精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

この手順の全体的な目標は、ラット精巣上体から上皮細胞を単離し、全細胞パッチクランプ法を使用してこれらの主に解離した細胞の電気的特性を測定することです。この方法は、精子の成熟や父性形質の遺伝に重要な精巣上体の機能など、生殖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、ユーザーは単離された精巣上体上皮細胞の電気的特性を焼灼できるため、これらの細胞の未知の生理学的機能を示すことができます。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるBao Li Zhangです。手順を開始するには、70%エタノールに浸して解剖ツールを消毒します。.その後、自然乾燥させます。

次に、完全なIMDMを準備します。その後、無菌状態で50mlのアリコートを作成し、パラフィルムで密封し、摂氏4度で保存します。その後、コラゲナーゼI型とII型コラゲナーゼをRPMIに溶解してコラーゲン性酵素消化液を調製し、溶液中の各コラゲナーゼ1ミリリットルあたり1ミリグラムを生成します。

0.22マイクロメートルのメンブレンを通して溶液をろ過します。その後、コラゲナーゼ溶液としてマークし、使用するまで溶液を室温で保管します。次に、酵素の重量に基づいて酵素溶液の量を調整します。

1匹のラットから採取した両方の尾状精巣上体に必要な最小容量は2ミリリットルです。ラットの尾状精巣上体を解剖するには、IP注射によるペントバルビタールナトリウムを使用するか、動物が尾のつまみ刺激に反応しなくなるまでイソフルランチャンバーを使用して動物を犠牲にし、その後子宮頸部脱臼を行います。その後、下腹部を70%エタノールで拭いて消毒します。

2つの精巣を下腹部までそっと押し下げてから、陰嚢近くの下腹部を開きます。その後、精巣上体脂肪を取り除き、すべての生殖器官を解剖します。その後、RPMIでそれらを皿に移します。

清潔で気流制御された作業ステーションで、結合組織と脂肪組織、および精巣上体嚢から精巣上体尾を解剖します。1.5ミリリットルのチューブに0.2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む1つの精巣上体を置きます。尾状精巣上体から単一細胞を解離するには、コラゲナーゼ溶液中の精巣上体を細いハサミを使用して、組織がペースト状の液体になるまで切断します。

次に、チューブ内の残りの酵素溶液でハサミをやさしくすすぎます。その後、チューブを金属製のサーモミキサーに30分間、摂氏37度で1, 000 rpmの振とう速度で置きます。次に、酵素組織混合物を室温で3分間遠心分離します。

その後、精子の大部分を含む粘着性のある上清をデカントします。次に、ペレットを1ミリリットルのフルIMDMに再懸濁して、すべての酵素活性をクエンチします。続いて、細胞懸濁液を49ミリリットルのRPMIを含む50ミリリットルのチューブに移します。

細胞混合物を遠心分離し、上清をデカントします。ペレットを1ミリリットルの完全IMDMに再懸濁し、少なくとも5分間穏やかにトリチュレーションして、酵素処理された精巣上体組織混合物から単一細胞を解離します。無菌条件下で上皮細胞を他の細胞から分離し、細胞懸濁液を完全なIMDMを含む10cmのペトリ皿で少なくとも8時間または摂氏32度のインキュベーターで一晩培養します。

翌朝、100%アルコールに浸して滅菌カバースリップを準備します。風乾してから、少量の培地に浸します。次に、カバースリップを6cmの培養皿または24ウェルプレートのシングルウェルに入れます。

次に、主に上皮細胞で構成されるペトリ皿から細胞懸濁液を穏やかに収集することにより、解離した上皮細胞を回収します。細胞懸濁液を室温で30倍Gで5分間遠心分離し、上清をデカントします。その後、細胞ペレットを2ミリリットルのフルIMDMに再懸濁します。

採取した細胞懸濁液0.2ミリリットルを各滅菌カバースリップの中央に播種します。細胞懸濁液を液滴に少なくとも10分間沈殿させて、細胞がガラスカバースリップに緩く付着するようにします。次に、細胞を乱さずに、6cmのディッシュの端に1ミリリットルのフルIMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3ミリリットルのフルIMDMを慎重に加えます。

インキュベーター内のカバースリップに単離された単一細胞を、パッチクランプ実験まで摂氏32度に保ちます。パッチクランプ実験当日は、細胞内溶液の1アリコートを氷上で解凍し、パッチクランプ実験中は冷やして劣化を防ぎます。次に、ガラスカバースリップ上の培養上皮細胞を、室温で標準PSSを充填した記録チャンバーに移します。

パッチクランプ実験の前に、ピペットを使用して入浴PSSを少なくとも2回慎重に交換してください。全細胞構成を確立するには、マイクロマニピュレーターの最高速度でピペットを浴溶液に浸します。デジタルカメラに接続された画面でピペットチップを見つけます。

次に、マイクロマニピュレーターの速度を中高モードに遅くします。コンピュータ制御のアンプから発生する電圧ステップを印加し、データ収集インターフェースコマンドでマイクロピペット抵抗を迅速に確認します。抵抗がこの範囲から大幅に外れている場合は、新しいマイクロピペットに交換してください。

また、ソフトウェアのコマンダーインターフェースでピペットオフセットコマンドを使用して、ピペットと浴液の間の液体ジャンクション電位をゼロに設定します。メンブレンテストで抵抗を監視します。抵抗が500メガオームより大きく、1ギガオームより小さい場合は、負の電位を印加してギガシールの形成を助けます。

その間、マイクロピペットの過渡容量性電流を補償します。このとき、シール抵抗を決定するために、保持電位が0ミリボルトから10ミリボルトの過分極ステップを適用します。成功した全細胞構成を達成した直後に、負の60ミリボルトの保持電位から10ミリボルトの過分極ステップを適用します。

電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、10秒間のギャップフリー記録を実行して、セルの静止膜電位を測定します。その後、すぐに電圧モードに戻し、そのままにします。計画された実験に従って電圧プロトコルを適用し、電流応答を測定します。

これは、パッチクランプ実験前の皿上で一晩培養する前と後のラット尾精巣上体から単離された上皮細胞の例です。この図は、パルス誘発プロトコルを使用して単一の精巣上体上皮細胞から記録された典型的な全細胞電流を示しています。点線は電流レベルがゼロであることを示しました。

これは、示された時点で測定された電流応答の電流電圧関係です。これらは、ATPまたはATPなしのピペット溶液で透析した主要細胞の静止膜電位の代表的なトレースです。そして、この棒グラフは、プラスATPとマイナスATPの初期静止膜電位の間に有意差がないことを示しています。

バー内の括弧内の数字は、少なくとも3匹の動物からテストされた細胞の数を示しています。そして、ここには、すべてのセルのシール抵抗と入力抵抗、または主セルのみと、全セル確立直後のゼロ電流クランプで測定された静止電位と、過分極ステップで測定された電流の大きさから保持電位からマイナス100ミリボルトまでの相関分析があります。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば9時間で完了できます。

この手順を試みる際には、細胞単離ステップ中にすぐに酵素消化を停止することを覚えておくことが重要です。そうしないと、過剰消化が発生し、ギガオームシールの形成が困難になったり、パッチクランプ実験が失敗したりする可能性があります。培養物の健康を維持するためには、酵素的に解離した細胞混合物を30Gの低速で2〜3分間スピンダウンし、精子細胞をほとんど含む粘着性の上清をデカントすることが重要です。

これらの手順に続いて、ナイーブ上皮細胞の静止膜電位が制御された条件下で細胞外挙動を調節する可能性があるなどの追加の質問に答えるために、生細胞イメージングや1細胞培養技術などの他の方法を実行することができます。この技術は、生殖生物学の分野の研究者が精子の成熟と父方の獲得形質の遺伝を制御するために、精巣上体の上皮細胞の電気生理学的特性を探求する道を開きます。このビデオを見れば、ラット精巣上体から上皮細胞を単離する方法と、全細胞パッチクランプ法を使用してこれらの細胞の電気的特性を測定する方法について十分に理解できるはずです。