ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

この手順の全体的な目標は、新しい神経突起を開始し、それらを迅速に拡張し、それらを標的細胞に正確に接続することです。この手順は、制御された再現性のある環境で増殖した細胞を使用することによってのみ可能です。この方法により、神経科学の重要な質問に答えることができます。

ニューロンの成長速度を制限するものは何ですか?彼らはどのくらいの速さで成長できますか?機械的な手がかりは役割を果たしていますか?

また、シナプスがどのように形成されるか、ニューロンがどのようにして標的細胞を見つけるのかを研究することもできますか?シナプスはどのように老化し、成熟しますか?そして第三に、ニューラルネットワークを体系的に構築し、ニューロンがどのように計算するかを研究することができます。

この手法の主な利点は、操作の容易さ、実験の再現性、そして最終的にはシングルセルレベルでの高度な制御を可能にすることです。この手順を開始するには、必要な数の滅菌カバースリップを洗浄して準備します。次に、各カバースリップに100マイクログラム/ミリリットルのPDLを0.5〜1ミリリットルで室温で少なくとも2時間コーティングします。

その後、カバースリップを水で2回洗い、液体をすべて取り除きます。無菌環境で5〜10分間、または表面が完全に乾くまで乾燥させます。次に、パターンを上に向けてバイオセーフティキャビネットに10分間置

10分後、パターンを下に向けてマイクロ流体デバイスをクリーンカバースリップに接触させて置きます。ピンセットを使用してデバイスをそっと押し、ガラスに密着させます。シングルポピュレーションデバイスを培地で満たすには、50マイクロリットルの完全細胞培地を右上のウェルに加えます。

そして、さらに50マイクロリットルの完全細胞培地をウェルの対角線上に加えます。マルチプルポピュレーションデバイスを培地で満たすには、30 マイクロリットルの完全な NBM を 1 列のウェルに加えます。培地がウェル間を流れていることを確認します。

次に、残りの各ウェルに50マイクロリットルの培地を追加します。オートクレーブ水のオープンディッシュを備えた大きなプレートにデバイスを置き、細胞培養を準備しながら、ディッシュをインキュベーターに1〜2時間置きます。次に、ウェルを空にせずに、マイクロ流体デバイスの上部ウェルから培地を取り出します。

次に、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液をマイクロ流体デバイスの右上のウェルに加え、顕微鏡で細胞が単一集団マイクロ流体デバイス内をどのように流れるかを確認します。マルチプルポピュレーションデバイスで細胞をプレートするには、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液を各トップウェルに加えます。顕微鏡で、細胞がチャンバー内にあるかどうかを確認します。

その後、デバイスをインキュベーターに15〜30分間置き、基質への細胞付着を促進します。細胞が基質に付着した後、40マイクロリットルのNBMをシングルポピュレーションデバイスの2つの上部ウェルに加えます。これにより、マイクロチャネルから気泡を取り除くことができます。

細胞が注入されたのと同じウェルであるマルチプルポピュレーションデバイスのトップウェルに20マイクロリットルのMBMを追加します。メディアはわずかに突き出して正の半月板を形成し、ウェルにマフィントップの側面を与える必要があります。マイクロ流体デバイスを取り外す1〜2日前に、各サンプルディッシュに2ミリリットルの予熱NBMを追加し、チャンバーを浸水させます。

その後、デバイスをインキュベーターに保管します。その後、滅菌ピンセットとピペットチップを使用して、マイクロ流体デバイスをカバースリップから取り外し、ニューロンのパターン化された構成を残します。この手順では、調製したPDLを40〜60マイクロリットルのPDL被覆ビーズを細胞培養する。

次に、サンプルをインキュベーターに1時間戻し、シナプス接触の形成を促進します。その後、2つのマイクロピペットで細胞を上から評価し、光学的にもアクセスできるように、サンプルを実験装置に設置します。この構成では、CCDカメラが画像キャプチャのために顕微鏡のサイドポートに配置されています。

生理食塩水で満たされた各ピペットを1ミリリットルのシリンジに接続し、サンプルを生理食塩水で灌流します。次に、顕微鏡下で、2つの孤立したニューロン集団間のギャップをチェックして、2つの集団が自然に接続されていないことを確認します。視野内のニューロンに付着していないPDLビーズを選択します。

ビーズに焦点を合わせ、次にマイクロピペットに焦点を合わせて、ビーズをマイクロピペットの先端に合わせます。その後、顕微鏡で観察することにより、先端をビードにできるだけ近づけます。次に、ピペットに負圧を加えてビーズをピックアップし、実験全体を通して負圧を維持します。

次に、視野内のニューロンに付着したPDLビーズを選択し、吸引を使用して2番目のマイクロピペットに取り付けます。マイクロマニピュレータまたはサンプルステージを毎分0.5マイクロメートルで1マイクロメートルでゆっくりと動かしてPDLビーズニューロン複合体を引っ張り、神経突起の開始を可能にするために5分間一時停止します。PDLビーズニューロン複合体を毎分0.5マイクロメートルで2マイクロメートル以上ゆっくりと横方向に動かして引っ張り、その後5分間一時停止して神経突起伸長を待ちます。

開始が成功し、最初の5マイクロメートルの神経突起が伸びた後、毎分20マイクロメートルで神経突起を連続的に引っ張ります。ニューロンを接続するには、神経突起が豊富な領域を選択します。他のビーズを使用して、カバースリップの上のピペットチップの高さを測定し、PDLビーズ神経突起複合体を下げて、神経突起に物理的に接触するようにします。

PDLビーズ神経突起複合体を標的神経突起に接触させたまま、2番目のマイクロピペットを操作します。次に、新しく形成された神経突起の上に2番目のPDLビーズが付いた2番目のピペットを最初のビーズから約20マイクロメートル下に下げ、2番目のPDLビーズを使用して新しい神経突起フィラメントを標的細胞に向かって押します。次に、両方のビーズを少なくとも1時間所定の位置に保持します。

顕微鏡で、ビードに接触する神経突起の肥厚である焦点腫脹がないことを確認します。この間に、サンプルの培地を生理食塩水から事前に温めた二酸化炭素平衡NBMにゆっくりと変更します。吸引を離して、2番目のピペットからビーズを解放します。

新しい神経突起が付着したままの場合は、最初のビードも放します。その後、サンプルをインキュベーターに慎重に戻し、将来の実験のためにニューロンの接続を強化します。全細胞パッチクランプ記録を使用して、マイクロマニピュレートされた接続の電気的機能を調査できます。

ここに示されているのは、PDMSマイクロデバイスの100マイクロメートルのギャップで区切られた孤立したニューロン集団です。ペアからパッチクランプへの記録を全細胞構成で行い、機械的に誘導された結合を分析し、自然に接続されたニューロン集団および非結合集団の接続と比較しました。自然に接続されたニューロンから、およびマイクロマニピュレーションによって記録されたシナプス前活動電位後の電気的応答は有意に高く、シナプス前活動と一時的に相関しています。

一度習得すると、この技術は適切に行えば8時間で実行できますが、この手順を試みる際には、迅速で再現性のある結果を保証するために、健康でパターン化された長期細胞培養を行うことを覚えておくことが重要です。この手順に従って、さまざまな方法を使用して、マイクロマニピュレートされた接続の電気的機能を確認できます。このビデオを見れば、マイクロ流体チャンバーで細胞集団を増殖させる方法や、ピペット操作を使用して神経突起を開始、拡張、接続する方法を十分に理解できるはずです。