Name: 末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ末梢血由来iPS細胞から軟骨細胞への分化プロトコル。無血清・無異種条件下で21日間の3Dペレット培養により、コラーゲンII型・X型発現や硫酸化グリコサミノグリカン産生を確認。患者特異的な軟骨再生医療への応用が期待される再現性の高い手法です。

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著者らは彼のプラスミドについてXiaobin Zhangに感謝したい。私たちはまた、実験中に彼らの親切な助けをしてくれたShaorong GaoとQianfei Wangにも感謝します。この研究は、中国国立自然科学財団（No.81101346,81271963,81100331）、北京215高水準人材養成プロジェクト（No.2014-3-025）、北京チャオヤン病院基金（No CYXX-2017-01）、中国科学アカデミー青年イノベーション推進協会（YL）

PBCsからhiPSCを生成するためのプロトコールは、我々の以前の研究5に見出すことができる。この研究は、私たちの機関の機関審査委員会によって承認されました。 1.胚様体（EB）形成<ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、2mM L-メルカプトエタノール、2mM L-メチオニン、および2mM LPSを補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） - グルタミン、および8ng / mL塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。 </li><li> 50mLのEB形成培地を調製する：15％KSR、5％FBS、1x非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを添加したDMEM。 </li><li> 20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充した基礎培地50mLを調製する。 </li><li>ディスパーゼ溶液10 mLをノックアウトDMEMで1 mg / mLに調製する。 </li><li>カルチュフィーダー細胞（ すなわち、照射されたマウス胚線維芽細胞の単層）を有する60mm組織培養皿上に再平滑化した。細胞が80〜90％コンフルエントである場合、細胞をディスパーゼで解離させ、4〜5日ごとにhiPSCs1：3を通過させる。 37℃および5％CO 2インキュベーターに細胞を入れる。 </li><li> iPSCsが80〜90％コンフルエントである場合、未分化hIPSCコロニーを火で引かれたガラス針を用いてより小さな断片（直径約50〜100μm）に解剖する。一般に、100mmのペトリ皿にEBを生成するために60mmの皿にhiPSCコロニーを使用します。 <ol><li> 10mLのEB形成培地を含む100mmの付着していないペトリ皿に100個未満の小さなコロニーを培養する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。 </li></ol></li><li>初期培地の約25％を2日ごとに等量の基礎培地に交換する。 EBを落ち着かせるためにディッシュを傾けます。注意深く3 mL新鮮な基礎培地4 mLを添加する。 EBを邪魔しないでください。 注：EBは、コロニーの断片によって形態学的に特徴付けられ、顕微鏡下で滑らかな境界を有する丸い外観をとる。 </li><li>非粘着性のペトリ皿で10日間培養した後、使用前に37℃で30分間、4℃の0.1％ゼラチンで新しい100mm組織培養皿をコーティングする。 </li><li>培地とEBを100 mmの付着していないペトリ皿から15 mLコニカルチューブに移す。 EBを4〜5分間沈降させる。上清を注意深く吸引し、培地+ EBの0.5 mL未満を残す</li><li> 10mLの基礎培地を含む100mmのゼラチン被覆組織培養皿上に100個未満のEBを種子に接種する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。 </li></ol>細胞ペレット形成および軟骨細胞分化<ol><li> 0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）10 mLを調製する。 basの80 MLを作るα培養培地：20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充したDMEM。 </li><li> 10％インスリントランスフェリンセレン溶液（ITS）、0.1μMデキサメタゾン、1mMアスコルビン酸、1％ピルビン酸ナトリウム、および10ng / mLのトランスフォーミング増殖因子 - セレン溶液を補充したDMEM（高グルコース） β1（TGF-β1）である。 </li><li> 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。 注：培養10日後、線維芽細胞の細胞の伸長はEBから拡大しているはずです。 <ol><li>使用前に、100 mmディッシュを4 mlの0.1％ゼラチンで30分間37℃でコートします。細胞上清を捨て、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で一度洗浄する。 </li><li>細胞を37℃で5分間0.25％トリプシン/ EDTA 3 mLで消化し、4 mで中和するLの基礎培地を含む。 </li></ol></li><li> 5〜10回上下にピペッティングし、70μmナイロンメッシュに通すことにより、細胞を単一細胞に解離させる。細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離する。新しい100mmゼラチンコート組織培養皿に細胞を基礎培地10mLで再播種する。 </li><li> 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。 注：細胞は、均一な線維芽細胞様形態を獲得する。 </li><li> 約90〜100％のコンフルエンスに達したら（ すなわち、約5〜7日）、細胞を37℃で0.25％トリプシン/ EDTA 3mLで5分間採取する。基本培地4 mLで中和する。ピペットで5回上下させることにより、細胞を単一の細胞に解離させる。血球計算盤を使用して細胞数を数えます。 <ol><li> 15mLポリプロピレンチューブに3×10 5個の細胞を入れる。 200 xgで遠心分離機室温（RT）で5分間インキュベートする。 1mLの軟骨形成分化培地で細胞を再懸濁する。 </li></ol></li><li>細胞を300xgで3分間再遠心分離し、小さなペレット形態で細胞を維持する。チューブを37℃および5％CO 2インキュベーターに21日間入れる。蓋をしっかり締めてガス交換をしないでください。 </li><li>新鮮な軟骨形成分化培地で3日ごとに培地の3/4を交換する。 注：培養21日後、hiPSC-軟骨形成ペレット（hiPSC-Chon）が形成されているはずである。陽性対照としてのヒト間葉系幹細胞（MSC）も回収し、軟骨形成性分化培地で21日間培養し、軟骨形成性ペレット（hMSC-Chon）を形成する。 </li></ol> 3.軟骨分化の解析<ol><li> 10％中性緩衝ホルマリン10 mLを調製する。 </li><li> 50mLの0.1％アルシアンブルー試薬と50mLの1％トルイジンブルー試薬を調製する。 </li><li> Pr一次抗体：コラーゲンII（1:50）に対するウサギポリクローナル抗体またはコラーゲンX（1:50）に対するマウスモノクローナル抗体の1mLを発現させる。また、抗ウサギまたはマウス二次抗体を調製する。 </li><li> 1mLのパパイン溶液を調製する：0.1M酢酸ナトリウム、2.4mM EDTA、および5mM L-システインを含むPBS中10U / mL。 </li><li> 100ミリリットルのジメチルメチレンブルー（DMMB）染料溶液を調製する：100μLの16mg / Lの1,9-ジメチルメチレンブルー、40mMのグリシン、40mMのNaCl、および9.5mMのHCl; pH3.0。 </li><li> ペレット切片のアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色による軟骨形成分化を評価する。 <ol><li> 1mLの10％中性緩衝ホルマリン中で24時間、1つのhiPSC-ChonペレットまたはhMSC-Chonペレットを固定する。 </li><li>ペレットをH 2 O中の70％エタノール1mLに移す。ペレットを1mLの段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100および100％、それぞれ3分間）で脱水する。 </li><li>ペレットを1％100％キシレンで3回洗浄する。侵入者ペレットを65℃のオーブン中でパラフィンで1時間処理する。通常の組織学的手順6に従って、ペレットをパラフィンブロックに7×7×5mm 3ベース金型で埋め込む。6 。 </li><li>約4μmの厚さのミクロトームで隣接する切片を作る7 。セクションをスライドガラスに貼り付けます。 </li><li>スライドを60℃で2時間オーブンで乾燥する。 100％キシレンを用いて3サイクル（各3分）で切片を脱パラフィンする。 </li><li>再水和（ すなわち、 H 2 O中100,100,95,95,70,50、および25％、それぞれ3分間）のために減少するアルコール系列を使用し、次いで5分間脱イオン水で最終的なすすぎを行う。 </li><li> 0.1％アルシアンブルー試薬または1％トルイジンブルー染色で4〜5時間染色した後、蒸留水ですすいでください。 </li><li>段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100,100％、各3分）で脱水し、続いて3回連続して100％キシレンでの浄化のeps。スライドをマウントし、顕微鏡で視覚化します。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学を行う。 注：追加のペレット切片を免疫組織化学によってさらに評価する。 <ol><li>脱パラフィンおよび再水和後、スライドを1mM EDTA、pH8.0（オートクレーブで沸騰させた水中での防水）中で沸騰させる。それらを沸点以下の温度で8分間放置させ、次にスライドを室温で冷却させる。 </li><li>スライドを脱イオン水で3回すすぐ。切片をメタノール中の3％H 2 O 2溶液に室温で15分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。 </li><li>脱イオン水でスライドをすすぎ、DPBSに5分間浸します。 50-100μLの適切に希釈した（1:50）一次抗体をスライド上の切片に適用し、次にそれらを加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートする。 </li><li> DPBSでスライドを3回（各5分）洗浄する。 saをインキュベートする対応する二次抗体（ すなわち、抗ウサギまたはマウス）と、RTで15分間掛けた。 </li><li> DPBSでスライドを3回（それぞれ5分間）洗浄する。顕微鏡下でDAB検出を行います。 </li><li>スライドをDPBSで3回洗浄する（各2分）。スライドをヘマトキシリン中に1〜2分間浸して細胞核を対比染色する。漸変エタノールシリーズ（25,50,75,90,95,100,100％;各3分）で脱水した後、キシレンで3回連続して清澄化する。最後に、スライドをマウントし、それらを顕微鏡下で視覚化する。 </li></ol></li><li> sGAGコンテンツを検出します。 <ol><li> 60℃で2時間、パパイン溶液中の軟骨形成性のペレットを消化する。 </li><li> dsDNAアッセイキットおよび蛍光光度計システムを使用してDNA含量を決定する。 525 nmの8の吸光度を測定する下DMMB色素溶液と混合することによってのsGAG含量を測定します。 </li><li>標準曲線に対するsGAGの濃度を計算するサメのコンドロイチン硫酸。 </li></ol></li><li> hiPSC-Chonペレット中の軟骨分化マーカーのリアルタイムPCR分析を実施する。 <ol><li> 500μLの氷冷抽出試薬を1本のチューブに加えることにより、同じ軟骨形成性のペレットを3〜4回収穫する。徹底的にボルテックス。サンプルを室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 0.1mLのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間ボルテックスし、室温で3分間インキュベートする。 12,000 xgおよび4℃で15分間サンプルを遠心分離する。上水相（約250μL）を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li> 25μLの酢酸ナトリウムと1μLのグリコーゲンをサンプルに添加する。 250μLのイソプロピルアルコールと混合してRNAを沈殿させます。徹底的に混合する。サンプルを室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 12,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を完全に除去する。 RNAペレットを500μLの75％エタノールで2回洗浄する。 </li><li> 5分間遠心分離する7,500 xgおよび4℃で測定した。残りのエタノールをすべて除去し、RNAペレットを5〜10分間風乾します。 10μLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶解する。 </li><li>逆転写酵素システムを用いてRNAをcDNAに変換する。定量PCRキットマスターミックス（2×）を用いて、リアルタイムPCRおよびリアルタイムPCRシステム9にcDNAサンプルを施します。 注：プライマー配列は次のとおりです。 h AGGRECAN -F：TCGAGGACAGCGAGGCC; h AGGRECAN -R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; hβ-ACTIN -F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; hβ-ACTIN- R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; h COL2- F：TGGACGATCAGGCGAAACC; h COL2- R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT; h SOX9- F：AGCGAACGCACATCAAGAC; h SOX9- R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; h COL10- F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT; h COL10- R：GGTAGTGGGCCTTTATGCCT。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、iPSCを介してPBCから軟骨細胞を生成するためのプロトコールを提供する。 PBCはより一般的であり、臨床分野で広く使用されているので、それらは再プログラムのための潜在的な代替物として提示される。この研究では、エピソームベクター（EV）を用いて、Zhang らによって確立された方法に従って、PBCをiPSCに再プログラムした。 11 。この統合のないアプローチは、臨床分野12、13で幅広い効果を持つと考えられているウイルス関連遺伝毒性を、統合関与しません。この研究における血球からのインテグレーションフリーiPSCsの生成の再プログラミング効率が満足された。末梢血2mLから30個以上のiPSCを作製することができました。したがって、PBCは、軟骨工学および他の臨床応用のためのiPSCを生成するために使用される種細胞である可能性がある。 軟骨形成分化の主要なステップEB形成、E...

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The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

軟骨組織は、自己修復および再生の能力が非常に低い。様々な外科的介入および生物学的処置が、不十分な結果を伴って軟骨および関節機能を回復させるために使用される。最近の幹細胞技術の発展は、軟骨修復領域全体を変化させる可能性がある1 。様々な幹細胞が種細胞として研究されてきたが、拒絶反応を起こさずに多くのタイプの患者特異的細胞を提供することができるため、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）が最も有望な選択肢であるようである2 。さらに、成人細胞の限られた増殖性を克服し、自己複製能および多能性を維持することができる。さらに、特定のタイプの軟骨細胞を得るために遺伝子ターゲティングを用いて遺伝子型を変えることができる。 再プログラミングの可能性も十分に研究されているので、繊維芽細胞はiPSCを生成するために広く使用されている。しかし、患者からの痛みを伴う生検や、線維芽細胞のin vitroでの拡大が必要であり、遺伝子突然変異を引き起こす可能性があるなど、まだ克服しなければならないいくつかの限界が存在する3 。最近、PBCはリプログラミング4にとって有利であることが判明した。さらに、それらは一般に利用され豊富に貯蔵されていた。研究の焦点を皮膚からリダイレクトする可能性があります。しかし、私たちが知る限りでは、軟骨細胞への分化が続くPBCの再プログラミングに関する報告はほとんどありません。 現在の研究では、軟骨細胞の形成を模倣するために、iPSCをそれらをiPSCに再プログラミングし、次いでペレット培養系を介して軟骨系統に分化させることによって、PBCを代替源として利用する。

<table><tbody><tr><td>ノックアウトDMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>hiPSC培養およびEB形成培地に使用される基礎培地</td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充(KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>hiPSC培養およびEB形成培地に使用される、より明確なFBSフリー培地サプリメント</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>hiPSC培養およびEB形成培地に使用され、細胞に優れた価値を提供します培養</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>細胞増殖と生存率を高めるために、すべての細胞培養培地で増殖サプリメントとして使用され、</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>細胞培養に必要なアミノ酸</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞増殖因子(bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>ヒトiPS細胞の多能性と自己再生の維持に使用されるサイトカイン</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>継代培養のためのhiPSC解離に使用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>MSC培養培地に使用した基礎培地</td></tr><tr><td>0.1%ゼラチン</td><td>ミリポア</td><td>ES-006-B</td><td>皿への細胞付着に使用</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>細胞解離に使用</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>細胞洗浄または試薬の調製に使用されるバランスの取れた塩溶液</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>すべての細胞培養培地で増殖サプリメントとして使用されます。</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>インスリン、トランスフェリン、セレン溶液。軟骨原性分化に使用されます。</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>4403</td><td>ビタミンCとして知られています。それは活発な成長を助け、抗酸化特性を持っています。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>グルコースに加えてエネルギー源として細胞培養培地に添加されます。</td></tr><tr><td>トランスフォーミング成長因子-ベータ1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>細胞の増殖、成長、軟骨形成分化を調節するサイトカイン。</td></tr><tr><td>コラーゲンIIに対するウサギポリクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>この抗体は、軟骨組織に特異的なII型コラーゲンと反応します。</td></tr><tr><td>コラーゲンに対するマウスモノクローナル抗体 X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>この抗体は、高トロフィック軟骨細胞の産物であるX型コラーゲンと反応します。</td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-100</td><td>スライドの取り付けおよび長期保存用</td></tr><tr><td>トルイジンブルー</td><td>シグマ</td><td>89640</td><td>プロテオグリカンの検出に使用されます。</td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>アムレスコ</td><td>#0298</td><td>グルコサミノグリカンの検出に使用されます。</td></tr><tr><td>パパイン</td><td>シグマ</td><td>P4762-25MG</td><td>軟骨原性ペレットの消化に使用されます。</td></tr><tr><td>ジメチルメチレンブルー</td><td>シグマ</td><td>341088-1G</td> サメの軟骨からの<td>グリコサミノグリアンコン</td></tr><tr><td>ドロイチン硫酸ナトリウム塩</td>を定量するために使用されます <td>シグマ</td><td>C4384-250MG</td><td>sGAG含有量測定の標準曲線を描くために使用されます。</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HSアッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>DNA含有量の測定に使用</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>細胞からのRNA単離に使用</td></tr><tr><td>逆転写酵素システム</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNAをcDNAに変換するために使用</td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCRキット Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>リアルタイムPCRに使用</td></tr></tbody></table>

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

この研究では、統合された方法で誘導された多能性幹細胞（iPSCs）を介して軟骨細胞を産生するために、末梢血細胞（PBC）を種細胞として使用した。胚様体（EB）形成および線維芽細胞増殖に続いて、iPSCは、無血清および無細胞条件下で21日間軟骨分化のために誘導される。軟骨細胞誘導後、形態学的、免疫組織化学的および生化学的分析、ならびに軟骨形成性分化マーカーの定量的リアルタイムPCR検査によって、細胞の表現型を評価する。軟骨形成性ペレットは、アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色が陽性であることを示す。コラーゲンIIおよびX染色の免疫組織化学も陽性である。硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含量および軟骨分化マーカーCOLLAGEN2 （ COL2 ）、 COLLAGEN10 （ COL10 ）、 SOX9およびAGGRECANは、hiPSCsおよび線維芽細胞と比較して非還元性のペレットが得られた。これらの結果は、PBCを軟骨修復のためのiPSCsを生成するための種細胞として使用することができることを示唆しており、これは患者特異的かつ費用対効果が高い。

hiPSCsの軟骨形成分化： EB形成培地および基礎培地を使用してhiPSCを間葉系統に分化させた。多段階培養法を用いた（ 図1 ）。最初に、hiPSCを10日間EB形成により自発的に分化させた（D10; 図2A ）。第2に、細胞はEBからさらに10日間（D10 + 10）逸脱した。これらの2つのステップの間、iPSCは徐々に元の形態を失い、紡錘形の形態を得た（ 図2B ）。その後、通過後に線維芽細胞の形態に変化した。第3に、継代培養後に細胞を単層で増殖させた（ 図2C ）。残りの未分化細胞は、この工程中に除外した。その後、細胞を増殖させ、線維芽細胞様細胞に曝露した。単層培養で5〜7日間（D10 + 10 + 7）。第...

我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

この手順の全体的な目的は、ヒト末梢血由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）から軟骨系譜細胞を生成することです。この手法は、軟骨修復のためのiPS細胞の生成に、患者由来の末梢血細胞をC細胞として使用することに関する、軟骨再生分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、容易に再現可能であること、および血清不使用かつゼノフリーの条件下で軟骨細胞分化が行われることです。まず、放射線照射したマウス胚性線維芽細胞のフィーダー層を含む60 mm組織培養ディッシュに、ヒトiPS細胞を4 mLのヒトiPSC培地とともに播種します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で培養します。幹細胞が80〜90%コンフルエントになったら、継代のためにDispase溶液を用いて細胞を分散させます。2〜3代の継代後、火炎研磨したガラス針を用いて、80〜90%コンフルエントになった未分化のiPSCコロニーを小さな断片に切り分け、10 mLの胚様体形成培地を含む新しい非接着性100 mmペトリ皿に、100個以下の細胞塊を移します。機械的な解離は、新しい培養容器に移される小断片の細胞へのダメージを軽減し、ヒトiPS細胞の分化を抑制するフィーダー細胞を物理的に除去できるため、自動消化よりも適しています。ヒトiPS細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。2日後、ディッシュを傾けて胚様体を沈殿させ、胚様体形成培地3 mLを、新鮮な基礎培養液4 mLに注意深く置換します。10日後には胚様体が形成されます。新しい100 mmディッシュに0.1%ゼラチン4 mLを加え、37°Cで30分間コーティングします。胚様体を上清とともに15 mLコニカルチューブに移し、4〜5分間静置して沈殿させます。培地を最後の0.5 mLまで吸引除去し、10 mLの新鮮な基礎培養培地で胚様体を再懸濁します。ゼラチンが凝固したら、ゼラチンを廃棄します。次に、細胞をゼラチンコートしたディッシュに播種し、ディッシュを細胞培養インキュベーターに入れます。10日間の培養後、胚様体は線維芽細胞様の細胞外成長へと分化します。軟骨細胞分化を誘導するために、培養物をDPBSで洗浄し、37 °Cで5分間、0.25% trypsin EDTA 3 mLを用いて細胞を剥離させます。細胞がプレート底面から剥離したら、4 mLの新鮮な基礎培地で反応を中和し、緩やかに5～10回ピペッティングします。細胞懸濁液を70 µmのナイロンメッシュストレーナーでろ過し、遠心分離で細胞を回収します。その後、新鮮な基礎培地10 mLを用いて、細胞を新しいゼラチンコート済み100 mmプレートに播種します。培養細胞が90〜100%コンフルエントに達したら、細胞計数の際と同様に、0.25% trypsin EDTA 3 mLを用いて細胞を回収します。3×10⁵個の細胞分画を15 mLポリプロピレンチューブに移し、遠心分離を行います。その後、ペレットを1 mLの軟骨分化誘導培地で再懸濁します。その後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを乱さないように注意して、チューブを細胞培養インキュベーターに21日間置きます。軟骨分化細胞は、高密度培養条件下でin vitroで凝集し、特徴的な細胞外マトリックスを産生することがあります。培養後21日で、ヒトiPS細胞由来の軟骨分化ペレットが形成されます。21日間の培養後、ヒトiPSC軟骨形成細胞はアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色で陽性を示し、hiPSCペレットの軟骨分化が成功したことが示されました。コラーゲンIIおよびコラーゲンXの免疫組織化学的分析により、それらが軟骨細胞様表現型であることがさらに確認されました。硫酸ムコ多糖分析により、ヒトiPSC軟骨形成ペレットにおける硫酸ムコ多糖含有量は、ヒトiPSC線維芽細胞様細胞、胚様体、および未分化ヒトiPS細胞と比較して、有意に上昇していることが明らかになりました。さらに、ヒトiPS細胞由来の軟骨形成細胞は、軟骨前駆細胞系譜および完全に分化した軟骨細胞マーカーの高い遺伝子発現レベルを示しており、軟骨分化が成功したことが示唆されます。ヒトiPS細胞を軟骨細胞へと分化させるために用いられた多段階培養法には、EB形成による自然分化、EBからの細胞出芽、その後の単層細胞培養、および3Dペレット培養が含まれます。軟骨細胞の表現型は、組織学的解析、生化学的解析、および軟骨形成遺伝子の発現によって評価されます。このビデオを視聴することで、ヒトiPS細胞を軟骨細胞へと分化させるための多段階培養法の使用方法について十分に理解することができます。この手法は、より患者特異的で費用対効果の高い手法となる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

機械的ストレスは幹細胞の軟骨分化を誘発し、損傷した軟骨の修復のための潜在的な治療アプローチを提供します。遠心重力(CG)を使用して脂肪由来幹細胞(ASC)の軟骨形成分化を誘導するプロトコルを提示します。CGによるSOX9のアップレギュレーションは、軟骨原性表現型の発症をもたらします。...

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。...

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス...

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

このプロトコルの目的は、複数の細胞系統に分化する人間の血管周囲脂肪組織由来幹細胞の能力をテストすることです。分化は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨に区別するために知られている人間の骨髄由来間葉系幹細胞と比較しました。...

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。...

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。...

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。...

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。...

フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

本研究では、重力を利用して低接着条件下で細胞をスフェロイドに凝集させ、得られたスフェロイドをミニバイオリアクターで培養することにより、軟骨球性スフェロイドを作製する方法について述べています。...

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

学ぶ末梢血由来iPS細胞から軟骨細胞への分化プロトコル。無血清・無異種条件下で21日間の3Dペレット培養により、コラーゲンII型・X型発現や硫酸化グリコサミノグリカン産生を確認。患者特異的な軟骨再生医療への応用が期待される再現性の高い手法です。

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

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