Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

この手順の全体的な目標は、共焦点顕微鏡を使用して、ヒト肺腫瘍スライサー内の蛍光共役抗体で標識された常在腫瘍浸潤性CD8 T細胞を画像化することです。この方法は、ヒト腫瘍内のT細胞遊走を正および負に調節する要素の性質など、腫瘍免疫学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、保存されたヒト腫瘍環境上の常在型CD8 T細胞の日常的な挙動を監視できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、2011年にJoVEで最初に発表されたプロトコルである、T細胞を追跡し、スライスに植える方法をMyrinリンパ節で確立したときです。まず、容器に1グラムの低融点アガロースを加え、次に20ミリリットルの滅菌カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを加えます。溶液を電子レンジで加熱して、アガロースを完全に溶解します。

この5%アガロース溶液をインキュベーター内で摂氏37度で5分間冷却します。組織培養フードで、1.1ミリリットルの完全RPMI-1640培地を6ウェルサブウェルサブカルチャープレートの各ウェルに加えます。次に、滅菌鉗子のペアを使用して、滅菌された30ミリメートル細胞培養インサートを各ウェルに配置します。

プレートを摂氏37度で30分間インキュベートし、後で使用します。次に、腫瘍生検を10センチメートルのプラスチック皿に入れ、鋭利な滅菌ブレードを使用して、腫瘍を約5×5ミリメートルの小さな立方体の形の断片に切ります。次に、準備したアガロース溶液をインキュベーターから取り出します。

滅菌鉗子のペアを使用して、腫瘍の断片を組織ワイプに慎重に移して余分な培地を排出し、次にアガロースを35ミリメートルのプラスチック皿に注ぎ、腫瘍の断片を挿入してプラスチック皿の底に配置します。アガロースゲルを氷の上に5分間置いて固めます。アガロースが固まったら、プラスチック皿をひっくり返します。

スパチュラを使用して、ゲル全体を放出します。鋭利な刃で、腫瘍の断片を囲む余分なアガロースを切り取り、組織の周りに3〜5ミリメートルのゲルを残します。無毒の組織接着剤を一滴垂らして、アガロースブロックをビブラトームの試料ディスクに取り付けます。

ビブラトームバッファートレイに滅菌済みの氷冷PBSを充填し、アガロースブロックを含む試料ディスクをトレイに取り付けます。ビブラトームの速度と周波数を目的の値に設定します。ビブラトームのセットアップの準備ができたら、インキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。

次に、ビブラトームを使用して、マウントされたブロックを350ミクロンのスライスに切断し始めます。細い鉗子の助けを借りて、腫瘍スライスを切断するときに慎重に収集し、6ウェルプレートの細胞培養インサートの上に平らに置きます。各インサートに1つのスライスを移します。

次に、細い鉗子を使用して、滅菌済みおよび湿式のステンレス鋼ワッシャーを各スライスに置きます。ワッシャーが腫瘍組織を囲むアガロースにしっかりと配置されていることを確認してください。免疫染色の前に、プレートを加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度に10分間放置します。

必要な蛍光標識抗体と蛍光核色素DAPIを、フェノールレッドフリーRPMI培地で必要なビニル濃度に希釈します。次に、培養プレートをインキュベーターから取り外し、細い先端を使用して、ステンレス鋼ワッシャー内の液体を吸引します。次に、スライスに触れずに、希釈した抗体を各腫瘍スライスに40マイクロリットル加えます。

染色を可能にするために、プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。染色ステップが完了したら、細い鉗子を使用してワッシャーを取り外してください。次に、スライスをそっと取り出し、フェノールレッドフリーのRMPI-1640培地に10秒間浸します。

スライスを細胞培養インサートに戻し、各スライスにフェノールレッドフリーRMPI-1640培地を一滴加えます。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、イメージングに進みます。この実験を開始する数時間前に、顕微鏡のヒートチャンバーの温度を摂氏37度に設定し、その後、酸素化フェノールレッドフリーRMPI培地で腫瘍スライスを常に大量に使用し、蠕動ポンプを使用して溶質を老廃物収集フラスコに吸引するように顕微鏡のセットアップを準備します。

細い鉗子を使用して、染色されたスライスを6ウェルプレートから持ち上げ、フェノールレッドフリーRMPI培地で満たされた35ミリメートルのプラスチック皿に移し、スライスの上にスライスアンカーを配置してサポートします。次に、このシャーレを顕微鏡のイメージングステージに置きます。灌流システムの入口と出口の先端を接続した後、蠕動ポンプをオンにして、酸素化された媒体が灌流チューブを通過するようにします。

水エマージョン対物レンズをスライスに下げ、明るいフィールドライトまたは適切な波長でスライスの上部に焦点を合わせます。次に、適切なフィルターを使用して、蛍光標識されたすべての対象細胞、すなわちCD8 T細胞、腫瘍アイレット、およびCD90陽性間質細胞を含む関心領域を視覚化し、選択します。観察される蛍光シグナルの明るさに適した適切なレーザー強度と露光時間を使用して、イメージングセッションを設定します。

次に、Zスタックの厚さを腫瘍スライス内で画像化するように設定します。次に、Zスタック画像の時間間隔と合計記録時間を選択して、特定の時間間隔で画像をキャプチャします。蛍光画像をキャプチャしてエクスポートした後、テキストプロトコルに記載されているようにCD8 T細胞の遊走を解析します。

ここに示されているのは、染色されたヒト肺腫瘍スライスの代表的な画像です。緑色のCD8陽性T細胞、青色の上皮細胞接着分子染色腫瘍細胞、および赤色のCD90またはThyrum陽性間質細胞の分布に注意してください。特に、CD8 T細胞は、腫瘍アイレットと比較して間質に豊富に存在することに注意してください。

ここにプロットされているのは、緑色に染色された個々の常在型CD8 T細胞の軌跡と、ヒト肺腫瘍切片の赤間質および青色の腫瘍細胞コンパートメントです。第2高調波発生を使用して検出され、赤で表示されるコラーゲンは、間質コンパートメントをマークします。腫瘍アイレットよりも豊富ではありませんが、CD8 T細胞は間質と比較してこのコンパートメント内をより活発に移動します。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、通常は4、5時間で行うことができます。このビデオの後、共焦点顕微鏡を使用して常在するCD8 T細胞をモニターするための免疫染色体液腫瘍サンプルの入手方法について十分に理解しているはずです。