Name: 新生児マウス蝸牛移植法インビトロ聴覚研究のスクリーニングツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ新生児マウス蝸牛移植法による聴覚研究のインビトロスクリーニング技術。蝸牛毛細胞、シナプス、神経突起を同時に解析し、治療薬候補の効果を迅速に評価する方法です。

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この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（SDサポート）、防衛省のW81XWH-15-1-0472（KMS）、Bertarelli財団（KMS）、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）などがあります。 Jessica E. Sagers氏に感謝の意を表します。

この研究プロトコールは、マサチューセッツ州の眼および耳の施設動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認された。実験は世界医師会の倫理規定に従って実施された。 1.解剖の準備<ol><li> 手術テーブルの準備 <ol><li> 70％エタノールを使用して外科用テーブルを消毒する。 </li><li> 2つの非滅菌準備パッドを顕微鏡の隣に置きます。 </li><li>熱殺菌した手術用ハサミ、メスハンドル、マイクロナイフ、鉗子（＃4と＃55の2つずつ）を含む計器トレイを準備します。器具トレイと50mmの透明壁のガラス底ペトリ皿を1つの非滅菌パッドに置きます。 </li><li>無菌の＃15メス刃を得る。密封可能なプラスチック製の袋または容器（制度上のガイドラインに沿って死体を処分するため）。バケツの氷;冷たい滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む。これらのアイテムを他の非滅菌パッド。 </li><li> HBSSを50 mLのプラスチック試験管に移し、氷上に置きます。 </li></ol></li><li> 文化の準備 <ol><li>すべての材料を層流フードで準備する。 4つの標本ごとに、35mm4ウェルペトリ皿の4つのインレーに4つのオートクレーブ処理した10mmの丸いガラスカバースリップを入れる。 </li><li> 4つの標本ごとに、以下のものからなる300μLの全量を微量遠心チューブに混合する：組織接着剤10μL、NaHCO 3285μLおよびNaOH5μL。 </li><li>得られた溶液45μLをすべてのカバースリップに入れ、室温で少なくとも20分間放置する。この溶液は数時間カバースリップ上に放置することができるが、O / Nを放置することはできない。 </li><li>コンタミネーションに対する2つの障壁を作り出すために、1つまたは2つの35mm 4穴ペトリ皿を10cmのペトリ皿の中に置きます。 </li><li> 98％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％N-2、および1％アンピシリン（（マイクロ）遠心分離管内で1ウェルあたり65μL）で洗浄した。使用前に25℃に加温してください。 </li></ol></li></ol> 2.マウスの蝸牛外植片の解剖<ol><li> 新生児マウスの断頭 <ol><li> 60 mmのプラスチックペトリ皿を用意し、蓋に70％エタノールをスプレーして、表面が濡れるようにします。 </li><li>冷たいHBSSをプラスチック製の実験室チューブから60mmのプラスチックの底部と50mmの透明なガラス底のペトリ皿に注ぎます。解剖されていないときはいつでも組織を冷たく保つために、プラスチック実験室管と両方のペトリ皿を氷上に保管してください。 </li><li> P3-P5歳の新生児マウスをラテックス手袋の切れた指の氷上に置き、低体温が意識消失（約1〜3分）を引き起こすまで待つ。 </li><li>操作はさみでマウスをすばやく断頭し、シール可能なビニール袋に体を処分する。切断された新生児の頭を60mmのプラスチックシャーレの蓋の中の70％エタノール。 </li></ol></li><li> 側頭骨の巨視的切開 <ol><li>メスの刃を使用して、前端から後端（矢状縫合の上に直接）から表面切開を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を除去する。 </li><li>外耳道の両方をメスの刃で切って、皮膚を前方に折り畳んで頭蓋全体を露出させます。 注：このステップには通常、解剖顕微鏡は必要ありませんが、視覚化を改善するために使用することができます。 </li><li> ＃15メス刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。蝸牛の圧迫を避けるために、刃を前方から後方へ静かに上下に動かして頭蓋を切断してください。 注：頭蓋骨はこの年齢で骨化してはならず、簡単に切るべきです。 </li><li> ＃15メスを使用して、軌道の直後の垂直カットを作成して、スナウトを取り出して破棄します刃。 注：頭蓋骨の後部にはまだ脳と蝸牛が含まれているはずです。 </li><li> ＃4鉗子で鈍的切開を行い、前脳、小脳、および脳幹を処分する。 </li></ol></li><li> 蝸牛の微視的抽出 <ol><li>スコープの下に鉗子を置き、照明と焦点を最適化することによって顕微鏡（倍率6.5倍）と光源を調整します。 </li><li>冷たいHBSSで満たされた60mmプラスチックペトリ皿に頭蓋の2つの半分を置きます。 </li><li>周囲の静脈動脈（側頭骨内の曲がりくねった動脈）に隣接していると同定できる蝸牛/ eを完全に露出させ、＃4の鉗子を用いて臓器を側頭骨から鈍く分離する。 </li><li>蝸牛を50mmの透明なガラス底のペトリ皿に移し、顕微鏡の下に置く。 </li><li>氷上に頭蓋の他の半分と60ミリメートルのプラスチックシャーレを置きます。 </&gt; <li>蝸牛を前庭系から取り出し、＃4の鉗子で蝸牛耳の嚢（典型的には軟骨性）を慎重に切開する。それ以降のすべてのステップで＃55鉗子を使用してください。 </li></ol></li><li> 組織処理の最終ステップ <ol><li>マイクロナイフまたは2つの鉗子を用いて、コルチ器官に付着した螺旋靭帯を残りの蝸牛および神経節から注意深く分離することにより、内耳組織の処理を続ける。 <ol><li>螺旋靭帯と有毛細胞領域との間の隙間のより暗くて半透明な領域に切断し、螺旋靭帯を最も基本的な側面で把握し、尖った方向に動いている間にゆるやかに引き離すことに続く。 </li></ol></li><li>検体を配置して、蝸牛の長手方向矢状図を取得し、マイクロナイフを用いて蝸牛を2〜3つの切片に切断し、これらの切片を頂端、（中央、）およびbアナルターン。ペトリ皿に水平に横たわることができる蝸牛外植片を達成するために、有毛細胞および神経突起の実際の層と上および下組織を除去する。 注記：培養皿への安定した接着のための適切なサイズは、1つの蝸牛ターンの約半分である。 </li><li>腹膜を静かに剥がして、コルチ器官のすぐ上の非常に薄い半透明の層である房膜を取り除く。 </li><li> Reissnerの膜をすぐにSGNよりも優れたものにし、両側に鉗子で触れ、剥がしてください。 注：横に位置する損傷した有毛細胞領域をマイクロナイフで切り取って取り除きます。 </li></ol></li></ol> 3.検体の培養プレートへの移送<ol><li> 4つのカバースリップから45μLの組織接着剤溶液を除去する。各カバースリップを50μLの滅菌H 2 Oで洗浄する。水を吸引する。 </li><li> 1 mLのピペットを拾います。試料がチップの内側に付着しないように、約120μLのDMEMでピペットチップを濡らします。 </li><li> 1 mLピペットを用いて検体を個別に移す。 HBSSで満たされた、小さくて透明なガラス底のペトリ皿から最大70μLをピペットで取り、4ウェルのペトリ皿に4つのインレイ（カバースリップで調製）の1つに液体と共に試料を置く。 </li><li> 標本の向きが正しいことを顕微鏡（倍率50倍）で確認します。胸膜が除去された有毛細胞の領域が上向きであることを確認する。モディベラのトリムされた基底部分と一緒に、基底膜が下向きになり、カバースリップに付着することを確認する。 <ol><li>標本が検査の際に上下逆さまになっている場合は、ピペットチップに残っているHBSSをインレイに入れ、正しい方向になるまでピースの位置を変えます。 NOTE：これは、退化につながる可能性のあるカバースリップからの構造的支持なしに有毛細胞が培地中に浮遊することを防止する。 </li></ol></li><li> 1 mLピペットを使用して過剰のHBSSを吸引する。 15秒待ちます。 </li><li>調製した暖かい培地（98％DMEM、1％N-2、および1％アンピシリン）60μLを検体に直接ピペットで加える。ピペットで検体に触れないように注意してください。内側および外側のペトリ皿カバーを交換し、37℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>すべてのストック溶液を適切な場所に戻し、死骸や残留廃棄物を処分し、施設ガイドライン（ 例えば、エタノールや次亜塩素酸塩を使用して）に従って手術テーブルを除染し、器具をきれいにしてオートクレーブし、 。 </li></ol> 4.最終的な培養培地および対象物質の追加注：蝸牛外植片は、10-16時間後に使用する準備ができている。 <ol><li>混合物を準備する97％DMEM、1％ウシ胎児血清（FBS）、1％N-2、および1％アンピシリン（マイクロ遠心管内のウェルあたり65μL;使用前に溶液を25℃に暖める）。 </li><li>該当する他の物質を、それぞれの治療グループのソリューションに追加します。蛍光物質（ 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現ウイルス;最近の発表では、10 10 GCのアデノ関連ウイルス（AAV）を50μL中48時間使用した） 18 、光。 </li><li>孵卵器から蝸牛外植片を含むペトリ皿を移し、層流フードの下に置く。 </li><li>インレーからのピペットで古い培地（FBS無し）を吸引する。 </li><li>調製した温かい培養（処理）培地（97％DMEM、1％FBS、1％N-2,1％アンピシリン、および対象物質）1ウェルあたり60μLを添加する。 </li><li>ペトリ皿をインキュベーター（37℃）に戻します。 </li><li>ビューr細胞の移動、または蝸牛外植片の剥離の兆候を同定し、最大7日後に染色を実施するために、顕微鏡下で公式に観察する。 </li></ol> 5.免疫蛍光 - 1日目<ol><li>ブロッキング溶液（94％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5％正常ヤギまたはウマ血清（2次抗体に応じてNGS / NHS）、および1％非イオン性界面活性剤（ 表の表を参照 ） （98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤をそれぞれの抗体とともに含む）で洗浄した。 注：抗体には、1：400+（ミオシン7A、内外の有毛細胞用）およびマウス抗TuJ1 1：200+（β-チューブリン、SGN用）またはマウス（IgG1）抗マウス抗体（後シナプス密度）、およびニワトリ抗NF-H1：1000 +（ニューロフィラメント（neurofilament））、抗マウスモノクローナル抗体SGNおよび神経線維の場合）。 &quot;+&quot; means &quot;以上である必要があります。 </li><li>ピペットを用いて培地を吸引する。検体に触れないように注意してください。 </li><li>層流フードの下で、滅菌PBSで蝸牛外植片を2回すすぎ、各洗浄後に5分間シェイカー上に検体を置く。 </li><li>シェーカー（フードの下）で20分間4％パラホルムアルデヒド（PFA - CAUTION）に組織を固定する。 PFAを吸引する。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>蝸牛外植片を、シェーカー上で30分間、調製したブロッキング溶液（94％PBS、5％NHS、および1％非イオン性界面活性剤）中に置く。 </li><li>蝸牛外植片をRTでのカウンター上の対応する一次抗体（使用前にボルテックス）O / Nを用いて調製ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）に入れる。 注：ペトリ皿をプラスチック製のラップ（またはアルミ箔）で囲まれた湿ったペーパータオルで包みますGFPを発現するウイルスなどの蛍光物質を含む）を含み、皿を湿潤に保ち、抗体溶液O / Nの蒸発を防止する。 </li></ol> 6.免疫蛍光 - 2日目<ol><li>ステップ5.1で4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色（300nM）を調製し、ストック抗体溶液を使用して一次抗体に相補的な正しい二次抗体混合物を得る。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギ488 1：200+およびヤギ抗マウス568 1：200+ ORヤギ抗マウス（IgG1）568 1：1000+、ヤギ抗マウス（IgG2a）488 1：500+、およびヤギ抗ニワトリ647 1：200+またはファロイジン568 1：200+（内外の有毛細胞用））。 </li><li>一次抗体溶液を吸引する。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>蝸牛外植片を準備ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）にres（使用前にボルテックス）をカウンターで1.5時間インキュベートし、光から保護する。 </li><li>二次抗体溶液を吸引し、DAPI染色液（シェーカー上に1分間置いてから吸引する）で蝸牛外植片をすすいでください。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>鉗子を使用して、4ウェルプレートから検体を含むカバーガラスを取り出し、蒸留水で満たされたレシピエントにそれらを浸し、ペーパータオルに垂直に接触させてカバースリップを乾燥させる。 </li><li>顕微鏡スライド上に曇り止め装着媒体の一滴を置き、カバースリップを反転させて、下向きの組織を培地に浸す。 </li><li>周りを覆って透明なマニキュアを使用してカバースリップをシールします（ガラスの下に試料を押しつぶすことなく）。乾燥した状態となるまで15〜20分間明かりから覆った部分にスライドを平らにしておきますそれらを箱に入れたり、共焦点顕微鏡の下で検査したりしてください。 注：蛍光染色は、スライドを4℃または-20℃で保存することで最もよく保存されます。 </li></ol> 7.共焦点イメージング<ol><li>神経突起およびSGNを含むCorti地域の器官の概要およびズームイン画像を取得します。 注：イメージングプロセスの標準設定：1,024×1,024ピクセル、400Hzの速度、フレーム平均3、20％の総合レーザー強度、通常20倍および63倍の油浸漬（潜在的に2倍デジタルズームと組み合わせる）。 405 5％DAPI、 &quot;スマートゲイン&quot; 766.8V、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％〜488 15％のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、 &quot;スマートゲイン&quot; 622.2VのDAPI、Myo7A、およびTuJ1染色プロトコルのチャンネル設定が概説されています。 、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％ - 561 13％テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、 &quot;スマートゲイン&quot; 562.4V、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％。 </li><li>画像をZスタックにマージするには、ソフトウェアを使用してz軸投影を得る。 </li></ol>

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<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

研究者は、蝸牛外植物を含む実験を行う前に解剖技術を完璧にしなければならない。有毛細胞は、学習曲線の早期に行われる解剖の間に一般的に損傷を受け、その完全性のための特に問題のある瞬間は、安定した手、適切な道具および経験を必要とする体膜の除去である。時間と資源を節約するために、解剖顕微鏡の下で視覚制御を行うべきであり、潜在的に損傷した領域に注目すべきである。高価な一次および二次抗体を使用する代わりに、ファロイジンのような安価な試薬が予備実験に適しています。わずかに損傷した外植片は、潜在的には、特定の実験（影響を受けていない切片の分析）または新しい抗体の組み合わせの試験において、対照として使用することができる。 標本の移送も特に重要です。標本の移送が保証されなければならないからです逆さまになっていない（被覆されたカバースリップの指針をしばしば縮退させない「浮遊」有毛細胞）。カバースリップ上の中央位置は、さらなるピペッティングステップを容易にする。 新規化合物（明らかに培地に可溶性でなければならない）を含む陰性対照実験では、外植片に適切...

感音神経障害（SNHL）は、内耳または上行する聴覚経路への損傷を反映する。難聴はヒトの最も一般的な感覚障害であるが、治癒療法はまだ存在していない2 。蝸牛や聴覚の脳幹インプラントは、重度から重度のSNHLの患者にある程度の聴覚を回復することができますが、これらの装置で提供される聴力は、特に聴覚の発声を理解したり、音楽を聴いたりする試みにおいて、 毛細血管変性は長い間、外傷性聴覚事象（ 例えば、大きな騒音への曝露）の主な結果と考えられているが、有毛細胞から聴神経へ情報を伝達するシナプスは少なくとも音響外傷3 と同様に脆弱であるという証拠が増えている3 、 4,5 </sup<html> &gt; 、 6 。聴覚機能の評価のための現行の金標準である人間の聴力検査閾値は、内耳の特定の細胞損傷を予測しないので、細胞変性をできるだけ早期に検出し、適切な治療を開始するためにより洗練されたツールが必要です。 難聴のための有望な薬学的治療は、しばしば、インビトロでの均一な細胞培養物について試験されるが、このようなシステムは、蝸牛の微小環境を正確にモデル化しない。蝸牛細胞は、Corti 10,11またはSpiral Ganglion Neurons（SGN） 12の臓器を単離培養したときに失われる重要なインビボ過程である蝸牛8,9内の他の細胞型に影響を及ぼす栄養因子を分泌することが知られている分子マーカーを分析するしかしながら、「精密医学」の追求において、難聴のための新たなパーソナライズされた治療法を確立するためのインビトロデータの検証に必要であり得るインビボ研究は、かなりの資源と時間を必要とする。聴力検査とその後の蝸牛全体装着の中耳または円形窓膜注入を完璧に行うためにどれだけの労力が必要ですか？蝸牛外植体として知られている器官型ex vivo培養物の有望な化合物の効率的なスクリーニングは、 14,15,16,17 。 この記事では、治療された蝸牛外植片を生成、維持、評価するためのプロトコルについて詳述します。スクリーニングでの使用を含むこのモデルの特定のアプリケーションが強調されています遺伝子治療のためのウイルスベクターの比較評価を含む。 エクスビボでの外植片アプローチにより、研究者は、異なるタイプの細胞集団に対する所定の治療の効果を現場で視覚化し、細胞型特異的機構の同定およびその後の標的化治療の洗練を容易にすることができる。 全体的に、この技術は、蝸牛内に共存する非常に異なる細胞タイプ間の重要なクロストークを維持しながら、 生体外で蝸牛を研究するモデルを提供する。

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2抗体, マウス(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>抗Myo7A抗体, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>抗NF-H抗体, ニワトリ</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>抗PSD95抗体, マウス(IgG2a)</td><td>抗体と関連製品株式 会社。</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>抗 TuJ1 抗体、マウス</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive、5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes、円錐底、目盛り、Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish、100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 細胞培養ディッシュ、35 x 10 mm、4 つの内輪</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 細胞培養ディッシュ、60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL 遠心チューブ、円錐底、目盛り、滅菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>クリアウォールガラスボトムディッシュ(ガラス40mm)、PELCO&reg;、スリーブ/20、50 x 7mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、丸型、ガラス、直径10 mm、厚さ#1、0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水、500 mL</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルスミディアム(DMEM)、高グルコース、ピルビン酸、グルタミンなし、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #4 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #55 鉗子 (デュモスター)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール (EtOH)、ピュア、200プルーフ、無水、&ge;99.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)、認定済み、USDA 承認地域、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>50mLチューブに分注し、-20°Cで保存してください。C 冷凍庫</td></tr><tr><td>ヤギ抗ニワトリ-647 二次抗体</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス(IgG)-568 二次抗体</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス(IgG1)-568 二次抗体</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス(IgG2a)-488 二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ-488二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O、滅菌、EmbryoMax Ultra Pure Water、500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド不使用、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>蓋付き機器トレイステンレス鋼</td><td>マウンテンサイドメディカル</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ(解剖)ナイフ&ndash;角度30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、VistaVision、色分け、75 x 25 mm (3 x 1")、厚さ 1 mm、白、72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)、5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3、重炭酸ナトリウム 7.5% 溶液、100 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH、水酸化ナトリウム溶液、1 L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>正常馬血清(NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)、試薬グレード、結晶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td>使用<td>前:オンライン</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4、500 mL</td>のプロトコルに基づいて標準操作手順を確立します <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>ファロイジン、アレクサフルーア568&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>プレップパッド、非滅菌&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave before to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave before to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 実体顕微鏡</td><td>ツァイス&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (非イオン性界面活性剤)</td> <td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield 蛍光用退色防止封入剤</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>ジッパーバッグ、再閉可能、4 x 6 '' - 厚さ2 mm</td><td>のジップライン</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

過去数十年間にわたり聴覚研究において顕著な進歩があったが、内耳の繊細な機械感覚構造の損傷または喪失を典型的に伴う状態である感音神経難聴（SNHL）の治療法はまだない。近年、精巧なin vitroおよびex vivoアッセイが出現しており、SNHLの治療法を開発するためのリソースを最小限に抑えながら、潜在的治療化合物のスクリーニングを可能にしています。特定の細胞型の均質な培養物が現在の研究において重要な役割を果たし続けているにもかかわらず、多くの科学者は現在、蝸牛外植片としても知られているより複雑な器官型の内耳細胞培養に頼っています。内耳内の組織化された細胞構造の保存は、内外の有毛細胞、らせん状神経節ニューロン、神経細胞を含む蝸牛インフルエンザの様々な成分のin situ評価を容易にするites、および支持細胞。ここでは、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置、および免疫染色を提示する。これらの外植片の注意深い準備は、SNHLに寄与する機構の同定を容易にし、聴覚研究共同体にとって貴重なツールとなる。

多くのプロトコルがCorti外植片の器官に焦点を当てていますが、この技法はSGNを含む蝸牛ターン全体の解剖学的構造を保存しようとします。これにより、研究者は、Cortiの器官に加えて、SGNの神経突起および体細胞に対する所与の治療の効果を分析する機会を得ることができる。ここに記載されているように、モディオラスの一部を保存する解剖を行うことは、コルチのみの器官を外植するよりも技術的に困難です。しかし、同じ方法論19,20を用いた2つの最近の刊行物において、前庭シュワン細胞腫分泌物（ 図1 ）および細胞外小胞を適用した後、この領域に有意な病理学的効果が観察されたため、神経突起およびSGN領域が重要である。このような変化は、単離されたCorti外植片の器官を用いることによっては明らかにされなかった。 Th支持細胞およびSGNに対する損傷細胞またはGFP発現細胞の定量化は、マニ...

このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

この手順の全体的な目的は、聴覚研究におけるin vitroスクリーニングツールとして使用する、新生マウス蝸牛外植片の作製、培養、処理、および免疫染色の実施です。この手法は、ex vivoモデルにおいて蝸牛の有毛細胞、シナプス、ニューライト、およびニューロンを同時に研究することを可能にし、ヒト分泌物に含まれる因子を含む、蝸牛において新規の分子の作用機序への知見を提供するなど、聴覚研究分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、候補治療化合物のスクリーニングプロセスを、in vivoでの試験前に加速させることができる点にあります。70% ethanolを満たしたペトリ皿の蓋に入った、採取したばかりの新生児の頭部を用意します。メスを用いて、頭蓋骨の前端から後端にかけて皮膚に浅い切開を加えます。次に、両側の外耳道を切開し、皮膚を前方へ折り返して頭蓋全体を露出させます。次に、蝸牛への圧迫を避けるため、メスを前方から後方へ向かって慎重に上下に動かし、正中縫合に沿って頭蓋骨を開きます。眼窩の直後を垂直に切断し、吻部を取り除いて廃棄してください。頭蓋骨の後部には、脳と蝸牛が保持されている必要があります。次に、ピンセットを用いて前脳、小脳、および脳幹を鈍的に剥離して除去します。頭蓋骨の2つの半分を、冷たいHBSSを満たした60 mmのプラスチック製ペトリ皿に入れます。その後、ピンセットを使用して、周囲のアブミ骨動脈に隣接する蝸牛を完全に露出させ、側頭骨からこの器官を鈍的に分離します。蝸牛をHBSSを含む50 millimeterのクリアウォールガラスボトムペトリ皿に移し、皿を顕微鏡の下に配置します。頭蓋骨のもう半分が入った60 millimeterのプラスチック製ペトリ皿を氷上に置きます。次に、4本のピンセットを使用して、蝸牛の耳包を慎重に解剖します。次に、マイクロナイフまたは2本の55番ピンセットを用いて、コルチ器に付着しているらせん靭帯を、蝸牛の残りの部分および内側壁から慎重に分離します。これは、らせん靭帯の最も基底側を把持し、頂端側へ移動しながらゆっくりと解くことで行えます。らせん靭帯を除去した後、蝸牛の縦方向の矢状断像が得られるように標本を配置してください。次に、マイクロナイフを用いて蝸牛を2～3つのセクションに切断し、これらのセクションを頂回転および基底回転に分類します。蝸牛外植片をペトリ皿の上に水平に置くことができるよう、より頂側に位置する断片では上方の組織を、より基底側に位置する断片では下方の組織を、有毛細胞と神経突起の実際の層まで除去します。続いて、ピンセットを使用して、コルチ器の直上にある非常に薄い半透明の層である蓋膜を、優しくつかんで剥がします。最も技術的に困難な工程は、半透明で薄い蓋膜の除去であると考えられます。これは、直下の有毛細胞を容易に損傷させる可能性があるためです。組織の端から開始することで、蓋膜の剥離を開始した最端部を除き、外植片の長さに沿った有毛細胞を保存することができます。最後に、らせん神経節ニューロンの直上にあるライスナー膜を、ピンセットで両側から触れて剥ぎ取ることで除去します。辺縁部の損傷箇所を除去し、蝸牛検体を培養可能な状態にします。外植片がチップ内部に付着するのを防ぐため、1 mL ピペットの先端を約 120 µL の DMEM で湿らせ、培養手順を開始します。次に、あらかじめ湿らせたチップを用いて、ガラス底ペトリ皿から最大 70 µL の液体を吸引し、検体を液体と共に4ウェルペトリ皿の4つのインレイのいずれかに配置します。顕微鏡下で、外植片が正しい向きにあるかを確認します。耳蓋膜を除去した有毛細胞の領域が上を向き、基底膜とトリミングされた内側側壁の基底部が下を向いてカバーガラスインレイに密着していることを確認してください。検査の結果、ここに示すように標本が上下逆さまになっている場合は、ピペットチップからHBSSを加え、正しい向きになるまで断片の位置を調整します。外植片を正しく配置した後、余分なHBSSを吸引し、15秒間待ちます。次に、ピペットで温めた培養液60 µLを検体に直接滴下します。この際、ピペットが検体に触れないように注意してください。内側と外側のペトリ皿の蓋を閉じ、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、ペトリ皿に入った蝸牛外植片をインキュベーターからラミナーフローフードへ移動させます。インレイからFBSを含まない古い培地を吸引し、あらかじめ準備しておいた温めた処理培地を1ウェルあたり60 µLずつ加えます。シャーレをインキュベーターに戻し、最大7日間培養した後、染色の工程へと進みます。この共焦点画像に見られるように、本手法ではらせん神経節ニューロン（SGNs）を含む蝸牛回転全体の解剖学的構造が保持されるため、コルチ器に加えてSGNsの神経突起や細胞体に対する処理の影響を解析することが可能です。ここで示されている通り、これらの外植片を用いることで、免疫蛍光染色後に頂回転と基底回転に対する処理の影響を同時に比較することができます。有毛細胞を緑色で、神経構造を赤色で示しています。シナプスの完全性は、シナプス前タンパク質（赤色）とシナプス後タンパク質（緑色）を、神経構造の染色（青色）とともに標識することで評価できます。この図は、3% FBS（左）または1% FBS（右）で7日間培養した後の、蝸牛頂端部および基底部の外植片の代表的な画像を示しています。3% FBSで培養した細胞は、有毛細胞を示す薄いグレーの矢印と神経突起を示す赤色の矢印で示されているように、4日から5日の間に遊走し始めます。1% FBS中の外植片は、7日まで組織的な完全性を維持します。この手順を行う際は、最終的な培養液や目的の物質を添加する前に、蝸牛組織の構造的完全性と方向を視覚的に確認することが重要です。この手順に従い、3D再構築を行うことで、内側核内におけるGFP発現細胞の細胞型特異的な局在を確認することができます。

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医学

この手順では、スパイラル輪部とらせん神経節ニューロンの有無にかかわらず、コルチ器のマウス器官の単離および培養のための方法を説明します。我々はまた、エレクトロポレーションにより、コルチ植の器官における外因性レポーター遺伝子の発現のための方法を示しています。...

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

マウス内耳は、その発達プログラム妊娠中に詳述されているプラ​​コード由来の感覚器官である。我々は定義され...

開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで&gt;</em&gt;エレクトロポレーション

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。...

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

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動物モデルの蝸牛に耳毒性物質を導入するための様々な方法が存在します。提示されているのは、丸い窓のニッチに耳毒性物質を送達するための外科的プロトコルです。この手順は信頼性が高く、標的を絞った蝸牛内病変を作成し、マイクロアーキテクチャへの機械的損傷を回避します。蝸牛の自己修復・再生の検討が可能です。...

蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための信頼性の高い方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。...

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人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。...

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。...

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

ミニブタ(ミニブタ)は、人工内耳の研究に最適な大型動物モデルです。ミニブタへの人工内耳手術は、ヒトと同様の生体系における新規電極アレイおよび外科的アプローチの安全性および潜在的性能の初期証拠を提供するために利用することができる。...

ミニブタ:人工内耳研究のための大型動物モデル

現在のプロトコールは、以前のプロトコールを更新し、高品質の蝸牛外植片を培養するための比較的簡単なアプローチを取り入れています。これにより、生細胞および固定細胞における信頼性の高いデータ取得と高解像度イメージングが可能になります。このプロトコルは内耳の細胞を調査することの進行中の傾向を支える。...

In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。...

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

学ぶ新生児マウス蝸牛移植法による聴覚研究のインビトロスクリーニング技術。蝸牛毛細胞、シナプス、神経突起を同時に解析し、治療薬候補の効果を迅速に評価する方法です。

新生児マウス蝸牛移植法

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