Name: ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団細胞の単離法。がん幹細胞活性を含む細胞集団を前向きに単離し、ゼブラフィッシュがん研究への応用可能性を示す。

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この研究はシカゴ大学女性委員会、ウェンディウィル症例基金、シカゴ大学総合がんセンター支援グラント（P30 CA014599）の支援を受けました。シカゴ大学のフローサイトメトリーコア（Flow Cytometry Core）に感謝したいと思います。この実験の設立には、ドゥ・ジョン研究所の他のメンバー、特にレスリー・ペドラザとショーン・マッコネルもお手伝いします。

ゼブラフィッシュのすべての手順は、シカゴ大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の承認を受けています。シカゴ大学は、実験動物管理（AAALAC）の評価と認定協会の認定を受けています。 1.ゼブラフィッシュにおける蛍光標識T-ALL細胞の生成および単離<ol><li> 同系ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション <ol><li>市販のキットを使用して、tol2トランスポゼース（プラスミドDNAの供給源については表を参照） 12によって認識される逆方向末端反復を含む環状rag2 ：c-mycおよびrag2 ：緑色蛍光タンパク質（ rag2 ：GFP）プラスミドDNAを単離し、滅菌水で洗浄した。 注：この研究ではGFPを使用していますが、蛍光タンパク質があれば動作します。 </li><li> pCS2-トランスポゼース（tol2）RNAを調製する<ol><li>市販のキットを用いてtol2プラスミドDNAを単離する（tプラスミドDNAの供給源の材料表） 12を用いて滅菌水でDNAを溶出させる。 </li><li>適切なバッファーに5単位のNotI制限酵素を加えて37℃で1時間、1μgのtol2 DNAをインキュベートしてプラスミドを線状化する。 NotIを65℃で20分間加熱失活させる。 </li><li>市販のRNA転写キット13を使用して、直鎖状DNAからSP6 RNAポリメラーゼでtol2 RNAを転写する。 -80°Cで1回分のアリコートにRNAを保存します。 </li></ol></li><li> 250ngのrag2 ：c-mycプラスミドDNA、250ngのrag2 ：GFPプラスミドDNA、150ngのtol2 RNA、および0.5μLのフェノールレッドを添加することによって、氷上で注入混合物を調製する。ヌクレアーゼフリーの水で10μLに調整する。 </li><li>先に確立された、ガラス毛細管から引き出されたマイクロインジェクターおよび針を使用して、1細胞段階の同系ゼブラフィッシュ胚の細胞に〜1nLの注射混合物を注入する。方法8,14を磨いた。 注：単為生殖により生成された同系ゼブラフィッシュは、移植後の遺伝的異種性および免疫拒絶を排除するためにここで使用される。しかし、野生型ゼブラフィッシュまたは任意の所望の株も使用することができる。 </li><li>注射後24時間および48時間で、死亡、発育不良、または不正な形式の胚を取り除く16 。 </li><li>注射後6日目に魚系に注射した魚を置き、標準プロトコールに従って魚を飼育する6 。 </li></ol></li><li> ゼブラフィッシュを注射し、腫瘍増殖をモニターする <ol><li>注入後21日目に、ペトリ皿上の胚培地の液滴中に単一注入幼虫を置き、エピ蛍光顕微鏡（励起バンドパス：470/40、放出バンドパス：525/50）を用いてGFP蛍光についてスクリーニングする。 注：ゼブラフィッシュの幼虫はhaveはrag2 ：c-mycとrag2 ：GFPの両方を統合し、緑色の蛍光胸腺（陽性魚）を有し、胸腺を越えて悪性緑色蛍光細胞の拡大をすでに示している可能性がある。 GFP +胸腺を有する全ての魚は、GFP + T-ALLを発症する。プラスミドの組込みを示さない幼虫は、緑色蛍光細胞（陰性魚）を有さない。 </li><li>陰性の魚（蛍光の欠如に基づいて）を別のタンクに分け、注射後28および35日に再び魚をモニターする。注射後28および35日目に、スクリーニング前に魚系水中の0.02％緩衝化トリカイン（MS-222）で魚を麻酔する。 </li><li>蛍光標識された胸腺または蛍光標識された腫瘍について陽性である各ゼブラフィッシュの幼虫を、腫瘍増殖をモニターするための個々のタンクに1週間に3回配置する。 </li></ol></li><li> 一次腫瘍魚からの蛍光標識T-ALL細胞の収集 <ol><li> 0.9Xのリン酸緩衝生理食塩水（FBS / PBS）中の10％熱不活性化ウシ胎児血清の少なくとも20ミリリットルを準備します。 </li><li>ヘパリンナトリウム塩（300単位）の1つのバイアルにFBS / PBSを1ml加えます。 </li><li>選択した魚の体の50％以上で腫瘍を保有する、またはこれらの魚は困難食べたり水泳を持ちます。トリカインまたは氷水浸漬することによって、それらを過剰投与により、魚を生け贄に捧げます。鰓の動きや心拍の欠如aで死亡を確認。 </li><li>魚の頭を削除するためにカミソリの刃を使用してください。 </li><li>余分な赤血球を除去するためにヘパリン溶液で魚の空洞を洗います。 <ol><li>ピペットを使用して、魚の体腔内に（ステップ1.3.2で調製した）ヘパリン溶液の100μLを注入します。こぼれ全ての液体を除去（これは血液細胞を含有する）および1.5mLのマイクロ遠心チューブにそれをピペット。 </li><li>再び体を洗うために、新鮮なピペットチップを使用してください。少なくとも3回の洗浄を行い、またはこぼれた液体は、BLの自由が表示されるまでおお</li><li>それ以上の分析には使用されないので、ステップ1.3.5.1および1.3.5.2の洗浄液からすべての液体を捨てる。 </li></ol></li><li>白血病細胞を収集する。 <ol><li> 100μLのFBS / PBSを魚の体腔に注入する。 </li><li>ピペットチップで魚の体の外側に穏やかな圧力をかけて、腫瘍細胞を絞る/押し出す。 注：このステップが解剖顕微鏡を使用して実行される場合、体腔から流出する腫瘍細胞が明らかになります。 </li><li>各洗浄液から1.5 mLのマイクロ遠心チューブに液体と細胞を集める。 </li><li>大部分の腫瘍細胞が採取されるまで（通常5〜10回）、ステップ1.3.6.1〜1.3.6.3を繰り返す。すべての腫瘍細胞を同じ1.5mLマイクロ遠心チューブに集める。細胞を室温に保つ。 </li></ol></li><li>穏やかにピペッティングすることにより、収集した腫瘍細胞をステップ1.3.6から混合し、細胞の塊を解離させる。細胞懸濁液を4つの0μmメッシュフィルター。 100μLのFBS / PBSでフィルターを1〜2回洗浄する。細胞を室温に保つ。 </li><li> 2μLの細胞懸濁液を18μLのトリパンブルー（0.4％、1:10に希釈して濾過したもの）と新しいチューブで混合する。血球計算器に10μLをロードし、生存（非青色）蛍光細胞の数を数えて、単離した腫瘍細胞の数を計算する。 注：非青色のGFP陰性細胞は、正常で非悪性のT細胞である可能性が高く、計数すべきではありません。 Hoechst 33342で細胞を染色するためには、少なくとも2×10 6個の細胞が必要である。 </li></ol></li></ol> Hoechst 33342を用いて蛍光標識したT-ALL細胞を染色し、側方集団を同定する。 <ol><li> Hoechst 33342 1:10をヌクレアーゼフリーのH 2 Oで希釈して、1mg / mLの作業濃度にする。 4℃および暗所で色素を保存する。 </li><li> 1 mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に49.1 mgを溶解して、ベラパミルの100 mM溶液を調製する。 注：ベラパミルはABCトランスポーターの阻害剤であり、側方集団実験の重要なコントロールである。サンプルにベラパミルを添加すると、Hoechst 33342色素を流出させるABCトランスポーターの能力が阻害される。したがって、ベラパミルをサンプルに添加すると、真の人口は消滅します。 </li><li>水浴を28℃に設定する。 </li><li>蛍光活性化セルソーター（FACS）チューブに細胞と溶液を加えることによって、暗所でサンプルとコントロールを準備します。 <ol><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、DMSO 2.5μLを加えてサンプルを調製します。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 </li><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、100 mMベラパミル2.5μLを加えてコントロールを調製する。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 注：少なくとも10 6細胞/サンプルが推奨されますが、より多くの細胞を染色することが推奨されます。特に、イオンセルは、さらなる分析のためにソートされます。 10個の6細胞/ mLを超え、及び15μgの/ mLのヘキスト33342濃度を維持しません。 10×10 6個の細胞が染色される場合、総反応容量は10 mLです。 </li></ol></li><li> 120分間、暗所で28℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、直ちに氷上に細胞を配置し、暗所に保管してください。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLで洗浄します。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLに細胞を再懸濁。 </li><li>細胞選別まで4℃で保管してください。 </li><li> 15分前に、ソーティング、細胞FBS / PBS（最終濃度を2μg/ ml）を各1 mLのヨウ化プロピジウム（PI）ストック（1mg / ml）の2μLを追加します。よく混ぜます。 </li></ol> 3. FACS蛍光標識T-ALL細胞集団内のサイドポピュレーションを検索します<ol><li&gt;染色されたゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を、Hoechst 33342色素励起用のUVレーザーとPI励起用の488nmレーザーとGFP + T-ALL細胞の検出用のセルソーターで分析する。 </li><li>生きたGFP + T-ALL細胞のゲートを決定する。 <ol><li>破片をゲートアウトするには、前方散乱（FSC）およびサイド散乱（SSC）領域を使用します。 注記：FSCはセルサイズを区別するために使用され、SSCはセルの細分性を区別するために使用されます。 </li><li>二重線を識別するためにFSCおよびSSC幅を使用する。 注：フローサイトメーターの検出器で識別される3つの成分、面積、高さ、幅があります。面積は、典型的には、細胞の蛍光を測定するために使用される。幅は飛行時間を測定し、2つの細胞が一緒に凝集する場合、幅は2倍になります。 </li><li>生存腫瘍細胞については、適切な検出器（ 例えば 、GFPの場合はFITC、PIの場合はPerCP Cy5-5）を使用して、GFP陽性細胞およびPI陰性細胞の周囲にゲートを描く。 </li></ol></li><li&gt;生細胞のゲートで、Hoechst BlueおよびHoechst Redバンドパスフィルター（それぞれ450/50および670/30）を介してHoechst 33342蛍光を測定します。 注：サイドポピュレーションが存在する場合は、これが設定された後に明らかになります。重要なことに、側方集団は、本当の側方集団とみなされるためには、ベラパミル対照において消失しなければならない。 </li><li>さらなる実験のために側方集団細胞を選別する場合は、大きなノズル先端（100μm）を使用し、3mLの100％FBSを含むFACSチューブに細胞を集める。選別後の細胞の生存率を向上させるには、より小さなチップ（70μm）ではなく、より大きなノズルチップ（100μm）を使用してください。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはありません。

側方集団検定は非常に感度が高い。したがって、プロトコールのわずかな変更は、側方集団細胞を検出することを困難にする可能性がある。第1に、染色工程中の温度は、各動物/細胞系に特異的である。哺乳動物系では、側方集団検定は典型的には37℃で実施される 。ゼブラフィッシュT-ALL細胞を37℃でインキュベートすると、多くの細胞が死んだため、このインキュベーション温度は許容できませんでした（データは示さず）。 Kobayashiら（2008）が側方集団検定のためにゼブラフィッシュ腎臓骨髄を切開したとき、25℃でインキュベーションを行った5 。このインキュベーション温度は、弱いHoechst 33342プロファイル（データ示さず）を生じたので、ゼブラフィッシュT-ALL細胞には十分ではなかった。ここに記載されたプロトコールでは、細胞生存率を維持し、強いHoechst 33342プロファイルを達成するために、28℃のインキュベーション温度が最適であった。 ヘキスト33342の濃度はできるサイドポピュレー...

側方集団アッセイは、細胞膜上の高レベルのATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質のために、DNA結合色素Hoechst 33342を流出させる組織内の特定の細胞の増強された能力を利用する。 Hoechst 33342色素を流出する細胞は、色素がUVレーザーによって励起された後、二波長フローサイトメトリー分析を用いて同定することができる。このアッセイは、マウス造血幹細胞（HSC） 1を同定するために最初に用いられたが、その後、多くの組織および癌において幹/前駆細胞集団を同定するために使用されている（参考文献2で検討されている）。しかし、細胞の集団のすべてに側面集団があるわけではなく、すべての側面集団が幹/前駆細胞に対して富化されているわけではありません。 ゼブラフィッシュは、ヒトの癌を研究するための強力な脊椎動物遺伝モデルシステムです3,4、伝統的なマウスよりも多くの利点がありますがんのうずき。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精され、光学的に透明であり、遺伝子導入および癌開始および進行を含む病理学的プロセスのインビボでの観察を促進する。今日まで、可能性のある幹細胞または前駆細胞を検出するための側方集団検定は、ゼブラフィッシュの腎臓骨髄にのみ適用され、HSCを同定したが、ゼブラフィッシュ癌モデルではなかった 5,6 。 T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルは、形態学的および遺伝的にヒトT-ALL 7,8,11に類似している。 T-ALLは、ヒトでは小児の10-15％、成人ALLの25％を占める攻撃的悪性腫瘍である9 。 T-ALLの治療が改善されたが、再発は依然として一般的であり、予後不良と関連している。 T-ALL腫瘍は異種遺伝子であるOUとは、白血病開始細胞（低所得国）を含む多くの異なる腫瘍細胞の亜集団を含みます。低所得国は、単一細胞から腫瘍全体を再成長する能力によって定義され、腫瘍細胞集団内で低所得国の周波数は、限界希釈移植アッセイ（LDA）を介して、レシピエントに変化する細胞用量を移植することにより算出することができます。 LDAの実験は低所得国8、10、11の周波数を計算するためにゼブラフィッシュで行われているが、この決意は、後知恵で作られており、低所得国の将来の分離を可能にしません。そのため、プロスペクティブにがん幹細胞活性のために濃縮された集団を分離する方法が欠けています。ゼブラフィッシュT-オールズからサイドポピュレーション細胞を同定および単離することは、この欠点に対処する第一歩です。 ここで紹介するプロトコルは、効率的にzebrでT-ALL腫瘍を生成する方法について説明しますT-ALL腫瘍細胞を採取し、Hoechst 33342でそれらを染色して、細胞の側面集団を同定する。ゼブラフィッシュT-ALLを用いた将来のin vivo実験には、側方集団細胞がLICに対して富化されているか、または他の幹または前駆体様の特性を有するかどうかが含まれ得る。

<table><tbody><tr><td>同系ゼブラフィッシュ (CG2)</td><td></td><td></td><td>See Mizgireuv et al., 2006</td></tr><tr><td>rag2:c-myc plasmid</td><td></td><td></td><td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>rag2 promoter from Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>pCS2-transposase plasmid</td><td></td><td></td><td>Chien実験室</td></tr><tr><td>用NotI-HF制限酵素</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>R3189S</td><td>500ユニット(25インチ)マイクロ。L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25</td></tr>反応 <tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V8 顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>デジタルマイクロインジェクター</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>真鍮製ストレートアームニードルホルダー</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>マグネットベース&スタンド</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重国際</td><td>MN153</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管Sutter</td><td>Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td>フィラメントなし 10 cm</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウン マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーピペットチップ</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>P0290</td><td>0.5% 濃度 100 mL</td></tr><tr><td>プラスチック トランスファー ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>137119D</td><td>目盛り付き 7.5 mL 球根</td></tr><tr><td>トリカイン メタンスルホン酸 (MS-222)</td><td>ウエスタン ケミカル インク</td><td>フィッシャーサイエンティフィック - NC0342409</td><td>100 g</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 単位バイアル</td></tr><tr><td>40 & マイクロ;mメッシュフィルター</td><td>ファルコン コーニング ブランド</td><td>352340</td><td>50</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>T8154</td><td>20 mL - 溶液 (0.4%)</td></tr> <tr><td>ヘキスト 33342</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ H3570</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>ベラパミル</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>シグマライフサイエンス</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化物</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ P3566</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>FACSAria Fusion セルソーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュのmyc誘導性t細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

異種細胞集団は、健常又は悪性のいずれかの組織から、DNA結合色素を流出する差動能力によって特徴づけられる細胞の集団を含んでいてもよいヘキスト33342細胞のこの「サイドポピュレーション」は、ヘキスト33342の後にフローサイトメトリー法を用いて同定することができます染料は、紫外線（UV）レーザによって励起されます。多くの細胞型のサイドポピュレーションは、ステムまたは前駆細胞様細胞が含まれています。しかし、全ての細胞型は、識別可能なサイドの人口を持っていません。 ゼブラフィッシュ 、ゼブラフィッシュは、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL） のin vivoモデルで堅牢なを持っているが、これらのゼブラフィッシュT-オールズは、サイドポピュレーションを持っているかどうかは不明です。ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュのT-ALLにおけるサイドポピュレーション細胞を単離する方法について説明します。開始するには、ゼブラフィッシュにおけるT-ALLは1細胞期胚にTOL2プラスミドのマイクロインジェクションを介して生成されます。腫瘍は、彼らがより多くのANIの半分以上に拡大した段階まで成長したらT-ALL細胞を回収することができる。次いで、細胞をHoechst 33342で染色し、側面集団細胞についてフローサイトメトリーにより検査する。この方法は、ゼブラフィッシュのT-ALL研究において幅広い用途を有する。ゼブラフィッシュには、これらの側方集団細胞が癌幹細胞様であるかどうかを確認する既知の細胞表面マーカーは存在しないが、 in vivo機能性移植アッセイが可能である。さらに、これらの側方集団細胞の遺伝的特徴を同定するために、単一細胞トランスクリプトミクスを適用することができる。

ゼブラフィッシュで蛍光myc誘導T-ALL腫瘍を効率的に生成するために、tol2トランスポザーゼ部位に隣接する環状DNA構築物をtol2 RNAと同時注入することができる。線状化DNAのゼブラフィッシュ胚への注射からの以前の研究は、5％のトランスジェネシス速度を報告している8 。プロトコールをtol2媒介性の遺伝子導入を含むように調整することにより、10〜44％の範囲の遺伝子導入率が観察され得る（ 表1 ）。 代表例では、GFP + T-ALLを有する魚をHoechst 33342で染色し、側方集団における細胞の割合を決定した。 図1は、側方集団細胞のパーセンテージを決定するために使用されるゲーティングスキームを示す。まず、FSCおよびSSCを用いて、T-ALL細胞を破片（ 図1A ）を排除し、続いてダブ...

ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

この手順の全体的な目的は、myc誘導性T細胞急性リンパ性白血病のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離することである。サイドポピュレーションアッセイは、多くの正常組織および癌組織において、幹細胞および前駆細胞集団を特定するために用いられてきた。しかし、ゼブラフィッシュの癌モデルに適用された例はまだない。この手法の主な利点は、がん幹細胞活性が濃縮されている可能性のあるゼブラフィッシュT-ALLの細胞集団を前向きに単離できることです。ここで述べる方法は、ゼブラフィッシュの白血病研究に幅広く応用できますが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュ細胞型にも適用できる可能性があります。この方法に不慣れな方は、わずかな変化に敏感な手法であるため、習得に苦労するかもしれません。この方法は単純に見えますが、テストする細胞型ごとに最適化が必要です。0.9x PBSで10%の熱不活化FBSを20 milliliters調製します。抗凝固剤を300 units含むヘパリンナトリウム塩のバイアルに、FBS/PBS溶液を1 milliliter加えます。次に、エピ蛍光顕微鏡を用いて、腫瘍細胞が体の50%に浸潤している個体、または摂餌や遊泳に困難があることが確認された個体を選択します。個体を1〜2 mg/mLのトリカインを含む魚用飼育水に移動させ、安楽死させます。鰓の動きと心拍を確認し、安楽死が完了したことを確認してください。魚の頭部を除去した後、ピペットを用いてヘパリン溶液 100 µL を体腔内に注入し、過剰な赤血球を除去します。流れ出した液体をすべて吸引し、1.5 mL マイクロ遠心チューブに分注します。次に、新しいピペットチップを使用して、洗浄液に血液が含まれなくなるまで体腔内をさらに2回洗浄し、すべての洗浄工程で回収した液体は廃棄します。白血病細胞を回収するため、あらかじめ洗浄した体腔に100 µLのFBS/PBS溶液を注入します。解剖顕微鏡下で、ピペットチップを用いて魚の体に軽く圧力をかけ、腫瘍細胞を押し出します。放出された液体を1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。ほとんどの腫瘍細胞が回収されるまで、分離を繰り返します。すべての細胞を同じ1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに回収し、得られた懸濁液を室温で保持します。その後、分離した腫瘍細胞を緩やかにピペッティングして混ぜ合わせ、細胞の凝集を解消します。細胞懸濁液を40 µmのメッシュフィルターでろ過します。次に、フィルターを100 µLのFBS/PBSで1〜2回洗浄します。ろ過後、細胞は室温で保持してください。最後に、新しいチューブで、細胞懸濁液2 µLと0.04%滅菌トリパンブルー溶液18 µLを混合します。得られた懸濁液10 µLをヘモサイトメーターにロードし、生存している蛍光腫瘍細胞をカウントします。T-ALL細胞のクリーンなサンプルを回収することが重要です。ここで使用するHoechst 33342の濃度は、回収した生存腫瘍細胞数に基づいています。その他の細胞碎片や非腫瘍細胞がアッセイを妨害する可能性があります。細胞染色前に、Hoechst染料をヌクレアーゼフリー水で希釈し、1 mg/mLの作業溶液を調製してください。調製した溶液をアルミホイルで遮光し、4°Cで保存します。次に、49.1 mgのverapamilを1 mLのDMSOに溶解し、100 µMの阻害剤溶液を得ます。続いて、FBS/PBS、2.5 µLのDMSO、1 mg/mLのHoechst染料 15 µL、および10⁶個の腫瘍細胞をファラックスチューブに加え、最終容量を1 mLとしてサンプルを調製します。コントロールを調製するには、FBS/PBSに、100 mMのベラパミルを2.5 µL、1 mg/mLのHoechst染料を15 µL加え、10⁶個の腫瘍細胞を加えて最終容量を1 mLにします。サンプルとコントロールを28 °Cのウォーターバス中で、遮光して120分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちに細胞を氷上に置き、遮光状態で保持してください。細胞を4°C、300 ×gで6分間遠心分離します。次に、上清を除去し、1 mLのFBS/PBSで細胞を洗浄します。再度、細胞を4°C、300 ×gで6分間遠心分離します。細胞をペレットした後、上清を除去し、1 mLのFBS/PBSで細胞を再懸濁します。細胞ソーティングまで、サンプルを4 °Cで保存してください。細胞ソーティングの15分前に、細胞懸濁液1 mLあたり2 µLの1 mg/mLプロピジウムヨードストック溶液を添加します。次に、サンプルを十分にボルテックスします。染色したゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分取装置）を用いて分析します。Hoechst染料の分析にはUVレーザーを、プロピジウムイオジドまたはGFP陽性T-ALL細胞の検出には488 nanometerレーザーを使用して、サンプルを励起させます。使用する細胞株ごとに、細胞数、染料濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。また、これらの各条件を変更すると、アッセイの結果が劇的に変わる可能性があります。ゼブラフィッシュから単離したT-ALL細胞の中からサイドポピュレーションを同定するために、まず細胞の残骸や細胞の凝集塊を除外します。次に、単一の細胞集団におけるプロピジウムヨードの取り込みとGFPの発現を解析し、生存している腫瘍細胞を特定します。サイドポピュレーションを可視化するために、Hoechst染料の青色および赤色の発光を比較します。サイドポピュレーションは、主要な細胞集団の左側から青色蛍光軸に向かって伸びる、低輝度の細胞のテールとして現れます。ここでは、2つの異なる腫瘍細胞サンプルに対して実施されたサイドポピュレーション解析の結果を示します。両方の検体においてサイドポピュレーションが同定されました。しかし、腫瘍サンプルによって、サイドポピュレーション細胞の数には差が見られました。解析した腫瘍サンプルの種類にかかわらず、エフラックス阻害剤であるベラパミルでサンプルを処理すると、 previously identified cells で観察されたシグナルが消失し、サイドポピュレーション（side population）表現型であることがさらに確認されました。一度習得すれば、ゼブラフィッシュT-ALLにおけるサイドポピュレーション法は、本稿で示した通りに適切に実施すれば4時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、培養温度や時間、染料濃度、エフラックス阻害剤など、ゼブラフィッシュT-ALLに向けて最適化されたステップを留意することが重要です。これらは、異なる実験系に合わせて変更する必要がある場合があります。この手順に続き、RNA抽出やin vivo移植アッセイなどの他の手法を、ソートしたサイドポピュレーション細胞を用いて実施することで、サイドポピュレーション細胞の機能性や遺伝子調節に関する課題を検討することができます。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュのT細胞急性リンパ性白血病からサイドポピュレーション細胞を分離する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団細胞の単離法。がん幹細胞活性を含む細胞集団を前向きに単離し、ゼブラフィッシュがん研究への応用可能性を示す。

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

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