新生児マウス蝸牛移植法

この手順の全体的な目的は、聴覚研究におけるin vitroスクリーニングツールとして使用する、新生マウス蝸牛外植片の作製、培養、処理、および免疫染色の実施です。この手法は、ex vivoモデルにおいて蝸牛の有毛細胞、シナプス、ニューライト、およびニューロンを同時に研究することを可能にし、ヒト分泌物に含まれる因子を含む、蝸牛において新規の分子の作用機序への知見を提供するなど、聴覚研究分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、候補治療化合物のスクリーニングプロセスを、in vivoでの試験前に加速させることができる点にあります。

70% ethanolを満たしたペトリ皿の蓋に入った、採取したばかりの新生児の頭部を用意します。メスを用いて、頭蓋骨の前端から後端にかけて皮膚に浅い切開を加えます。次に、両側の外耳道を切開し、皮膚を前方へ折り返して頭蓋全体を露出させます。

次に、蝸牛への圧迫を避けるため、メスを前方から後方へ向かって慎重に上下に動かし、正中縫合に沿って頭蓋骨を開きます。眼窩の直後を垂直に切断し、吻部を取り除いて廃棄してください。頭蓋骨の後部には、脳と蝸牛が保持されている必要があります。

次に、ピンセットを用いて前脳、小脳、および脳幹を鈍的に剥離して除去します。頭蓋骨の2つの半分を、冷たいHBSSを満たした60 mmのプラスチック製ペトリ皿に入れます。その後、ピンセットを使用して、周囲のアブミ骨動脈に隣接する蝸牛を完全に露出させ、側頭骨からこの器官を鈍的に分離します。

蝸牛をHBSSを含む50 millimeterのクリアウォールガラスボトムペトリ皿に移し、皿を顕微鏡の下に配置します。頭蓋骨のもう半分が入った60 millimeterのプラスチック製ペトリ皿を氷上に置きます。次に、4本のピンセットを使用して、蝸牛の耳包を慎重に解剖します。

次に、マイクロナイフまたは2本の55番ピンセットを用いて、コルチ器に付着しているらせん靭帯を、蝸牛の残りの部分および内側壁から慎重に分離します。これは、らせん靭帯の最も基底側を把持し、頂端側へ移動しながらゆっくりと解くことで行えます。らせん靭帯を除去した後、蝸牛の縦方向の矢状断像が得られるように標本を配置してください。

次に、マイクロナイフを用いて蝸牛を2～3つのセクションに切断し、これらのセクションを頂回転および基底回転に分類します。蝸牛外植片をペトリ皿の上に水平に置くことができるよう、より頂側に位置する断片では上方の組織を、より基底側に位置する断片では下方の組織を、有毛細胞と神経突起の実際の層まで除去します。続いて、ピンセットを使用して、コルチ器の直上にある非常に薄い半透明の層である蓋膜を、優しくつかんで剥がします。

最も技術的に困難な工程は、半透明で薄い蓋膜の除去であると考えられます。これは、直下の有毛細胞を容易に損傷させる可能性があるためです。組織の端から開始することで、蓋膜の剥離を開始した最端部を除き、外植片の長さに沿った有毛細胞を保存することができます。最後に、らせん神経節ニューロンの直上にあるライスナー膜を、ピンセットで両側から触れて剥ぎ取ることで除去します。

辺縁部の損傷箇所を除去し、蝸牛検体を培養可能な状態にします。外植片がチップ内部に付着するのを防ぐため、1 mL ピペットの先端を約 120 µL の DMEM で湿らせ、培養手順を開始します。次に、あらかじめ湿らせたチップを用いて、ガラス底ペトリ皿から最大 70 µL の液体を吸引し、検体を液体と共に4ウェルペトリ皿の4つのインレイのいずれかに配置します。

顕微鏡下で、外植片が正しい向きにあるかを確認します。耳蓋膜を除去した有毛細胞の領域が上を向き、基底膜とトリミングされた内側側壁の基底部が下を向いてカバーガラスインレイに密着していることを確認してください。検査の結果、ここに示すように標本が上下逆さまになっている場合は、ピペットチップからHBSSを加え、正しい向きになるまで断片の位置を調整します。

外植片を正しく配置した後、余分なHBSSを吸引し、15秒間待ちます。次に、ピペットで温めた培養液60 µLを検体に直接滴下します。この際、ピペットが検体に触れないように注意してください。内側と外側のペトリ皿の蓋を閉じ、37 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、ペトリ皿に入った蝸牛外植片をインキュベーターからラミナーフローフードへ移動させます。インレイからFBSを含まない古い培地を吸引し、あらかじめ準備しておいた温めた処理培地を1ウェルあたり60 µLずつ加えます。

シャーレをインキュベーターに戻し、最大7日間培養した後、染色の工程へと進みます。この共焦点画像に見られるように、本手法ではらせん神経節ニューロン（SGNs）を含む蝸牛回転全体の解剖学的構造が保持されるため、コルチ器に加えてSGNsの神経突起や細胞体に対する処理の影響を解析することが可能です。ここで示されている通り、これらの外植片を用いることで、免疫蛍光染色後に頂回転と基底回転に対する処理の影響を同時に比較することができます。

有毛細胞を緑色で、神経構造を赤色で示しています。シナプスの完全性は、シナプス前タンパク質（赤色）とシナプス後タンパク質（緑色）を、神経構造の染色（青色）とともに標識することで評価できます。この図は、3% FBS（左）または1% FBS（右）で7日間培養した後の、蝸牛頂端部および基底部の外植片の代表的な画像を示しています。

3% FBSで培養した細胞は、有毛細胞を示す薄いグレーの矢印と神経突起を示す赤色の矢印で示されているように、4日から5日の間に遊走し始めます。1% FBS中の外植片は、7日まで組織的な完全性を維持します。この手順を行う際は、最終的な培養液や目的の物質を添加する前に、蝸牛組織の構造的完全性と方向を視覚的に確認することが重要です。

この手順に従い、3D再構築を行うことで、内側核内におけるGFP発現細胞の細胞型特異的な局在を確認することができます。