×PBSを検体浴に注ぎます。接着剤が乾燥した後、組織が入った標本ホルダーを標本浴に置きます。 <ol><li>組織サンプルが完全に覆われていない場合は、1倍のPBSを検体浴に注ぎます。 </li></ol></li><li>ビブラトームのブレードホルダーにブレードを取り付け、ゆっくりとl1×PBSに完全に浸すまで、ブレードを試料バスに入れます。それが組織の上部のわずかに下になるまでブレードを下げ続けます。 </li><li> ビブラトームの速度を7、振幅を6、切断角度を12°に設定します（ビブラトームモデルの材料表を参照）。振動を開始し、200μmの部分を切断する23 。 <ol><li>大きなペイントブラシを使用して、組織切片を検体浴から12ウェルプレートの指定されたウェルのそれぞれに移動させます。 </li></ol></li><li>所望の数の組織切片に達するまで、組織を切断し続ける。 </li></ol> 5.後染色<ol><li>以下の染色工程およびリンスのそれぞれについて、1ウェルにつき示された溶液2 mLを使用する。溶液をウェルに移すには電動ピペットフィラー（材料表を参照）を使用してください。溶液を適切な廃棄物に移すために移送ピペット（材料表を参照）を使用するコンテナ。 </li><li>切片を0.01M PBS-Tの1回30分洗浄で洗浄する（3.0mLの界面活性剤（材料の表参照）を0.01MのPBS1000mLに加える）。 </li><li> 使用直前にdH 2 Oで3：5の容量の水酸化アンモニウム溶液（注意）を希釈する。希釈した水酸化アンモニウム溶液中の切片を19〜21分間染色する。 <ol><li>光感受性水酸化アンモニウム溶液をホイルで保護する。 注：溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は約10％であり、それは「有害」と分類される。水酸化アンモニウム溶液は、皮膚に接触すると火傷を起こすことがあります。吸入すると呼吸器の刺激を引き起こすことがある。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li></ol></li><li>ポスト染色バッファー（500mLのdH 2 O中に90gの試薬Dを加える）中の切片を19〜21分間染色する。ポスト染色バッファーは感光性です。フォイル22で保護してください。 </li><li> 3つのセクションをすすいでください0.01M PBS-Tを5〜10分間洗浄した。 </li></ol> 6.取り付け、クリーニング、およびカバー<ol><li>大きなペイントブラシで1％ゼラチンコートスライドのセクションをマウントします。それらを室温で20〜30分間乾燥させ、その後Coplinジャーに一晩置いてください。 </li><li>コプリンジャーから手袋をしたスライドをスライドから取り出し、プラスチックラックに置きます（材料の表を参照）。 100％エタノールを含有する染色皿（材料表参照）にプラスチックラックを置きます。 5分間3回洗浄して脱水する。 </li><li>スライドを99％キシレンで5分間ずつ2回洗浄する。スライドをガラスラックに置き、金属ハンドル付きのキシレンを含むガラス染色皿にラックを下ろします（材料の表を参照）。 注：キシレンは吸入すると有害であり、皮膚に触れると刺激を引き起こすことがあります。それは液体および蒸気状態で非常に可燃性である。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li><li> キシルからスライドを除去する一度に1つずつ取り出し、組織を約0.25 mLのマウントメディアですばやくカバーします（材料表を参照）。次に、スライドカバーを取り、メディアの上に置きます。 <ol><li>スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を、ペイントブラシの端などの鈍いオブジェクトで端まで押します。 </li></ol></li><li>太陽光から離れた場所にスライドを置き、2〜3日間乾燥させる。 </li><li>顕微鏡を使用して画像を取得し、適切なソフトウェアで分析することに進みます。 </li></ol> 7.イメージスタックを取得する<ol><li>イメージングプログラムを開きます（ 材料表を参照）。スライドを顕微鏡のステージに置きます。プログラムの上部にあるメニューで、[取得]をクリックし、[ライブ画像]をクリックします。 </li><li>顕微鏡を10倍に設定します。好みのニューロンを特定してから、赤いXのように見えるカーソルをソーマの中心に持って行きます。左クリックして基準点を設定します。 </li><li>顕微鏡を40倍に設定します。プログラムの上部にあるメニューから「移動」をクリックし、「参照先に」をクリックします。 </li><li> 組織の上の細かい対物レンズを手動でスクロールして、わずかに焦点が外れるまで、画像スタックの作成を開始します。 <ol><li>プログラムの右下にある[画像の取得]という見出しの下にある[Set Top]をクリックします。 </li><li>組織の下をわずかにスクロールして、焦点がわずかに外れるようにしてから、「Image Acquisition」の下の「Set Bottom」をクリックします。次に、「画像スタックの取得」をクリックします。 </li></ol></li><li> イメージスタックを取得した後、表示されるウィンドウにイメージファイルの名前を入力します。 「MBF Asciiファイル」として保存します。 <ol><li>メッセージが表示されたら、ファイル形式を「MBF JPEG2000スタックファイル」として選択し、「保存」をクリックします。 </li></ol></li></ol> 8.ニューロンのトレース<ol><li>ツールバでrメニューの下にある「Contour Name」という名前のボックスをクリックします。ドロップダウンメニューから「Soma」を選択します。 </li><li>手動で体細胞を追跡します。トレースが完了したら、右クリックして[セルボディの終了]を選択します。 </li><li> 「AutoNeuron」を選択すると、「AutoNeuron Workflow」という別のタブが表示されます。 </li><li> [設定タイプ]で[新規]を選択します。パラメータを設定し、 &quot;次のステップ&quot;をクリックして &quot;Soma Detection&quot;小見出しを表示します。 <ol><li>パラメータを設定するには、「Brightfield」を選択します。次に、 &quot;Max Process Diameter&quot;で &quot;Start Measuring&quot;をクリックします。カーソルを使用して、デンドライトの底に移動し、手動で直径を設定します。 </li></ol></li><li>ユーザーに画像全体をトレースするよう要求するウィンドウで[はい]をクリックします。手動で体細胞を追跡します。 「次のステップ」をクリックして、「シードプレースメント」小見出しを表示させます。 </li><li> [Validate Seed]をクリックします。&quot;次のステップ&quot;をクリックして &quot;Neuron Reconstruction&quot;小見出しを表示させます。 </li><li> &quot;Neuron&quot;で、 &quot;Interactive&quot;をクリックします。樹状突起のプログラムからの指示に従い、プログラムでトレースされた強調表示された領域を完成させるために右クリックして、インタラクティブなトレースを実行します。すべての樹状突起をトレースした後、「次のステップ」をクリックします。 </li><li>新しいウィンドウが表示されたら、希望のタイトルで新しい構成を保存します。 [保存]をクリックします。 </li></ol> 9.分析<ol><li>分析プログラムを開きます（材料の表を参照）。 </li><li>トップメニューから「ファイル」をクリックし、「データファイルを開く」をクリックします。対象のファイルを選択します。 </li><li>分析小見出しの下で、「Sholl Analysis」を選択します。 </li><li> 「Sholl Analysis」ウィンドウで、開始半径を10μmに設定します。 [分析]の下にある[Dendrites]と[Branch Orders]のボックスをクリックします。 </li><li>右のcl新しく開いたウィンドウをクリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 [保存]をクリックします。 </li><li>分析の下で、「分枝構造分析」をクリックします。 「すべての可能な分析」を選択します。 </li><li>新しく開いたウィンドウを右クリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 </li></ol>

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

より現代的な技術と比較して、Golgi-Cox法は、スパイン形態を検査するための好ましい方法であるいくつかの利点を有する：1）本質的に任意の組織に染色を用いることができ、2）基本的な光学顕微鏡のセットアップは、 3）Golgi-Coxイメージングは​​、共焦点イメージングよりも速く、4）ゴルジ染色された切片は、蛍光標識されたサンプルより数ヶ月から数年長い間生存可能である。これらの利点があるとしても、Golgi-Cox法には依然として一定の限界がある。第1に、プロセス全体が非常に時間がかかり、数週間の染色が必要であり、続いて画像を分析する必要がある。このプロトコルで見られるように、セクションAが開始される前に、溶液Aでは14日、溶液Bでは1日かかる。さらに、セクショニング、ポスト染色、およびマウントの実行には、1脳あたり2〜3時間かかります。それぞれのスライドは、清掃してカバーする前に1日乾燥させる必要があります。その後、時間の量セクションをイメージし分析するのは個人によって異なります。第2に、背骨の分類の違いによるアナリストのデータ間に一貫性の問題がある可能性があります。このため、各実験の画像解析部分を1人で行うことをお勧めします。これ...

<html>デンドライトは、シナプス入力1を受け取り、処理するニューロンの中で最大の部分です。それらの樹状突起は複雑な幾何学的形状を有し、近位枝は遠位枝よりも大きな直径を有する。樹状突起が発達すると、それらは樹状突起形成と呼ばれる過程で他のニューロンといくつかのつながりを形成する。この分枝の程度とパターンは、樹状突起が適切に処理できるシナプス入力の量を決定する2 。 樹状突起形成は、活性依存性可塑性およびニューロン回路の適切な発達のために必要なプロセスである。伸長、収縮、分枝およびシナプス形成は、固有の遺伝的プログラムおよび外因性因子からの影響を含む複雑なプロセスである。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関与している樹状突起の複雑さの変化は、病態生理学的および行動的変化に関連する5.異常は、脆弱X症候群およびダウン症候群6を含むいくつかの疾患状態に関連する。 樹状突起突起は、中枢神経系内に興奮性の入力を受ける樹状突起の特殊な細胞内区画である。樹状突起の3つの形態学的クラスがあり、その大きさと形状に基づいてそれぞれのクラスの名前があります：1）キノコの背骨は複雑なシナプス後の密度を持ち、他の突起よりもグルタミン酸受容体が多い7 。 2）茎が欠けているぼんやりした棘。 3）細長い棘は、伸長した細い幹と球状頭部からなる8 。樹状突起棘の容積は、それらを規定するために部分的に使用され、薄い棘は一般的により小さい（0.01μm3 </sup&gt;）、マッシュルームスパイン（0.8μm3）と比較して9,10 。背骨は成熟とともに安定する。例えば、細い棘は数日後に収縮するか、キノコの棘に成長する。あるいは、マッシュルームの棘は比較的安定であり、長期間生存することができる。ニューロンの結合の強さは、棘の数および/またはその体積に基づいていると考えられる11,12,13 。 古典的なゴルジ染色方法およびそのより現代的なバリエーションはすべて、樹状突起の形態および密度を調べるために有用であった。ゴルジ染色の1つの独特な局面は、全ニューロンの約5％を無作為に染色することであり、個々のニューロンの追跡を可能にする14,15 。ゴルジ体の正確なメカニズム個々のニューロン染色は未知であるが、この方法の原理はクロム酸銀（Ag 2 CrO 4 ） 16,17の結晶化に基づく。ゴルジ法の主な3つのタイプがあります：急速ゴルジ、ゴルジ - コックス、ゴルジ - コプシュ18 。 3つの方法はすべてクロム塩の初期インキュベーション段階から数日から数ヶ月間に始まりますが、それらの間にはいくつかの重要な違いがあります。急速ゴルジ体は第一段階で四酸化オスミウムを使用し、ゴルジ - コプシュはパラホルムアルデヒドを含む。迅速ゴルジおよびゴルジ - コプシュの両方の染色の後に、約7日間、1〜2％硝酸銀溶液中でのインキュベーションを行う。 Golgi-Cox法は、硝酸銀の代わりに塩化第二水銀および重クロム酸カリウムを使用し、2〜4週間の含浸時間を有する。次いで、組織を切片化し、希釈したアンモニアその後、塩を除去するための写真定着液を使用した。 3つのタイプのうち、ゴルジ - コックス（Golgi-Cox）法は、部分的には干渉を伴わずに樹状突起を染色するのに最も良いと考えられているが、その理由は、結晶アーチファクトが組織の表面上に起こらないからである17,20,21 。 本方法は、市販のゴルジ染色キットを備えたプロトコルのわずかな変形であり、5-Fuの比較的低い用量が樹状の形態学的特徴および背骨密度にどのように影響するかを評価するために設計された。取得されたデータは、化学療法による治療がニューロン回路にどのように影響するかについてのさらなる洞察を提供することができる。

<table><tbody><tr><td>スーパーゴルジキット&nbsp;</td><td>ビオエンノライフサイエンス</td><td>30100</td><td>&nbsp;危険物が含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10倍粉末濃縮</td><td>物フィッシャー&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>Σ</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>パーマウント&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>スライドカバー&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mLトランスファーピペット&nbsp;</td><td>グローブ・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mLファルコンチューブ&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>352099</tr><tr><td>フォイル&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>200プルーフエタノール&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>キシレン&nbsp;</td><td>アクロス・オーガニックス&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>危険です。&nbsp;</td></tr><tr><td>パーマボンド 200</td><td>パーマボンド LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清学ピペット</td><td>シグマ</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ミッドシ</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ビブラートーム&nbsp;</td><td>世界の精密機器&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 雄マウス&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>複数のコンポーネント、詳細についてはウェブサイトをご覧ください。&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRcカメラ</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>染色皿、Green</td><td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>染色皿セット&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>電動ピペットフィラー&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>ニューロルーシーダ&nbsp;</td><td>mbfバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロルーシーダエクスプローラー&nbsp;</td><td>mbfバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プリズム&nbsp;</td><td>グラフパッド</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

golgi-cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

樹状突起棘は、興奮性シナプスを含むニューロンの樹状突起軸からの隆起である。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関係している。ゴルジ染色にはいくつかのアプローチがあり、これらのすべてが樹状突起の形態学的特徴を決定し、明確なバックグラウンドを生成するのに有用であった。現在のゴルジ - コックス法（市販のゴルジ染色キットで提供されるプロトコルのわずかな変形）は、化学療法薬5-フルオロウラシル（5-Fu）の比較的低用量が樹状形態にどのように影響するかを評価するために設計された、脊髄の数、および海馬内での血管収縮の複雑さが含まれる。 5-Fuは、樹状突起の複雑さを有意に調節し、領域特異的様式で海馬全体の背骨密度を減少させた。示されたデータは、ゴルジ体染色法ef海馬のCA1、CA3、および歯状回（Dentate gyrus、Dentate gyrus）における成熟ニューロンを強く染色した。このプロトコルは、各ステップの詳細を報告し、他の研究者が高品質の結果と最小のトラブルシューティングで脳全体の組織を確実に染色できるようにします。

市販のイメージングソフトウェアを使用して、ゴルジ染色された脳切片の樹状突起形成および海馬の複雑さに対する5-Fu処置の効果を定量し、追跡した。追跡後、Sholl分析および樹状複雑性指数（DCI）を用いて、樹状突起形成、背骨密度、および脊椎形態を分析した。ショール分析は、樹状突起の形態を決定するために使用できる定量的分析方法である25 。体細胞から出発して、互いに10μm離れた円は、樹状突起の上に重なっている。樹状突起の長さは、樹状突起が交差する円の数によって決定される。樹状突起の複雑さを確認する方法である分岐点解析は、分岐点の総数と順序に基づいています。 分岐点は、ブランチは2つのサブブランチに分割されます。分岐順序は、分岐が分割される回数に基づいて複雑さの尺度です。例えば、1次分岐点は元の樹状突起であり、2次分岐点は2つのサブ分岐に分かれる点である。分岐点と分岐順序の両方を調べることで、樹状突起の複雑さ...

ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

本手法の総合的な目的は、脳組織を適切にゴルジ染色し、樹状突起の形態と複雑性を検討および定量化することです。この方法は、神経科学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。ゴルジ染色は少数の細胞のみを染色するため、この技術を用いてニューロンの構造を追跡することが可能です。この手法の主な利点は、洗浄ステップ中の乾燥や剥離のリスクなく、脳切片を容易に染色できることです。手順のデモンストレーションは、Allen博士の研究室の大学院生であるFred Kiffer、Tyler Alexander、Julie Andersonが行います。まず、採取したばかりの未固定のげっ歯類半脳を、5 mLの水銀塩溶液に浸漬することから始めてください。塩化水銀溶液は光に敏感であるため、チューブをアルミホイルで覆ってください。サンプルは室温の暗所で保存します。翌日、溶液を一時的な容器にゆっくりとデカントし、その後、バイオハザード廃棄物容器に適切に廃棄してください。新鮮な塩化水銀溶液を5 mL加え、脳が完全に浸っていることを確認します。サンプルを室温の暗所に置き、さらに13日間保存します。14日後、30 gの粉末状ポストインプレグネーション緩衝液を90 mLの蒸留水または脱イオン水（DH2O）に加えて、ポストインプレグネーション緩衝液を調製します。6ウェルプレートの各ウェルに、脳1つにつき1ウェルとして、後浸漬バッファーを6.5 millilitersずつ満たします。次に、前述と同様に、脳組織から塩化水銀溶液を除去します。組織をDH2Oで洗浄し、後浸漬バッファーを入れた6ウェルプレートに組織を移します。プレートをアルミホイルで覆い、室温の暗所で保存します。翌日、ポストインプレグネーションバッファーを吸引して除去し、新しいバッファーと交換します。プレートを再び覆い、4 °Cの冷蔵庫で保存します。脳1つにつき12ウェルプレートを2〜3枚用意し、まずプレートの蓋に左から右、上から下へ昇順に番号を記入します。切片を作成した脳の識別番号を追記してください。各プレートの各ウェルに1X PBSを2 mLずつ分注し、その後、ステージをセットしてビブラトームの電源を入れます。次に、標本ホルダーの組織ブロックにテープを貼り、その上にシアノアクリレート系接着剤を少量塗布します。6ウェルプレートから脳を取り出し、プラスチックまたはガラス製のディッシュに置きます。ステンレス製の両刃カミソリを使用し、脳に残る小脳の部分が平坦になるように注意しながら、小脳を尾側で切除します。次に、残りの小脳の平坦な面を接着剤の上に置きます。接着剤が乾燥した後、組織を入れた試料ホルダーを試料バスに入れます。試料バスをビブラトームに設置し、組織サンプルをPBSで満たします。次に、ブレードをビブラトームのブレードホルダーに取り付け、ブレードが完全に浸かり、組織の上面よりわずかに低くなるまで、ゆっくりと試料槽に下げます。続いて、ビブラトームの速度を7に、振幅を6に、切断角度を12度に設定します。振動を開始し、200 micronの切片を作成します。大きな絵筆を使用して、組織切片を検体バスから12ウェルプレートの各指定ウェルに移動させます。目的の切片数に達するまで組織の切断を続けます。切断後、トランスファーピペットを用いて12ウェルプレートのウェルからPBSを吸引し、2 mLのPBS-Tを加えて、撹拌しながら30分間洗浄します。洗浄期間の終了が近づいたら、水酸化アンモニウム溶液3部をDH2O 5部で希釈します。次に、PBS-Tを除去した後、希釈した水酸化アンモニウム溶液を加えます。アルミホイルで遮光し、切片を19～21分間染色します。次に、水酸化アンモニウム溶液を安全に除去した後、後染色バッファーを加えます。アルミホイルで遮光し、さらに19～21分間染色します。最後に、切片をPBS-Tで5～10分間ずつ3回洗浄します。大きなペイントブラシを用いて、切片を1%ゼラチンコートスライドガラスに貼り付けます。室温で20〜30分間乾燥させた後、コプリンジャーに入れ、一晩放置します。スライドガラスをコプリンジャーから取り出し、ドラフトチャンバー内のプラスチックラックに置きます。100% ethanolを含む染色皿に5分間浸します。さらに5分間のエタノール洗浄を2回繰り返し、切片を脱水します。次に、スライドをガラスラックにセットし、金属製ハンドルを使用して、99% xyleneを含むガラス染色皿にラックを浸します。スライドをキシレンで2回、それぞれ5分間洗浄します。2回目の洗浄時間が経過したら、スライドを1枚ずつキシレンから取り出し、組織を約0.25 millilitersの封入剤で速やかに覆います。次に、カバーガラスを封入剤の上に載せます。絵筆の端などの鈍い物体を用いて、スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を端まで押し出します。スライドを直射日光の当たらない場所に置き、2〜3日間乾燥させます。乾燥後、顕微鏡を用いて画像取得を行い、適切なソフトウェアで解析します。この明視野画像は、イメージングおよびさらなる解析の基準を満たしたゴルジ染色されたニューロンを示しています。3つのスパインタイプすべてが容易に確認できます。染色は樹状突起の全長にわたって均一であり、樹状突起は他のニューロンから孤立しています。この図は、5-fluorouracil投与後の歯状回におけるGolgi染色されたニューロンにおいて、生理食塩水投与群と比較して第4次および第6次樹状突起の長さが減少したことを示しています。Golgi染色は、スパイン密度の有意な差を検出するために利用できます。生体マウスへの5-fluorouracil投与により、CA1領域の尖端方向錐体細胞樹状突起におけるスパイン密度が有意に減少しました。基底樹状突起において、スパインの全体的な密度に有意な変化は見られませんでした。CA1錐体細胞の尖端樹状突起に対するSholl解析の結果、5-fluorouracil処理により、細胞体から40〜160 µmの距離における樹状突起の分岐が有意に減少したことが明らかになりました。基底樹状突起においては、5-fluorouracil処理により、細胞体から30〜110 µmの距離における樹状突起の分岐が減少しました。この手法を習得し、ゴルジ染色の工程から封入、洗浄、カバーガラスの貼付までを適切に行えば、脳1つあたり3時間で完了させることができます。本手法の開発により、神経生物学分野の研究者がマウスモデルを用いて神経解剖学的な接続を探索する道が開かれました。この手順を実施する際は、ニューロンの過剰染色を防ぐため、切片を水酸化アンモニウム溶液に浸す時間を19〜21分にとどめることが重要です。このビデオを視聴することで、脳組織の適切な染色、切片作成、および洗浄方法について十分に理解できるはずです。塩化水銀ベースの溶液、水酸化アンモニウム溶液、およびキシレンを用いた作業は非常に危険であるため、十分な注意を払い、本手順を実施する際はラボグローブを着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

実体顕微鏡下で成体マウスから海馬歯状回の除去のための解剖手法は、このビデオに記録されたプロトコルで実証された。...

成体マウスから海馬歯状回の解剖

この記事では、ラットと脳の老化とアルツハイマー病などの加齢に伴う神経変性疾患、関連付けられているシナプスの変化の研究のためのトランスジェニックマウスから海馬切片を調製するための手順の概要を説明します。...

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

本論文では、ラットの子の触覚刺激および神経形態のその後ゴルジコックス染色のための手順を説明します。触覚刺激は、家庭用ダスターで子犬をなでることで周産期に投与され、肯定的な経験である。ゴルジCOX染色は全体のニューロンの可視化を可能にする信頼性のある手順です。...

ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

私たちは、マウスモデルの海馬における樹状突起形成の可視化と定量化のための2つの方法、すなわちリアルタイムイメージングと拡張被写界深度イメージングについて説明します。前者の手法では、高度な地形トレースや分岐範囲の定量化が可能になるのに対し、後者では樹状突起樹のスピーディーな可視化が可能です。...

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

我々は、単一の組織サンプル内に含まれる長い樹状ツリーとニューロンを可視化するために、厚い脳切片にゴルジコックス染色法を使用するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの二つの変異体はまた、クレシルバイオレットの対比、および長期保存のために未処理の脳の凍結を伴うが提示されています。...

ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。...

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。...

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。...

海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

学ぶGolgi-Cox染色法による老齢マウス海馬の樹状突起複雑性評価。神経細胞構造の可視化と形態解析を可能にし、神経科学研究における樹状突起の定量的解析に有用な手法です。

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

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