末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

この手順の全体的な目標は、ヒト末梢血由来の人工多能性幹細胞(IPS細胞)から軟骨形成系譜細胞を生成することです。この方法は、軟骨修復のためのIPS細胞の生成のために、患者由来の末梢血細胞をC細胞として使用することに関する軟骨再生分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再現性が容易であることと、軟骨細胞の分化が血清およびゼノフリーの条件で起こることです。

まず、4ミリリットルのヒトIPSC培地にヒトIPS細胞を、照射したマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞の単層を含む60ミリメートルの組織培養皿にプレーティングします。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で培養します。幹細胞が80〜90%コンフルエントになったら、細胞をdispace溶液で解離して継代培養します。

2〜3回の継代後、火で引かれたガラス針を使用して、80〜90%のコンフルエントな未分化IPSCコロニーをより小さな断片に解剖し、100個以下の細胞培養片を10ミリリットルの胚様体形成培地を含む新しい非接着性の100ミリメートルペトリ皿に移します。機械的解離は、新しい培養容器に移される細胞の小さな断片への細胞損傷を減らし、ヒトIPS細胞の分化を抑制するフィーダー細胞の手動廃棄を発表するため、自動消化よりも優れています。ヒトIPS細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。

2日後、皿を傾けて胚様体が落ち着くまで置き、3ミリリットルの胚様体形成培地を4ミリリットルの新鮮な基礎培養培地と慎重に交換します。10日後、胚様体が形成されます。新しい100ミリ皿に4ミリリットルの0.1パーセントゼラチンを37°Cで30分間コーティングします。

上清を含む胚体を15ミリリットルの円錐管に移し、体を4〜5分間落ち着かせます。最後の0.5ミリリットルの培地を除くすべての培地を吸引し、胚体を10ミリリットルの新鮮な基礎培養培地に再懸濁します。ゼラチンが固まったら、ゼラチンを捨てます。

次に、ゼラチンでコーティングされた皿に細胞を播種し、皿を細胞培養インキュベーターに入れます。培養で10日後、胚様体は線維芽細胞増殖に分化します。軟骨細胞の分化を誘導するには、培養物をDPBSで洗浄し、0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルで摂氏37度で5分間細胞を剥離します。

細胞がプレートの底部から浮き上がったら、4ミリリットルの新鮮な基礎培養液で反応を中和し、培養物を5〜10回穏やかに滴定します。70ミクロンのナイロンメッシュストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、遠心分離により細胞を回収します。次に、10ミリリットルの新鮮な基礎培養培地にゼラチンコーティングした新しい100mmプレートに細胞を播種します。

培養物が90〜100%のコンフルエンシーに達すると、カウントのために示したように、0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルで細胞を収穫します。細胞の3倍から5番目のアリコートに15ミリリットルのポリプロピレンチューブを移し、遠心分離します。そして、ペレットを1ミリリットルの軟骨形成分化培地に再懸濁します。

その後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを乱さずにチューブを細胞培養インキュベーターに21日間入れます。軟骨形成細胞はin vitroで集合し、高密度培養条件下では特徴的な細胞外指標を産生します。培養で21日後、ヒトIPS細胞軟骨形成ペレットが形成されます。

21日間の培養後、ヒトIPSC軟骨形成細胞は青色染色でアルシアンブルーおよびトルイジンに陽性であり、HIPSCペレットの軟骨形成分化が成功したことを示しています。コラーゲン2とコラーゲン10の免疫組織化学分析により、それらの軟骨細胞様表現型がさらに確認されました。硫酸化グリコサミノグリカン解析の結果、ヒトIPSC軟骨形成ペレットでは、ヒトIPSC線維芽細胞様細胞、胚様体、未分化ヒトIPS細胞と比較して、細胞の硫酸化グリコサミノグリカン含量が有意にアップレギュレーションされていることが明らかになりました。

さらに、ヒトIPSC軟骨形成細胞は、軟骨形成細胞系譜および完全分化型軟骨細胞マーカーの遺伝子発現レベルが高いことを示し、軟骨形成形成の達成が成功したことを示唆しています。EB形成による自然分化、EBからの細胞増殖、細胞培養後の単層細胞培養、3Dペレット培養など、ヒトIPSCを軟骨細胞に分化するための多段階培養法です。軟骨細胞の表現型は、組織学的分析、生化学的分析、および軟骨形成遺伝子発現によって評価されます。

このビデオを見れば、ヒトIPS細胞の軟骨細胞への分化誘導のためのマルチステップ培養法の使用方法を十分に理解できるはずです。この手法は、より患者固有で費用対効果が高い可能性があります。