ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

この手順の全体的な目的は、myc誘導性T細胞急性リンパ性白血病のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離することである。サイドポピュレーションアッセイは、多くの正常組織および癌組織において、幹細胞および前駆細胞集団を特定するために用いられてきた。しかし、ゼブラフィッシュの癌モデルに適用された例はまだない。

この手法の主な利点は、がん幹細胞活性が濃縮されている可能性のあるゼブラフィッシュT-ALLの細胞集団を前向きに単離できることです。ここで述べる方法は、ゼブラフィッシュの白血病研究に幅広く応用できますが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュ細胞型にも適用できる可能性があります。この方法に不慣れな方は、わずかな変化に敏感な手法であるため、習得に苦労するかもしれません。

この方法は単純に見えますが、テストする細胞型ごとに最適化が必要です。0.9x PBSで10%の熱不活化FBSを20 milliliters調製します。抗凝固剤を300 units含むヘパリンナトリウム塩のバイアルに、FBS/PBS溶液を1 milliliter加えます。

次に、エピ蛍光顕微鏡を用いて、腫瘍細胞が体の50%に浸潤している個体、または摂餌や遊泳に困難があることが確認された個体を選択します。個体を1〜2 mg/mLのトリカインを含む魚用飼育水に移動させ、安楽死させます。鰓の動きと心拍を確認し、安楽死が完了したことを確認してください。

魚の頭部を除去した後、ピペットを用いてヘパリン溶液 100 µL を体腔内に注入し、過剰な赤血球を除去します。流れ出した液体をすべて吸引し、1.5 mL マイクロ遠心チューブに分注します。次に、新しいピペットチップを使用して、洗浄液に血液が含まれなくなるまで体腔内をさらに2回洗浄し、すべての洗浄工程で回収した液体は廃棄します。

白血病細胞を回収するため、あらかじめ洗浄した体腔に100 µLのFBS/PBS溶液を注入します。解剖顕微鏡下で、ピペットチップを用いて魚の体に軽く圧力をかけ、腫瘍細胞を押し出します。放出された液体を1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。

ほとんどの腫瘍細胞が回収されるまで、分離を繰り返します。すべての細胞を同じ1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに回収し、得られた懸濁液を室温で保持します。その後、分離した腫瘍細胞を緩やかにピペッティングして混ぜ合わせ、細胞の凝集を解消します。

細胞懸濁液を40 µmのメッシュフィルターでろ過します。次に、フィルターを100 µLのFBS/PBSで1〜2回洗浄します。ろ過後、細胞は室温で保持してください。

最後に、新しいチューブで、細胞懸濁液2 µLと0.04%滅菌トリパンブルー溶液18 µLを混合します。得られた懸濁液10 µLをヘモサイトメーターにロードし、生存している蛍光腫瘍細胞をカウントします。T-ALL細胞のクリーンなサンプルを回収することが重要です。

ここで使用するHoechst 33342の濃度は、回収した生存腫瘍細胞数に基づいています。その他の細胞碎片や非腫瘍細胞がアッセイを妨害する可能性があります。細胞染色前に、Hoechst染料をヌクレアーゼフリー水で希釈し、1 mg/mLの作業溶液を調製してください。

調製した溶液をアルミホイルで遮光し、4°Cで保存します。次に、49.1 mgのverapamilを1 mLのDMSOに溶解し、100 µMの阻害剤溶液を得ます。続いて、FBS/PBS、2.5 µLのDMSO、1 mg/mLのHoechst染料 15 µL、および10⁶個の腫瘍細胞をファラックスチューブに加え、最終容量を1 mLとしてサンプルを調製します。

コントロールを調製するには、FBS/PBSに、100 mMのベラパミルを2.5 µL、1 mg/mLのHoechst染料を15 µL加え、10⁶個の腫瘍細胞を加えて最終容量を1 mLにします。サンプルとコントロールを28 °Cのウォーターバス中で、遮光して120分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちに細胞を氷上に置き、遮光状態で保持してください。

細胞を4°C、300 ×gで6分間遠心分離します。次に、上清を除去し、1 mLのFBS/PBSで細胞を洗浄します。再度、細胞を4°C、300 ×gで6分間遠心分離します。

細胞をペレットした後、上清を除去し、1 mLのFBS/PBSで細胞を再懸濁します。細胞ソーティングまで、サンプルを4 °Cで保存してください。細胞ソーティングの15分前に、細胞懸濁液1 mLあたり2 µLの1 mg/mLプロピジウムヨードストック溶液を添加します。

次に、サンプルを十分にボルテックスします。染色したゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分取装置）を用いて分析します。Hoechst染料の分析にはUVレーザーを、プロピジウムイオジドまたはGFP陽性T-ALL細胞の検出には488 nanometerレーザーを使用して、サンプルを励起させます。

使用する細胞株ごとに、細胞数、染料濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。また、これらの各条件を変更すると、アッセイの結果が劇的に変わる可能性があります。ゼブラフィッシュから単離したT-ALL細胞の中からサイドポピュレーションを同定するために、まず細胞の残骸や細胞の凝集塊を除外します。

次に、単一の細胞集団におけるプロピジウムヨードの取り込みとGFPの発現を解析し、生存している腫瘍細胞を特定します。サイドポピュレーションを可視化するために、Hoechst染料の青色および赤色の発光を比較します。サイドポピュレーションは、主要な細胞集団の左側から青色蛍光軸に向かって伸びる、低輝度の細胞のテールとして現れます。

ここでは、2つの異なる腫瘍細胞サンプルに対して実施されたサイドポピュレーション解析の結果を示します。両方の検体においてサイドポピュレーションが同定されました。しかし、腫瘍サンプルによって、サイドポピュレーション細胞の数には差が見られました。

解析した腫瘍サンプルの種類にかかわらず、エフラックス阻害剤であるベラパミルでサンプルを処理すると、 previously identified cells で観察されたシグナルが消失し、サイドポピュレーション（side population）表現型であることがさらに確認されました。一度習得すれば、ゼブラフィッシュT-ALLにおけるサイドポピュレーション法は、本稿で示した通りに適切に実施すれば4時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、培養温度や時間、染料濃度、エフラックス阻害剤など、ゼブラフィッシュT-ALLに向けて最適化されたステップを留意することが重要です。

これらは、異なる実験系に合わせて変更する必要がある場合があります。この手順に続き、RNA抽出やin vivo移植アッセイなどの他の手法を、ソートしたサイドポピュレーション細胞を用いて実施することで、サイドポピュレーション細胞の機能性や遺伝子調節に関する課題を検討することができます。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュのT細胞急性リンパ性白血病からサイドポピュレーション細胞を分離する方法について、十分に理解できるはずです。