Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

この方法論の全体的な目標は、樹状突起の形態と複雑さを調査および定量化するために、脳組織を適切にゴルジ染色することです。この方法は、神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。ゴルジ染色は細胞のごく一部のみを染色するため、この手法はニューロンの構造を追跡するために使用できます。

この技術の主な利点は、脳の部分が乾燥したり、洗浄ステップ中に脱落したりするリスクなしに、簡単に染色できることです。この手順を実演するのは、アレン博士の研究室の大学院生であるフレッド・キファー、タイラー・アレクサンダー、ジュリー・アンダーソンです。収穫したばかりの固定されていないげっ歯類の半分の脳を5ミリリットルまたは塩化水銀ベースの溶液に浸すことから始めます。

塩化水銀溶液は光に弱いため、チューブをホイルで覆います。サンプルは室温で暗所に保管してください。翌日、溶液をゆっくりと仮設容器にデカントしてから、バイオハザード廃棄物容器に適切に廃棄します。

5ミリリットルの新鮮な塩化水銀溶液を加え、脳が浸されていることを確認します。サンプルを室温でさらに13日間暗所に戻します。14日後、30グラムの動力付き含浸後緩衝液を90ミリリットルの蒸留水または脱イオン水DH2Oに加えて、含浸後緩衝液を調製します。

6ウェルプレートの各ウェルに、6.5ミリリットルの含浸後バッファー(脳ごとに1ウェル)を充填します。次に、以前と同様に脳組織から塩化水銀溶液を取り除きます。DH2Oで組織をすすぎ、含浸後バッファーで組織を6ウェルプレートに移します。

プレートをホイルで覆い、暗所で室温で保管します。翌日、含浸後のバッファーを吸引して交換します。プレートを再び覆い、摂氏4度の冷蔵庫に保管します。

まず、蓋のプレートに左から右、上から下の昇順の番号をラベル付けして、脳ごとに2つまたは3つの12ウェルプレートを準備します。切片化された脳の識別番号を追加します。2ミリリットルの1X PBSを各プレートの各ウェルにピペットで入れ、ステージをセットアップしてビブラトームをオンにします。

次に、標本ホルダーの組織ブロックにテープを貼り、その上にシアノアクリレート接着剤を少し加えます。6ウェルプレートから脳を取り出し、プラスチックまたはガラスの皿に置きます。ステンレス鋼の両刃の刃を使用して小脳を尾側に切断し、脳に残っている小脳の部分が平らであることを確認します。

次に、残りの小脳の平らな面を接着剤の上に置きます。接着剤が乾いたら、組織と一緒に試料ホルダーを試料浴に入れます。試料浴をビブラトームに置き、組織サンプルをPBSで覆います。

次に、ブレードをビブラトームのブレードホルダーに取り付け、ブレードが完全に沈み、組織の上部よりわずかに下になるまで、ブレードをゆっくりと試料浴に下げます。次に、ビブラトーム速度を7、振幅を6、切断角度を12度に設定します。バイブレーションを開始し、200ミクロンの切片をカットします。

大型のペイントブラシを使用して、組織切片を試料浴から12ウェルプレートの指定された各ウェルに移動します。ティッシュ切片の所望の数に達するまで、ティッシュを切断し続けます。切片作成後、トランスファーピペットを使用して12ウェルプレートのウェルからPBSを吸引し、2ミリリットルのPBS-Tを加えて攪拌しながら30分間洗浄します。

洗浄期間の終わり近くで、3部の水酸化アンモニウム溶液を5部のDH2Oで希釈します。次に、PBS-Tを取り出した後、希釈した水酸化アンモニウム溶液を加えます。ホイルを使用して光から保護し、切片を19〜21分間染色します。

次に、水酸化アンモニウム溶液を安全に除去した後、染色後緩衝液を添加します。ホイルで保護し、さらに19〜21分間染色します。最後に、PBS-Tの切片を毎回5〜10分間3回すすぎます。

1%ゼラチンコーティングされたスライドにセクションを大きなペイントブラシで取り付けます。室温で20〜30分間乾燥させてから、Coplin Jarに入れて一晩放置します。スライドをCoplin Jarから取り外し、ドラフトのプラスチックラックに入れます。

100%エタノールを含む染色皿に5分間置く。切片をさらに2回5分間のエタノール洗浄で脱水します。次に、スライドをガラスラックに置き、金属製のハンドルを使用してラックを99%キシレンを含むガラス染色皿に下げます。

スライドをキシレンを2回交換して、それぞれ5分間洗浄します。2回目の洗浄時間が経過したら、スライドをキシレンから1枚ずつ取り出し、約0.25ミリリットルの封入剤で素早く覆います。次に、スライドカバーを取り、メディアの上に置きます。

スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を、ペイントブラシの端などの鈍い物体で端に押し込みます。スライドを直射日光の当たらない場所に置き、2〜3日間乾燥させます。乾燥後、顕微鏡による画像取得と適切なソフトウェアによる解析に進みます。

この明視野画像は、イメージングとさらなる解析の基準を満たすゴルジ染色されたニューロンを示しています。背骨は3種類とも見やすいです。染色は樹状突起の全長にわたって一貫しており、樹状突起は他のニューロンから単離されます。

この図は、歯状回内のゴルジ体染色ニューロンが、生理食塩水治療群と比較して、5-フルオロウラシル治療後の4次および6次で長さが減少したことを示しています。ゴルジ染色は、脊椎密度の有意な差を検出するために使用できます。CA1頂端錐体樹状突起において、生きたマウスに5−フルオロウラシルを投与すると、スパイン密度が有意に減少した。

基底樹状突起では、棘の全体的な密度に大きな変化はありませんでした。CA1頂端錐体樹状突起のショール分析により、5-フルオロウラシル処理は、体細胞から40〜160ミクロンの距離で樹状突起の剥離を有意に減少させることが明らかになりました。基底樹状突起では、5-フルオロウラシル処理により、体細胞から30〜110ミクロン離れた樹状突起の剥離が減少しました。

一度習得すると、ゴルジ染色プロセスとマウント、クリーニング、カバーリングの両方を考慮したこの技術は、適切に実行すれば、脳あたり3時間で行うことができます。その開発後、この技術は、神経生物学の分野の研究者がマウスモデルで神経解剖学的接続を探求する道を開きました。この手順を試みるときは、ニューロンを過剰に染色しないように、切片を水酸化アンモニウム溶液に19〜21分間だけ保持することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、脳組織を適切に染色、切片化、すすぐ方法をよく理解しているはずです。塩化水銀ベースの溶液、水酸化アンモニウム溶液、キシレンの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでくださいので、この手順を実行するときは予防策を講じ、実験用手袋を着用し、ドラフトで作業してください。