Name: マウス腸管で胆汁の回腸誘起蓄積 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶマウス回腸切除術による胆汁酸の過剰蓄積と毒性評価法。腸管吻合技術を用いてクローン病や胆汁酸下痢の治療的示唆を得るための生理学的メカニズムを解明します。

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この研究はトム ・ ピーターソン財団によってサポートされ、NIH R01 HL119780 (ジャイナ教、MK) を付与します。

動物のプロトコルに見直された制度動物のケアと使用ケース ウェスタン リザーブ大学医学委員会によって承認し、国立衛生研究所 (NIH) 要項に則って行われたもの、実験動物の管理と使用 (第 8 版、2011)。マウスは、アメリカ獣医医学連合 (AVMA) ガイドラインに準拠した方法で動物の安楽死のため安楽死された (2013 年版)。C57bl/6 j、男性、8-16 週齢マウスは、このプロトコルで使用されました。マウスに 12 h ダーク/ライト サイクル環境で収容された。
 1。 術前準備 <ol><li>24 h 手順の前にきれいなケージに移動マウス。動物の水への無料アクセスを許可します。ソフト食 (ゲル栄養補助食品) の食事食品に置き換える手術のため小腸の内容を減らすために手術前に 4-6 h</li>。
	<li>はすべて手術器具を滅菌し、単回使用の滅菌手術材料を準備します。手術エリアと 70% のエタノールで麻酔の鼻の円錐形をきれいします</li>。
	<li>は、解剖顕微鏡、イソフルラン麻酔気化器、楽器、温度制御小動物外科テーブル温度維持を設定します。手術中に無料のアクセスのための場所に注射器、縫合糸、楽器を整理します</li>。
	<li>外科領域に十分なライトを提供する光源を設定します</li>。
	<li>腸管と腹壁のクリーニング用 5 mL 注射器で生理食塩水 0.9% を準備します</li>。
</ol> 2。回腸と吻合 <ol><li>小動物培養室におけるイソフルラン (2-3%) と麻酔マウス。動物はイソフルランのつま先のピンチ技術を使用して十分な anesthetization を確認します</li>。
	<li>は髪の除去の製品を適用することによって腹部の毛を取り除くし、離れて手術用スポンジを使用して麻酔を維持しながら髪を拭いてください。フェイス マスクを通してイソフルラン (1-2%) と 37 ° c. の維持麻酔に温度制御小さなテーブルの上動物手術 ( 図 1 A) 体温を維持するためにマウスを配置します。眼軟膏のマウスの目を治療します</li>。
	<li>ポビドン ヨード、70% アルコールを使用して肌をきれいにし、滅菌手術用ガーゼ ( 図 1 B) 腹部の外科領域をカバーします</li>。
	<li>は、正中線の腹部の切開手術のメスを使用して麻酔が有効を確認します。マウス腸およびプル腹部筋肉リトラクターを完全に開き、腹腔内 ( 図 1 C) を公開するを保護するために綿の先端アプリケータを使用します</li>。
	<li>は、盲腸を探します。慎重に腹腔内 ( 図 1 D) から接続されている回腸と空腸の一部を移動盲腸から始まっています 。
	注: 盲腸簡単に識別できるサイズが大きいため断食後でさえも</li>。
	<li>は、輸血の摘出は、回腸を閉塞し 7-0 シルク縫合糸で上腸間膜動脈の上方の分枝を結紮します。回腸の色はピンクから濃い紫色に結紮後変わります。( 図 1 E ~ F).</li>
	<li>、はさみを使用して実験の目的に応じて切除し、回腸の 90% または 50% を削除します 。
	注: 偽手術のため上腸間膜動脈結紮術を行わないため、回腸を削除しないでください</li>。
	<li>フラッシュ 0.9% 生理食塩水で、回腸の両端の内腔 。
	注: 残りの無傷の回腸はまだ正常な血液供給を受け取って、上腸間膜動脈から少量の血がフラッシュされますプロセス中に。これはまた回腸末端への血液供給は正常であり、により吻合術 ( 図 1 G) 中に、虚血はありませんを示します</li>。
	<li>は、回腸両端側に mesenteries を探します。Mesenteries を合わせ、8-0 縫合糸 ( 図 1 G ・ H) を使用して一緒に回腸の両端を縫合します</li>。
	<li>回腸と回腸を保つ側吻合 ( 図 1 私) 自然な方法で縫合します</li>。
	<li>徹底的に結合 2 つ回腸端に一緒に ( 図 1 J) 2 つ元縫合間上下を縫合します</li>。
	<li>は、3 ステップの縫合の手順を終えた後吻合からの漏れがないことを確認 ( 図 1 G-私)。盲腸、小腸を腹腔内に元の解剖学的位置に戻ります。鈍針を使って温かい 0.9% 生理食塩水で外科領域を洗ってください。( 図 1 K).</li>
	<li>は、6-0 縫合糸で腹部の筋層切開を閉じる。鉗子を使用して腹部の皮膚切開に合わせ、最適な創傷治癒 ( 図 1 L) を容易にする腹部の皮膚を縫合します</li>。
</ol> 3。術後ケア <ol><li>転送手術後の回復のための集中治療室にマウス。一晩後の手術の回復を続行する温度制御加熱パッドのペーパー ベッド ケージに収容します。規則的な食糧と水に加えて、柔らかい食べ物を持つマウスを指定します</li>。
	<li>管理ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) 皮下注射と鎮痛のすべて 8-12 h 。
	注: 場合は深刻な病気に、CO 2 でマウスを安楽死させる</li>。
	<li>、エンドポイントで必要に応じて過剰イソフルランと収穫のサンプルを用いたマウス (セクション 4) を犠牲にします</li>。
</ol> 4。回腸誘起胆汁蓄積の評価 <ol><li>の重量を量るし、解剖マウス回腸の 90% や 50% 0% (シャム) 切除後の 1 日</li>。
	<li>は、消化管を取り外して、それの重量を量る。体重比胆汁塩吸収不良および蓄積の重症度を評価するために GI の体重を計算します</li>。
	<li>は、15 mL の円錐管に消化管を転送し、はさみを使用して短いセグメントにそれらをカットします。切断した後、3,000 x g で 10 分間遠心はクリーン チューブに上清 (消化液胆汁酸塩を含む) を転送します</li>。
	<li>容量 GI 流体の重さを測定し、さらに消化管に胆汁の蓄積を評価するために消化管重量比に流体の重量を計算します</li>。
	<li>参照 8 に示す胆汁酸アッセイによって清総胆汁量を決定します</li>。
</ol>

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<li>Kuipers, F., Bloks, V. W., Groen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+intestinal+soap--bile+acids+in+metabolic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beyond intestinal soap--bile acids in metabolic control.</a> Nat Rev Endocrinol. 10, 488-498 (2014).</li>
<li>Buchman, A. L., Scolapio, J., Fryer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGA+technical+review+on+short+bowel+syndrome+and+intestinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">AGA technical review on short bowel syndrome and intestinal transplantation.</a> Gastroenterology. 124, 1111-1134 (2003).</li>
</ol>

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成功した回腸を実行するために、切除範囲のセグメントへの血液供給をブロックする前もっての上腸間膜動脈を結紮する必要があります。虚血性回腸結紮後濃い紫色になります。回腸のセグメントを完全に切除しする必要があります。正常な血液供給は、保持の目的のために確保されなければなりません。これは、簡単に縫合後虚血性壊死のための原因手術失敗できる出血と不適切な除去を避けるために不可欠です。吻合中の自然な解剖学的位置で回腸末端を一緒に参加することが重要です。腸間膜は、ツイスト終了の潜在的な発生を回避する最初の縫合に最も信頼性の高いランドマークと見なされます。回腸端の側の 2 番目の縫合後 2 つの端は彼らの自然な解剖学的構造に従って配置されます。腸吻合術後後吻合部の領域の色をチェックする必要があります。地域は通常、通常ピンク色を示します。手術後紫エリアなら、縫合帯に虚血が苦しんで可能性があります。これは虚血性セグメントの不完全な切除または縫合しながら 2 つの端のねじれが原因かもしれません。これらの条件の下で手術をしてすぐに解決します。
回腸手術の合併症は胆汁酸吸収不良による毒性、術後イレウスや縫合で...

現代の生物医学研究における遺伝子操作動物モデルは人間の病気についての洞察を収集に幅広く活用できます。特に、分子として誘導の生物学的効果を研究する組織や遺伝子の細胞固有の利得と損失関数を使用されています。ターゲット遺伝子体内操作の進歩にもかかわらず残留制限があります。最初、多くのセルまたはティッシュ特定の削除は複数の臓器に影響を与えます。たとえば、上皮の遺伝子欠失は複数組織の上皮細胞における発現を排除します。さらに、削除が特定の組織に制限されている場合でも空間制御はほとんど可能です。たとえば、腸のような組織で異なるセグメントを体内の精密操作ことはできません非常に特定の機能を運ぶ。これらの場合、遺伝子を含む組織の切除は、組織コミュニケーションの機構と機能的意義を決定するより効率的な勉強方法と見なされます。
回腸はクローンのほとんどで使用される患者、回腸遠位部1,2,3を含む炎症性疾患。回腸は通常生成いくつかのエネルギー貯蔵ホルモン様線維芽細胞成長因子 15/19 (19/FGF15)、ペプチド YY (PYY)、グルカゴン様ペプチド 1/2 (GLP1/2);これらのホルモンは、多くの生物学的機能4,5,6重要なローカルおよび内分泌の役割を果たします。これらのホルモンの中で、FGF15 は、堅牢な内分泌、肝臓での胆汁酸合成阻害剤として識別されています。回腸上皮細胞に再吸収、一度、胆汁酸は、核内受容体ファルネソイド X 受容体 (FXR) Fgf15式を刺激するためにその後肝胆汁酸合成7のフィードバック阻害につながるをアクティブにします。回腸クルッペル様因子 15 (KLF15) を研究するために最近の研究紹介マウス回腸モデル -Fgf15肝8で体内の胆汁酸の生産を調整する軸をシグナリングします。最も重要なことは、胆汁酸の生物学、新規ファミリー、クルッペルのような要因、特に KLF15 を導入しました。回腸手術を含む機能的な研究に基づいて、我々 はその KLF15 upregulates 胆汁酸合成間接非肝機構を決定しました。最後に、回腸 KLF15 はFgf15の最初の内因性否定的な調整装置としても識別されます。
遠位領域に近位から降順腸管、養分の吸収を担います。回腸は、胆汁酸とビタミン B12 (VB12) 吸収9の責任の主要なセグメントです。早い調査は短腸症候群を研究する近位腸切除マウス モデルを採用さまざまな切除の長さ、ダイエット、縫合糸の種類を最適な手術後生存率10を維持するために提案しました。さらより最近の検討では、回腸切除は通常残り管11の減少した適応能力のため他胃腸の (GI) セグメント切除よりもより深刻な病気の結果を示します。このトピックは、回復と有効な治療法の理解がまだ限られているに対し、基礎および臨床研究グループの集中的な興味を得ています。
胆汁酸下痢は腸肝循環12,13胆汁酸恒常性の不均衡に起因します。それは、回腸切除、消化器疾患や特発性胆汁酸吸収不良の結果の結果をすることができます。患者の 80% 以上は、回腸切除14を経て下痢を呈するに発見されています。回腸胆汁酸下痢の調査のための重要な手術モデルとなる可能性があります。本研究では、回腸切除シリーズは、FGF15 欠乏と同様、腸内の胆汁塩吸収不良、蓄積、および有毒な損害のグラデーションの評価を提供します。

<table><tbody><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ61</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>動物温度調節器</td><td>Physitemp Instruments, Inc.</td><td>TCAT-2LV</td><td>体温調節用</td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔気化器</td><td>VetEquip</td><td>&nbsp;911104</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツールズ株式会社</td><td>11274-20</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツールズ株式会社</td><td>14084-08</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>&nbsp;ロボズ手術器具株式会社</td><td>RS-7882</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロナイフ-針刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10318-14</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>6-0 モノフィラメント縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td>腹部の皮膚閉鎖用</td></tr><tr><td>7-0 シルク縫合</td>糸 <td>Ethicon</td><td>766G</td><td>結紮用</td></tr><tr><td>8-0 モノフィラメント縫合</td><td>Ethicon</td><td>1714G</td><td>吻合用</td></tr><tr><td>サージカルスポンジ</td><td>Dynarex Corp.</td><td>3333</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>小さな綿の先端のアプリケーター&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-400-118</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Healthcare Limited</td><td>66794-013-25</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン塩酸塩</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>12496-0757-1</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>用 0.9% 塩化ナトリウム 注射</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>0264-7800-10</td><td>洗浄・注射用</td></tr><tr><td>ポビドンヨウ素調製液</td><td>ダイナレックス(株)</td><td>1413</td><td>皮膚の準備</td></tr><tr><td>Puralube獣医軟膏</td><td>Dechra獣医製品</td><td>17033-211-38</td><td>目のふりのために</td></tr><tr><td>脱毛ローション</td><td>教会&ドワイト株式会社</td><td></td><td>皮膚の準備</td></tr><tr><td>用 集中治療室</td><td>ThermoCare</td><td>FW-1</td><td>術後の回復用</td></tr><tr><td>DietGel recovery</td><td>ClearH2O</td><td>72-06-5022</td><td>手術後の回復用</td></tr><tr><td>Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326830</td><td>For RNA isolation</td></tr><tr><td>iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td>For逆転写アッセイ</td></tr><tr><td>TaqMan fast advanced master mix</td><td>Applied Biosystems/Life Technologies</td><td>4444965</td><td>QPCR解析用</td></tr><tr><td>総胆汁酸アッセイキット</td><td>ジェンザイム診断</td><td>DZ042A-K01</td><td>胆汁酸アッセイ用</td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス腸管で胆汁の回腸誘起蓄積

Ileectomy-induced Bile Overaccumulation in Mouse Intestine

腸管切除は肥満などの疾患、炎症性腸疾患、クローン病、頻繁に下痢を含む胆汁酸, 重度の短腸症候群のような副作用で起因した大腸癌の一般的な治療法脱水、電解質異常、栄養素の吸収不良。回腸、組織コミュニケーションと全身の恒常性の維持を評価するためと呼ばれるマウス回腸切除モデルをご紹介します。回腸切除後循環血液は完全に回腸の内分泌ホルモンの線維芽細胞成長因子 15 (FGF15) その内分泌、肝臓での胆汁酸合成阻害を解放する欠けています。高められた生産と胆汁酸の回腸を削除した後の再廃止と組み合わせて、手術を受けたマウスは腸と関連する下痢、罹患率、死亡率で胆汁酸塩蓄積によって苦しみます。本研究で導入された手術モデルの新しい使用法は生理学および病気の全身の代謝調節の回腸のコントロールに機械論的で機能的な洞察力を提供するかもしれません。

回腸の手順は図 1のとおりです。最初のステップでは、マウスの腹部の皮膚を準備して、腹部の切開・ リトラクターを使用して (図 1A ~ C) 腸を完全に公開するも含まれています。次に、マウスの盲腸に位置していた (図 1D)。考えるとそのサイズと形状は、わかりやすいランドマークです。盲腸、回腸遠位空腸の一部が露出、腹部キャビティ (図 1D) から削除します。回腸切除範囲が決定され、セグメントに血液を供給上腸間膜動脈を結紮し、回腸のセグメントの色が急速に腸の残り中濃い紫色 (図 1E ~ F) に変更通常ピンク色を維持します。全体の虚血性回腸は...

小腸依存した胆汁酸再吸収と肝の胆汁酸合成のフィードバック阻害全身の恒常性と健康のために重要です。本研究では回腸誘起胆汁吸収不良、蓄積、およびマウス腸管における毒性評価する回腸切除マウス モデルをについて説明します。

Intestinal resection is a common therapeutic approach for human diseases such as obesity, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and colon cancer ...

この手術の全体的な目的は、マウスの腸管における回腸切除によって誘発される胆汁吸収不全、過剰蓄積および毒性を評価することです。クローン病、癌、自己免疫疾患、または感染症として現れる回腸の疾患は、罹患率および死亡率の重要な要因となっています。回腸の一部を切除するこのモデルの開発は、生物学的な知見のみならず、治療法の解明にも活用できると考えています。この手法の意義は、回腸切除が肝臓による胆汁酸の過剰産生や、腸管による吸収不良および過剰蓄積を誘発する可能性があるため、胆汁酸性下痢の治療へと展開されます。一般的に、この手法に不慣れな者は、本手術において最も重要かつ困難な工程である腸管吻合に苦心します。まずは、足指へのピンチ刺激で適切な鎮静レベルにあることを確認し、マウスの腹部に除毛クリームを塗布することから始めてください。サージカルスポンジで除毛し、37°Cに設定した温度制御機能付き小動物用手術台に動物を配置します。動物の眼に軟膏を塗布し、ポビドンヨードと70% ethanolで順次スクラブし、露出した皮膚を消毒します。腹部の手術部位を滅菌サージカルガーゼで覆い、メスを用いて腹部正中に切開を加え、筋肉層を切断します。綿棒を用いて腸管を保護しながら、リトラクターでマウスの腹筋を十分に広げて腹腔を露出させます。盲腸から始めて、接続している回腸および空腸の一部を慎重に腹腔外へ移動させ、7-0シルク縫合糸を用いて上腸間膜動脈の上枝を結紮します。組織の色がピンク色から暗色に変化し、完全な閉塞が示されたら、実験条件に応じて回腸の50%または90%をハサミで切除します。両側の回腸末端の内腔を0.9%生理食塩水で洗浄します。両回腸末端の腸間膜の位置を確認し、切除組織の両端で腸間膜を合わせ、8-0縫合糸を用いて端同士を結合させます。回腸を自然な形態で吻合させるため、回腸の対側を縫合し、さらに2つの元の縫合線の間の上下側を縫合して、2つの回腸末端を完全に結合させます。吻合部からの漏れがないことを確認した後、盲腸と小腸を元の解剖学的位置に戻し、鈍針を用いて手術部位を温かい0.9%生理食塩水で洗浄します。6-0縫合糸を用いて腹筋層を閉鎖し、腹部の皮膚切開部を合わせて皮膚を閉鎖し、最適な創傷治癒を促進します。その後、マウスをペーパーベッディングを敷いたケージに入れ、温度制御されたヒーティングパッドを備えた集中治療室へ移し、通常の餌と水に加えて柔らかい餌を与えて一晩回復させます。手術の1日後、動物全体の体重を測定します。次に、胃腸（GI）管を採取し、腸組織の重量を測定します。GI組織を15 mLコニカルチューブに移し、ハサミを用いて組織を短いセグメントに切断します。次に、遠心分離により組織片をペレット化し、胆汁酸を含む上清を新しいチューブに移します。定量リアルタイムPCR分析により、回腸内ではfibroblast growth factor 15、apical sodium-bile acid transporter、ileal bile acid-binding protein、およびorganic solute transporter beta mRNAが豊富に発現していることが明らかになり、空腸およびその他の腸管内では発現が少ないか、極めて低いことが示されました。陰性対照として測定したAdenomatous polyposis coli mRNAレベルは、腸管全体を通じて同等に維持されています。24時間後、偽手術群の腸管は正常であり、非手術動物と比較して同様のサイズと形態を示しています。液体量は0%から90%の回腸切除にかけて段階的に増加しており、これは90%切除後に観察された消化管重量対体重比の有意な増加と一致しています。術後の消化管から回収された消化管液および消化管液重量対消化管重量比においても、切除後の段階的な増加が認められます。さらに、胆汁酸アッセイにより、回腸切除範囲が大きくなるにつれて上清中に検出される胆汁酸量が増加することが確認され、50%回腸切除は、副作用が比較的緩やかであるため、より適切なマウス回腸切除モデルであることが示唆されました。習熟すれば、適切に実施することでこの手技は30分で完了できます。本手技の開発により、マイクロサージャリー分野の研究者が小動物における回腸の生物学や胆汁酸シンドロームを探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、回腸セグメントを適切に同定および切除する方法と、腸管吻合術を適切に行う方法について深く理解できるはずです。

ileectomy-induced-bile-overaccumulation-in-mouse-intestine

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Medicine

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マウス腸管で胆汁の回腸誘起蓄積

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