マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

この方法の全体的な目標は、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを使用してマイクロRNAを選択し、導入することです。次に、マウスの骨格筋と運動ニューロンに送達し、疾患の表現型を改善する効果を評価します。この方法は、マイクロRNAベースのサイレンシング戦略を神経筋疾患の治療に採用できるかどうかという重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、アデノ随伴血清型9型ウイルスを使用して、マウスの脊髄と骨格筋に全身循環を通じてマイクロRNAを送達し、標的疾患遺伝子を直接サイレンシングすることです。AAV-microRNAプラスミドストックを、1ミリリットルあたり10〜100兆ゲノムのウイルス量を含む100〜200マイクロリットルのアリコートに分割します。次に、1つのアリコートを注射器に装填し、27〜30ゲージの針を取り付けます。

次に、標準のマウス拘束具を使用して、マウスの尻尾を露出させて固定します。その後、70%アルコールでテールを洗浄し、テールの下に温かいパッドを約30秒間置いて血管拡張を促進します。次に、尾の遠位部分で、斜角を上げて約15度の浅い角度で針を尾静脈に挿入します。

次に、ウイルスを注入し、数秒待ってから針を抜きます。針を抜いた後、2本の指で適度な圧力をかけて出血を止めます。その後、動物をホームケージに戻します。

尾静脈注射中に、針のハブに血の閃光が見られることは珍しくありません。注入中は、抵抗があってはなりません。尾が湯通しして腫れ始めたら、針を取り外して、前のエントリー位置の近位で再試行してください。

これらのテストでは、マウスは4週間以上経過している必要があり、治療前にベースライン測定値を必ず収集してください。試験室は静かで暗く、邪魔にならない必要があります。テストを行う少なくとも30分前にマウスを部屋に持ってきてください。

この順応期間中は動物を邪魔しないでください。吊り下げワイヤーテストから始めます。マウスの尻尾をつかみ、ワイヤーグリッドの中央に置きます。

次に、グリッドを15〜20インチ上げ、画面をゆっくりと反転させて、マウスがグリップを調整する時間を与えます。グリッドが完全に反転したら、タイマーを開始し、落下する時間を記録します。マウスがすぐに落ちる場合は、マウスを60秒間押し続けるのを待ってから、マウスをグリッドに戻し、手順を繰り返します。

マウスが 60 秒間ハングした場合は、スコアに 60 秒登録し、マウスをケージに戻します。各マウスを3回試行して60秒待ちます。それ以外の場合は、最長のハングタイムを記録します。

マウスを安楽死させた後、脊髄を採取し、次に大腿四頭筋の骨格筋を採取します。採取した組織をスナップフリーズするには、ステンレス製のボウルに2-メチルブタンを半分入れ、ボウルの底の四分の一を液体窒素に浸します。2 分待ってから続行します。

数分後、サンプルを2-メチルブタンに移します。サンプルが白くなったら、すぐにドライアイスに埋め込んだ容器に移します。後で、サンプルを摂氏80度で保存します。

生化学的分析およびマイクロRNA定量のために、採取した組織をクライオバイアルに入れ、液体窒素中で凍結します。その後、80°Cで保管します。SBMAマウスに、5週齢で100兆ゲノムのAAV microR-298を注射しました。

SBMAマウスは、ポリグルタミン管が異常に拡大したヒトアンドロゲン受容体導入遺伝子を保有しています。10週間までに、彼らは通常、神経筋疾患の兆候を発症します。腰椎と大腿四頭筋は、分析のために治療後のいくつかの時点で採取されました。

定量的RT-PCRにより、micro-R298の発現は骨格筋で8週間後にピークに達し、脊髄では12週間でピークに達することが示されました。注射の10週間後、GFPが両方の組織で検出されました。そして、運動ニューロンマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼと共局在するGFP発現。

追跡実験では、マウスに7週齢でウイルスまたはビヒクルを無作為に注射し、その後、毎週、最大40週齢まで体重を量り、行動分析を行いました。注射の10週間後、治療を受けたマウスは体重が増え始め、運動能力の改善を示し始めました。定量的リアルタイムPCRにより、この処理により患部組織のAR転写産物レベルが低下することが明らかになりました。

このビデオを見れば、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを使用してテールバインインジェクションでマイクロRNAを送達する方法を十分に理解できるはずです。また、マウスの下肢の萎縮と脱力感を改善するための送達されたマイクロRNAの効率を評価するのに役立つ行動アッセイをどのように実行するか。この技術の意味するところは、安全で効果的な遺伝子治療には、治療導入遺伝子の標的組織特異的な移植が必要であるため、遺伝子治療アプローチにまで及びます。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、SBMAのような毒性のある機能獲得メカニズムによって引き起こされる疾患が、疾患転写産物の3プライム修復を特異的に標的とする天然に存在するマイクロRNAの過剰発現によって恩恵を受けることに気付いたときでした。