Name: 精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶ精巣上体一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録法。ラット精巣上体から上皮細胞を分離し、電気的特性を測定することで精子成熟における生理機能を解明する手法です。

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私たちは、このテキストに関する有益なコメントをいただいたChristopher Antos博士に感謝します。この作業は、上海テクニカル大学（Winnie Shum）に授与された創立資金と、中国自然科学財団（NNSFC no。31471370）からの資金提供によって支援されました。

全ての動物実験は、ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施され、これは国内外の要件を満たすものである。 1.実験動物<ol><li>成熟雄Sprague-Dawleyラット（約300〜450g）を8-12週齢の間に使用する。ラットのこの年齢で、精子は尾部精巣上体に到着した。 </li></ol>ラット・カウダ・エピジディミドからの上皮細胞の単離注記：以下の手順は、特に明記しない限り、無菌条件下で実施します。 <ol><li> 解剖器具および試薬の調製 <ol><li>解離ツールを70％エタノールに浸して消毒し、空気乾燥させます。 </li><li>温浴（32℃）を入れます。 1％（v / v）の抗生物質を補充した1x Roswell Park Memorial Institute 1640培地（RPMI）500mLを調製し、（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で標識し、「RPMI（+ P / S 1：100）」と表示した。この手順は、清潔なエアーフロー制御作業ステーションで行います。 </li><li>非必須アミノ酸（0.1mM）およびピルビン酸ナトリウム（1mM）を含有し、5-α-ジヒドロテストステロン（1nM）、10％ウシ胎仔血清（1mM）を補充した1×500mLのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM） 1％（v / v）抗生物質（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で洗浄し、「Full-IMDM」として標識した。 50 mLアリコートを作り、パラフィルムで密封する。 4℃で保存する。無菌状態を使用する。 </li><li>コラゲナーゼタイプIおよびコラーゲナーゼタイプIIをRPMI（+ P / S 1：100）に溶解して、溶液中の各コラゲナーゼ1mg / mLを生じるように、コラゲナーゼ酵素消化溶液を調製する。 0.22μm膜を通してろ過し、「コラゲナーゼ溶液」としてマークする。使用するまで室温（RT）に保つ。酵素溶液の容量を調整する酵素の重量に対して; 1匹のラットの両方の尾副睾丸に必要な最小量は2mLである。 </li><li> RPMI（+ P / S 1：100）で35mmディッシュを満たす。 </li></ol></li><li> ラット尾部精巣上体の解剖 <ol><li>ペントバルビタールナトリウム85mg / kgを腹腔内投与するか、またはイソフルランチャンバーを使用して、動物が尾摘み刺激に応答しなくなるまで、動物を屠殺する。頚椎脱臼が続く。 </li><li>下腹部を70％エタノールで拭いて消毒し、静かに2匹の精巣を下部腹部に押し込み、陰嚢近くの下部腹部を開きます。 </li><li>精巣上体脂肪を拾い、全生殖器（精巣、精巣上体および精管）を摘出し、RPMI（+ P / S 1：100）で皿に浸す。 </li><li> RPMI（+ P / S 1：100）で皿の生殖器官を無菌作業ステーションに移す。 </li><li>結合組織および脂肪組織からepididymidesを摘出し、epi異形カプセル。 1 mLの副睾丸を約0.2 mLのコラゲナーゼ溶液で1.5 mLのチューブに入れます。このステップを清潔な空気流量制御ワークステーションに行います。 </li></ol></li><li> ラット尾部精巣上体から単細胞の解離 <ol><li>組織がペースト状の液体になるまで、細かいはさみを使用してコラゲナーゼ溶液中の精巣上体を切断する。はさみをゆっくりと1.5mLチューブの残りの（〜0.8mL）酵素溶液ですすぎます。 </li><li>チューブをメタルサーモミキサー上に37℃で30分間、1000rpmの振盪速度で置く。 </li><li>酵素 - 組織混合物をRTで30xgで3分間遠心分離し、ほとんどが精子を含む粘着性の上清を傾瀉する。 </li><li>ペレットを1mLのFull-IMDMに再懸濁し、すべての酵素活性を消失させる。 49mLのRPMI（+ P / S 1：100）を含む50mLチューブに細胞懸濁液を移す。 注：必要に応じて、細胞懸濁液を100μmメッシュメンブレンに一定のトリチウムでろ過します大規模な細胞凝集を避けるためにイオン。ただし、増殖細胞単層の細胞懸濁液が必要な場合は、メッシュフィルターを使用しないでください。 </li><li>室温で30分間、細胞混合物を10分間遠心分離する;上清を傾瀉する。 </li><li>少なくとも5分間穏やかに磨り潰しながらペレットを1mL Full-IMDMに再懸濁し、酵素処理された副睾丸組織混合物から単一細胞を解離させる。 </li></ol></li><li> 無菌条件下での他の細胞からの上皮細胞の分離 <ol><li> Full-IMDMを含む10cmペトリ皿上で少なくとも8時間または一晩、細胞懸濁液を5％CO 2中の32℃のインキュベーター内で培養する。 </li><li> 100％アルコールに浸漬することにより、予め滅菌カバースリップを調製する。空気を乾燥させ、少量の培地に浸す。カバースリップを6cm培養皿または24ウェルプレートの単一ウェルに入れる。 </li><li>翌朝、穏やかに細胞懸濁液を収集することによって解離した上皮細胞を回収する大部分は上皮細胞からなるペトリ皿からのものである。細胞懸濁液を室温で30xgで5分間遠心分離し、上清を傾瀉する。 </li><li> 〜2 mL Full-IMDMに細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>採取した細胞懸濁液0.2mLを各無菌カバースリップの中心に置く。 </li><li>細胞懸濁液を液滴中に少なくとも10分間置いて、細胞をガラスカバースリップに緩く付着させる。注意深く10 mLディッシュの端に1 mL Full-IMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3 mL Full-IMDMを加えます。細胞を乱さないでください。 </li><li>パッチクランプ実験まで32℃、5％CO 2インキュベーター内のカバーガラス上に単離された単一細胞を保つ。 </li></ol></li></ol> 3.記録液とマイクロピペット注：パッチクランプ実験では、最高品質の化学物質と溶液を使用してください。 <ol><li> ストック溶液の調製 <ol><li>ストック保存用にすべてのボトルをオートクレーブし、使用前にすべてのストック溶液（腐食性溶液を除く）をろ過し、0.22μmメンブレンでろ過する。 </li><li>全てのストックRTに予め溶液、及び4 O Cで保存準備：5 MのNaCl; 1M KCl; 100mM MgCl 2 ; 100mM CaCl 2 ; 200mM NaH 2 PO 4 ; 100mM EGTA（pH7.0、KOH）。腐食性溶液として5M NaOH、1M HClおよび1M KOHストックを取り扱う。 </li></ol></li><li> 標準的な外部記録生理食塩水（PSS）の調製 <ol><li>パッチクランプ記録の朝、ストック溶液を室温に温める。 </li><li> CaCl 2を除く所望の最終容量に従って、 例えば 500mLのPSSを調製するために、各ストックから成分をピペットで採取する：140mMのNaCl = 14mLの5M; 5mM KCl = 2.5mLの1M; 1.2mM MgCl 2 = 100mMの6mL; 1.2mMのNaH 2 PO 4 = 3mLの200mM。 </li><li>ダブルを追加（ddH 2 O）を最終容量400mLになるまで加え、平衡化する。 </li><li> 0.9gのグルコースおよび1.19gのHEPESを秤量し、溶液混合物中に完全に溶解させる。 </li><li>撹拌しながらCaCl 2ストック（2.5mM = 100mMの12.5mL）を添加する。 </li><li>最終体積の99％を追加します。 </li><li> NaOHまたはHClを用いてpHを7.4に調整する。 </li><li>浸透圧を確認し、必要に応じて5M NaClまたはグルコースを用いて調整する。 </li><li>シリンダー中でddH 2 Oを500mLの最終容量に加える。 </li></ol></li><li> マイクロピペット内部溶液の調製（低EGTA K +ベースの溶液） <ol><li>所望の最終容量および濃度に従って、各ストックからの正しい量の試薬を計量またはピペットで採取する（ 例えば 、50mLの低EGTA K +ベースの細胞内溶液を約30mLの容量に調製するため）ddH 2 O：100mM K-グルコン酸= 1.17g; 35mM KCl = 1M 1.75mL; 2mM MgCl 2 = 1mL100mMの濃度; 0.1mMのEGTA = 0.05mLの100mM; 10mM HEPES = 0.072g。 </li><li> 〜95％の最終容量に十分な水を加え、溶液を室温で平衡させる。ソリューションがクリアであることを確認します。 </li><li>溶液を絶えず攪拌しながら、KOHを用いてpHを7.2に調整する。 </li><li> 0.078gのMg-ATPを秤量し、完全に溶解するまで溶液に加える。 </li><li>溶液を氷上に置き、浸透圧の測定に少量のアリコートを用いる。典型的には、溶液は〜290mOsmolを測定し、調整する必要はない。オスモル濃度が280-295mOsmolと著しく異なる場合は、新しい解決法を用意する。 </li><li>最終容量にddH 2 Oを加える。 </li><li>溶液を500μLアリコートに分け、0.2μmシリンジフィルターでろ過し、密封して直ちに-20℃以下で保存します。 </li><li>パッチクランプ実験の日付に、細胞内溶液の1つのアリコートを氷上で解凍し、パッチクランプ実験中に冷却したままにする。劣化を防ぐ。 </li></ol></li><li>パッチピペットをガラス製の毛細管から引き出し（ピペットプラーユーザーズマニュアルに従ってください）、細胞内溶液で満たされたときに5-10Mの抵抗を有するマイクロピペットサイズを得る。 </li></ol> 4.パッチクランプ実験のセットアップと細胞による全細胞構成の確立<ol><li> パッチクランプ実験のセットアップ <ol><li>パッチクランプセットアップ（コンピュータ、コンピュータ制御アンプ、デジタイザなど ）の電源を入れます。 </li><li>パッチクランプソフトウェア（ 例えば、 AXON pCLAMP10またはHEKA PatchMaster）を開き、電気生理学的記録のためのプロトコールを設定する。信号のフィルタを1~3 kHzでローパス、デジタイザを10~20 kHzに設定します。 </li><li>カメラ、マイクロマニピュレータ、光源の電源を入れます。 </li><li>コンピュータ制御アンプがオンになっているときは、接地されたパッチクランプリグを手で触れて実験者の身体を接地し、感電から保護するために、ヘッドステージに触れる前に。 </li><li>ガラスカバースリップ上の培養上皮細胞を、室温で〜1mLの標準PSSで満たされた記録チャンバーに移す。パッチクランプ実験の前に、入浴PSSをピペットで少なくとも2回慎重に交換してください。 注記：必要に応じて、計画された実験に従って標準PSSまたは別の外部ソリューションで潅流システムを満たします。パッチクランプ実験を開始する前に、顕微鏡マウントされた記録チャンバー（RC-26GまたはRC-26GLP）を〜2mL /分の速度で数回PSSで灌流する。灌流システムに沿って気泡が閉じ込められていないことを確認します。 </li><li>差動干渉コントラスト光学系を備えた10倍および40倍対物レンズを使用して、倒立顕微鏡下で細胞を表示および選択する。大きな単一の単離された細胞を記録のために探す。単離された精巣上皮細胞を、球状の粗いmで同定する膜の一端にあるミクロビリと細胞内の内容物の分極分布（ 図1 ）。 </li><li> 1 mLシリンジ（自家製の非金属マイクロシリンジ針）を使用して、マイクロピペットに内部溶液（低EGTA K +ベースの溶液、ステップ3.3を参照）を充填する。マイクロピペットに気泡がないことを確認し、マイクロピペットの抵抗を高めることができます。内部溶液がマイクロピペットホルダー内の塩化物被覆銀ワイヤー電極を浸漬するのに十分な溶液を使用する。 </li><li>マイクロピペットを電極ホルダーに取り付け、低正圧（〜0.2 mLシリンジ容量）をかけます。後のステップで細胞膜に触れるまで、低陽性の圧力を続けてください。 </li></ol></li><li> 録音用のセルで全セル構成を確立する <ol><li>ピペットをマイクロマニピュレーターの最高速度の浴溶液に浸します。ピペットを見つけるデジタルカメラに接続された画面の先端。マイクロマニピュレータの速度を中速モードにまで遅くします。 </li><li>迅速にコンピュータ制御増幅器から発生する電圧ステップ（ 例えば 100ミリ秒5 MV）を適用することによって、データ収集インターフェースコマンド（軸索システムにおいて、例えば 「膜テスト」）を用いてマイクロピペットの抵抗（5-10MΩ）を確認。抵抗がこの範囲外に大きくなると、新しいマイクロピペットに変更してください。 </li><li>顕微鏡に取り付けられた対物レンズを下ろし始めます。徐々にマイクロピペットを選択された細胞の方に導く。マイクロピペットが選択されたセルの中心面の上に来るまで、常に目的を下げてから、マイクロピペットを焦点面に下ろします。 </li><li>ソフトウェアのコマンダーインターフェースで「ピペットオフセット」コマンドを使用して、ピペットと浴の溶液間の液体接合電位をゼロに戻します。 </li><li>コンピュータ制御のアンプを設定する電圧クランプおよび膜試験から「バス」モードに移行する。 </li><li>細胞のより明瞭な視野のために細かい焦点を合わせ、その後、低中速でマイクロマニピュレーターを用いて徐々にマイクロピペットを下げる。 </li><li>マイクロピペットが細胞に近接しているとき（メンブレン試験コマンドによってトリガーされたときに電流が減少することにより示される）、すぐに低陽性圧力を除去し、弱い負圧（0.1mLシリンジ容量）を適用して、 。 </li><li>メンブレンテストで抵抗を監視する。抵抗が500MΩ以上で1GΩ未満の場合は、負の電位（通常は-60 mVに設定された保持電位）を印加します。これはギガシールの形成を助けます。マイクロピペットの過渡的な容量性電流を補償する。 </li><li>シールが&gt; 1GΩ以上で安定している場合（ソフトウェアインタフェースで示されているように）、細胞膜を破壊するために短時間で強く吸引してください。あなたのために補償を適用しないでください抵抗とセル容量を低減します。 </li><li>成功した全細胞構成を達成した直後に、-60mVの保持電位から10mV過分極段階（最小時間間隔、20ms持続時間、20kHzでのシグナルサンプル）を適用する。 </li><li>電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、ソフトウェアインターフェースからの読み取り値をマークするか、または細胞の膜電位測定値のギャップフリー記録（10-60秒）を実行します。 </li><li>電圧モードに素早く戻って電圧モードを維持し、計画された実験に従って電圧プロトコルを適用し、現在の応答を測定します。減算は、記録中に本来のリーク電流に適用されません。 </li><li>記録中の応答の安定性、または細胞の異なるパラメータを監視する。たとえば、「膜試験」コマンドインターフェイスを使用して、入力抵抗（R i ）、直列抵抗（R s ）およびセルプロトコールの切り替え中の「細胞」モードでの膜試験における膜容量（C m ）。 注：入力抵抗の急激な低下は、通常、緩いパッチを示し、直列抵抗の劇的な増加は、細胞内小器官または膜断片によるマイクロピペット先端の目詰まりを示し得る。記録中、マイクロピペットの位置を定期的に監視して、ドリフトが発生しているかどうかを確認します。これにより、パッチが失われる可能性があります。ドリフトが問題の場合は、マイクロピペットとパッチニングセルを一緒に持ち上げて、記録チャンバーの底から離してください。このステップでは、パッチが失われることがあります。この場合、セル全体のパッチクランプ手順を繰り返す必要があります。 </li></ol></li></ol> 5.細胞の受動電気生理学的性質の分析<ol><li>パッチクランプ実験からデータを得た後、Clampfitソフトウェアで空隙のないデータを開き、平均を測定する各細胞の休止膜電位の値。あるいは、現在のモードでゼロ電流電圧から下げた値を使用してください。液体接合電位（この研究では12.4mV）で値を補正する。 </li><li>式などを用いて、入力抵抗（R i）を 、細胞から得られた10-mVの過分極工程（ΔV）からデータを開く（ΔIは ステップ ）の前、ステップ中の電流の差を測定し、計算します。 <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/55700/55700eq1.jpg" /></li><li>セル容量（C m 、pF単位）を計算する（電圧ステップ・トリガで発生した最初の過渡減衰電流の間の膜コンデンサ電流の下の合計面積を積分することにより、10mV過分極ステップからの同じ電流データを使用する）。細胞の総蓄積電荷（pA・ms単位のQ）の値を得る。次の式を使用します。 <img alt="式2" src = &quot;/ files / ftp_upload / 55700 / 55700eq2.jpg&quot; /&gt; </li><li> 10mVの負のステップからの初期過渡電流を標準指数アルゴリズムでフィッティングして時定数減衰電流（ T 、単位はms）を得ることによって、各セルの直列抵抗（R s ）の値を計算し、次の方程式： <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/55700/55700eq3.jpg" /></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

このプロトコルにおいて、ラット尾部精巣上体の酵素的分散は、一貫して健常な上皮細胞を産生した。パッチクランプ実験のための副睾丸上皮細胞の質は、プロトコルのいくつかの重要なステップに依存する。例えば、低遠心力（30×g）での細胞混合物の遠心分離は、精子および精巣上体内腔の内容物を除去するために重要である。精巣上体細胞は、細胞培養中の精子の存在下では不健康になる。さらに、解離した細胞混合物をペトリ皿上で数時間培養することは、線維芽細胞および平滑筋細胞を除去するための重要なステップである。非上皮細胞は培養皿上でより速く接着し、上皮細胞を懸濁液中に残し、穏やかな吸引によって再収穫することができる。さらに、コラゲナーゼ消化および細かいガラスピペットによる粉砕は、放出するための2つの重要なステップである細胞解離手順の間に単細胞である。最後に、非効率的な酵素活性による過小消化または長期インキュベーションによる過消化は、ピペットと細胞膜との間のギガオームシール形成を妨害する可能性があるため、精巣上体細胞の酵素消化がパッチクランプ実験にとって重要である。 細胞混合物では、一方の末端に立体虫を有し、細胞...

男性生殖管の精巣上体は、モザイク上皮細胞の層で裏打ちされた器官である。他の上皮組織と同様に、主細胞、清澄な細胞、基底細胞および免疫系およびリンパ系からの細胞を含む種々の細胞型の副睾丸上皮は、尿細管最前線で障壁として機能するよう協調して働き、精子成熟および生理学1、2、3のための細胞を支持します。したがって、これらの上皮細胞は、リプロダクティブ・ヘルスに必須の役割を果たす。 上皮細胞は、一般による電圧依存性Na +またはCa 2+チャネル4,5の欠如に、刺激を脱分極に応答して、全か無かの活動電位を生成することができない非興奮性の細胞とみなされます。しかし、上皮細胞はユニ分泌および栄養輸送などの特殊な生理的役割を調節するイオンチャネルおよび輸送体のセット6 。したがって、異なる上皮細胞は、特徴的な電気的特性を有する。例えば、主細胞は、流体及び塩化物輸送のためにCFTRを発現し、明確な細胞が管腔酸性1、7、8、9のためのプロトンポンプV-ATPアーゼを発現するのに対し、カルシウム再吸収のためのTRPV6を発現します。精巣上体上皮細胞の生理機能を調節するいくつかのトランスポーターおよびイオンチャネルが報告されているが、精巣上体上皮細胞の機能的特性は、主として、まだ10、11、12、13には理解されていません。 Whオレ細胞パッチクランプ記録は、興奮性細胞および非興奮性細胞の両方の固有特性を調べるための確立された技術であり、異種細胞試料中の主に解離した細胞の機能を研究するのに特に有用である。電圧クランプは、受動膜特性と単セル14、15のイオン電流を測定するために使用されます。受動的膜特性には、入力抵抗および容量が含まれる。前者のパラメータは固有膜コンダクタンスを示し、後者は細胞膜の表面積（細胞外および細胞内の媒体を分離する薄い絶縁体として働く、イオンチャネルおよび輸送体が位置するリン脂質二重層）を意味する。膜容量は、細胞膜の表面積に正比例する。入力抵抗によって反映される膜抵抗と共に、膜時定数w細胞膜電位がイオンチャネル電流の流れにどのくらい速く応答するかを示す指標を決定することができる。この点で、セルに印加される電圧の一連の工程からの電流応答特性を組み合わせることによって、細胞の生物物理学的動態及び特性は15、16、17、18を決定します。 本論文では、ラット尾部精巣上体から上皮細胞を単離するための手順、および全細胞パッチクランプを用いて解離した細胞混合物中の異なる細胞型の膜特性を測定するための工程を記載する。精巣上体の主要細胞は明確な膜電気生理学的特性を示し、コンダクタンスは他の細胞型から容易に同定できることを示す。

<table><tbody><tr><td>Axonシステムの機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ制御アンプ</td><td>分子デバイス - Axon</td><td>Multiclamp 700B パッチクランプアンプ</td><td></td></tr><tr><td>デジタル取得システム</td><td>分子デバイス - Axon</td><td>Digidata 1550コンバータ</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>BX-61WI</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータ</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>記録室とインラインヒーター</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Instrument of HEKA system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp amplifier</td><td>Harvard Bioscience - HEKA</td><td>EPC-10 USB double</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipurator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>録音室・インラインヒーター</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>その他の機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>録音室</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>RC-26G または自家製チャンバー</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸キャピラリーガラス フィラメント</td>付き <td>サッター・インストゥルメント / ハーバード・イスラーム</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>TMC&nbsp;</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>HAMAMASTU</td><td>ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents for isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibca</td><td>15140112</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>2005年30月30日&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>C12440500BT Collagenase</td><td></td></tr><tr><td>I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII</td><td>ΣC6885</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-&α;-ジヒドロテストステロン</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-A0120</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>山羊</td>座 <td>FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>マイクロピペット内部溶液(K +ベースの溶液)(pH 7.2、280-295 mOsm)</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl、35mM</td><td>シグマ/各種</td><td>V900068</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ>&ミドドット、6H<サブ>2</サブ>O、2mM</td><td>シグマ/各種</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>EGTA、0.1mM</td><td>シグマ/各種</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、10mM</td><td>シグマ/各種</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>K-グルコン酸、100mM</td><td>シグマ/各種</td><td>P-1847</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP、3mM</td><td>シグマ/各種</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td><強力>標準外部記録生理食塩溶液(PSS)(pH 7.4、300-310 mOsm)</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl、140mM</td><td>シグマ/各種</td><td>V900058</td><td></td></tr><tr><td>KCl、4.7mM</td><td>Sigma/各種</td><td>V900068</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 2.5mM</td><td>Sigma/各種</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & middot; 6H2O, 1.2mM</td><td>Sigma/各種</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4、1.2mM</td><td>Sigma/各種</td><td>V900060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、10mM</td><td>Sigma/各種</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、10mM</td><td>シグマ/各種</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td><強力>pH調整用</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>シグマ/各種</td><td>V900797</td><td>純度>=97%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>シグマ/各種</td><td>60371</td><td>純度>=99.99%</td></tr></tbody></table>

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

精巣上体は、精子の成熟および生殖に関する健康に不可欠な器官である。副睾丸上皮は、分子および形態学的特徴だけでなく生理学的特性においても区別される複雑に連結された細胞型からなる。これらの違いは、精巣上体内腔における精巣後精子の発生に必要な微小環境を共に確立する多様な機能を反映している。副睾丸上皮細胞の生物物理学的特性の理解は、生理学的および病態生理学的条件下での精子および生殖器の健康におけるそれらの機能を明らかにするために重要である。それらの機能的特性はまだ完全に解明されていないが、副睾丸上皮細胞は、細胞事象および単一細胞の膜特性を測定するためのツールであるパッチクランプ技術を用いて研究することができる。ここでは、細胞単離法および全細胞パッチクランプ法を用いて、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を確認してください。

ラットカウダの精巣上体から上皮細胞を単離するための説明酵素消化手順は、我々の以前の研究9、12から修正されたプロトコルです。この方法は、90％以上の生存率を有し、表面ブリスターまたは膨潤した細胞容積のない単一細胞の混合物を産生する。我々は以前に1を記載しているように異種細胞混合物は、主に主細胞、明確な細胞および基底細胞からなります。このプロトコルでは、副睾丸上皮細胞の比較的純粋なサンプルは、ペトリ皿上で一次解離細胞を一晩培養して、非​​上皮細胞（線維芽細胞および平滑細胞など）を皿上に接着させることによって得ることができる。 図1A （収穫前）に示されている。細胞型は、顕微鏡下での表現型によって予備的に区別することができるそれらの特定の受動的な膜特性に従って分類される。解離した細胞混合物中には、それらの表面膜の一端に微絨毛または粗い膜を有し、偏極した細...

本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

この手順の総合的な目的は、ラットの精巣上体から上皮細胞を単離し、ホールセルパッチクランプ法を用いて、これらの一次的に分散させた細胞の電気的特性を測定することです。この手法は、精子の成熟や父親の形質の継承に重要な精巣上体の機能など、生殖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術を用いることで、単離した精巣上体上皮細胞の電気的特性を解析することができ、これにより、これらの細胞の未知の生理学的機能を明らかにすることが可能になります。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるBao Li Zhangが行います。まず、解剖器具を70% ethanolに浸して消毒します。その後、自然乾燥させてください。次に、完全IMDMを調製します。その後、無菌条件下で50 mlずつ分注し、Parafilmで密封して4°Cで保存します。続いて、コラゲナーゼタイプIおよびコラゲナーゼタイプIIをRPMIに溶解し、各コラゲナーゼの濃度が1 mg/mLとなるようにして、コラーゲン分解酵素消化液を調製します。溶液を0.22 µmのメンブレンでろ過します。次に、「コラゲナーゼ溶液」とラベルを貼り、使用時まで室温で保存します。続いて、酵素の重量に基づいて酵素溶液の容量を調整します。1匹のラットの両側副精巣尾部から得られる必要最小量は2 mLです。ラットの副精巣尾部を摘出するには、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与、またはイソフルランチャンバーを用いて、尾をつまむ刺激に反応しなくなるまで麻酔をかけ、その後頚椎脱臼により安楽死させます。その後、下腹部を70%エタノールで拭いて消毒します。2つの精巣を優しく下腹部へと押し下げ、陰嚢付近の下腹部を切開します。続いて、精巣上体周囲の脂肪を除去し、すべての生殖器官を摘出します。その後、RPMIを入れたディッシュにそれらを移します。クリーンで気流制御されたワークステーションにおいて、精巣上体尾部を結合組織、脂肪組織、および精巣上体被膜から切り離します。1.5 mLチューブに、精巣上体1つと0.2 mLのコラゲナーゼ溶液を入れます。精巣上体尾部から単一細胞を分離させるため、組織がペースト状の液体状になるまで、微細な鋏を用いてコラゲナーゼ溶液中で精巣上体を細切します。次に、チューブに残っている酵素溶液でハサミを軽くすすぎます。その後、チューブをメタルサーモミキサーに設置し、37 °C、振盪速度 1,000 rpm で30分間処理します。次いで、酵素と組織の混合液を室温で3分間遠心分離します。その後、主に精子が含まれている粘性の高い上清をデカンテーションで除きます。次に、すべての酵素活性を停止させるため、ペレットを1 mLの完全IMDMで再懸濁します。続いて、細胞懸濁液を49 mLのRPMIが入った50 mLチューブに移します。細胞混合液を遠心分離し、上清をデカンテーションで除去します。ペレットを1 mLの完全IMDMで再懸濁し、少なくとも5分間緩やかにピペッティング（trituration）することで、酵素処理した精巣上体組織混合液から単一細胞を解離させます。無菌条件下で上皮細胞を他の細胞から分離し、細胞懸濁液を完全IMDMを含む10 cmペトリ皿に入れ、32 °Cのインキュベーター内で少なくとも8時間または一晩培養します。翌朝、カバーガラスを100%アルコールに浸して滅菌します。風乾させた後、少量の培地に浸します。次に、カバーガラスを6 cm培養皿または24ウェルプレートのシングルウェルに入れます。次に、主に上皮細胞で構成されているペトリ皿から細胞懸濁液を穏やかに回収し、解離させた上皮細胞を回収します。細胞懸濁液を室温で 30 ×g で5分間遠心分離し、上清をデカントします。その後、細胞ペレットを 2 mL の完全 IMDM で再懸濁します。回収した細胞懸濁液0.2 millilitersを、滅菌済みカバーガラスの中央に播種します。細胞がガラスカバーガラスに緩やかに接着するように、細胞懸濁液を液滴内で少なくとも10分間静置します。その後、細胞を乱さないように、6 cmディッシュの端に1 milliliterの完全IMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3 millilitersの完全IMDMを慎重に加えます。分離した単一細胞を載せたカバーガラスは、パッチクランプ実験までインキュベーター内で32 degrees celsiusに保持します。パッチクランプ実験当日、細胞内液の分注液1本を氷上で解凍し、分解を防ぐため実験中も冷却した状態で保持します。次に、ガラスカバーガラス上で培養した上皮細胞を、室温の標準PSSを満たした記録室に移します。パッチクランプ実験を行う前に、ピペットを使用して浸漬用PSSを少なくとも2回注意深く交換してください。ホールセル構成を確立するために、マイクロマニピュレーターの最高速度でピペットをバス溶液に浸します。デジタルカメラに接続された画面上でピペットチップを確認してください。次に、マイクロマニピュレーターの速度を中〜高モードに下げます。コンピュータ制御のアンプから生成された電圧ステップを印加し、データ収集インターフェースのコマンドを使用して、マイクロピペットの抵抗値を迅速に確認します。抵抗値がこの範囲から大幅に外れている場合は、新しいマイクロピペットに交換してください。次に、ソフトウェアのコマンドインターフェースにあるピペットオフセットコマンドを使用して、ピペットとバス溶液間の液絡電位をゼロに設定します。メンブレンテストで抵抗値をモニターしてください。抵抗値が500 MΩより大きく、1 GΩより小さい場合は、ギガシール形成を促進するために負の電位を印加してください。その間に、マイクロピペットの過渡容量電流を補正します。この時点で、シール抵抗を測定するために、保持電位0 mVから10 mVの過分極ステップを印加します。ホールセル構成が正常に完了した後、直ちに保持電位-60 mVから10 mVの過分極ステップを印加します。電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、10秒間のギャップフリー記録を行い、細胞の静止膜電位を測定します。その後、速やかに電圧モードに戻し、そのままの状態を維持します。計画した実験に従って電圧プロトコルを適用し、電流応答を測定します。パッチクランプ実験に先立ち、ディッシュで一晩培養し、再回収する前後のラット精管尾部から単離した上皮細胞の例を以下に示します。この図は、パルス誘発プロトコルを用いて単一の精管上皮細胞から記録された典型的なホールセル電流を示しています。点線は電流ゼロのレベルを示しています。以下は、指示されたタイムポイントで測定された電流応答の電流-電圧関係です。これらは、ATPを含むまたは含まないピペット溶液で透析した主細胞の静止膜電位の代表的なトレースです。そして、この棒グラフは、ATP添加時と非添加時の初期静止膜電位の間に有意な差がないことを示しています。バー内の括弧内の数字は、少なくとも3匹の動物からテストした細胞数を示しています。また、ここでは、全細胞または主細胞のみのシール抵抗および入力抵抗と、ホールセル形成直後のゼロ電流クランプで測定した静止膜電位、および保持電位から-100 mVへの過分極ステップで測定した電流値との相関分析を示しています。この手法に習熟し、適切に実施すれば、9時間で完了させることができます。この手順を行う際は、細胞分離ステップにおいて酵素消化を直ちに停止させることが重要です。さもない contrárioに、過剰消化が起こり、ギガオームシール（gigaohm seal）の形成が困難になり、パッチクランプ実験が失敗する可能性があります。培養細胞の健全性を維持するためには、酵素的に解離させた細胞混合液を 30 G の低速で 2～3 分間遠心分離し、主に精細胞を含む粘性の高い上澄み液をデカンテーションで除去することが重要です。これらの手順に従い、ライブセルイメージングや単一細胞培養法などの他の手法を用いることで、例えば、ナイーブな上皮細胞における静止膜電位が制御条件下での細胞外挙動をどのように調節しているかといった、さらなる疑問を明らかにすることが可能です。本手法は、生殖生物学分野の研究者が、精子の成熟や父親から受け継がれる獲得形質の遺伝における精巣上体上皮細胞の電気生理学的特性を探索するための道を切り開くものです。このビデオを視聴することで、ラットの精巣上体から上皮細胞を単離する方法、およびホールセルパッチクランプ法を用いてこれらの細胞の電気的特性を測定する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。...

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。...

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオでは、内耳感覚ニューロン細胞体のイオン電流を測定するためのパッチクランプ技術を示しています。アムホテリシンBを含む内部溶液を充填した研磨パッチクランプピペットの調製と使用について詳しく説明します。このピペットは、メンブレンに穴を開けて、細胞内状態を維持しながらイオンを移動できるようにします。電圧パルスは、イオンチャネルの活動をトリガーおよび記録するために印加され、その特性と挙動に関する洞察を提供します。...

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。...

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

この記事では、HEK293細胞を用いた電気生理学的全細胞パッチクランプ記録により、チャネルロドプシンのイオン選択性がどのように決定されるかを説明しています。ここでは、陰イオン選択性チャネルロドプシンの塩化物選択性を調べるための実験手順を示します。しかしながら、この手順は、異なる選択性を有する他のチャネルロドプシンに移管可能である。...

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC...

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

このプロトコルは、ラット脳底動脈から平滑筋細胞を分離し、全細胞パッチクランプ技術を使用してこれらの細胞の内部整流カリウムチャネル電流を記録するための迅速かつ効率的な方法を説明しています。これは、脳底動脈とイオンチャネルを研究する研究者に新しいアプローチを提供します。...

パッチクランプ法による新たに分離された脳底動脈平滑筋細胞における内向き整流K + 電流の記録

学ぶ精巣上体一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録法。ラット精巣上体から上皮細胞を分離し、電気的特性を測定することで精子成熟における生理機能を解明する手法です。

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

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